重组弓形虫棒状体蛋白5诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用

为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应,本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5,并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用。采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段,将该基因片段克隆至pET-28a原核表达载体表达,用重组ROP5蛋白免疫BALB／c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠抗体和细胞因子的变化。以强毒型RH株弓形虫攻击感染免疫小鼠,统计小鼠不同时间存活率,评价重组蛋白产生的免疫保护性。结果表明ROP5重组蛋白疫苗免疫BALB／c小鼠诱导机体产生高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体和IFN—y、IL-2及IL-10细胞因子。与PBS及佐剂对照组相比,重组蛋白免疫组小鼠的存活时间明显延长。本实验证实了ROP5重组蛋白免疫BALB／c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,以及一定的抗弓形虫感染保护作用。     

抗人CD38单克隆抗体抗原识别表位的初步研究

目的:确定抗人CD38分子单克隆抗体(mAb)1C6识别的抗原表位所在区域。方法:分别构建缺失人CD38不同表位的重组质粒,用IPTG诱导表达融合蛋白。对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Westernblot分析。结果:1C6不能识别缺失第220～241位氨基酸的D4片段,而对其他的缺失突变体均可识别。结论:mAb1C6抗体识别的抗原表位位于CD38分子胞外段第220～241位氨基酸。     

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础     

TLR4在HSP70_(EC-TCV)冲激的DC成熟过程中的作用

观察TLR4在Hca-F榄香烯复合瘤苗来源的HSP70(HSP70EC-TCV)冲激处理的小鼠骨髓来源的DC成熟过程中的作用。用rmGM-CSF和rmIL-4诱导小鼠骨髓来源的DC,以HSP70EC-TCV或加入抗TLR4抗体30 min后再用HSP70EC-TCV冲激处理DC,流式细胞仪检测DC的CD40和CD86表达,ELISA法检测DC上清中IL-12和T细胞上清中IL-2浓度,MTT法检测T细胞对Hca-F细胞的杀伤率。结果表明,抗TLR4抗体对DC的CD40和CD86表达无明显影响,但对HSP70EC-TCV诱导DC分泌IL-12和进而致敏的T细胞分泌IL-2及产生杀瘤功能有明显的抑制作用。TLR4信号通路参与HSP70EC-TCV诱导DC成熟过程。     

弓形虫GRA7基因的克隆表达及免疫分析

本文构建了刚地弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)基因原核表达重组质粒,进行蛋白表达并分析重组蛋白的免疫反应性.设计合成引物,从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出GRA7基因片段并进行序列分析.目的片段用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后分别构建重组质粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7,而后转入大肠埃希菌BL21 (DE3)中诱导表达,Western blotting分析表达蛋白.结果显示,从弓形虫RH株中成功扩增出大小约710 bp的GRA7基因片段,构建的重组质粒经双酶切和PCR鉴定及测序,目的基因片段与预期相符.重组质粒pET32a-GRA7经IPTG诱导后,可高效表达重组蛋白,Western blotting分析显示重组GRA7蛋白能被弓形虫慢性感染血清识别,而重组质粒pET28a-GRA7未能诱导表达出目的蛋白.原核表达的重组GRA7抗原具有特异的免疫反应性,为弓形虫的诊断应用和疫苗研究奠定了基础.     

兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用

目的制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况。方法以成年小鼠睾丸组织c DNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,最终将PCR产物插入p ET-30a载体,构建p ET-30a-Tex33原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌E. coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性。结果成功构建了p ET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白。ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部。结论成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达。     

兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用北大核心CSCD

目的制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况。方法以成年小鼠睾丸组织c DNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,最终将PCR产物插入p ET-30a载体,构建p ET-30a-Tex33原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌E. coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性。结果成功构建了p ET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白。ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部。结论成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达。     

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外估基因。方法 采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中，扩增CD38全长cDNA，并将其插入pGEM-T载体中。重新设计引物，从重组pGEMT载体中，扩增CD38抗体分子的胞外段基因，再亚克隆到表达载体pET28a( )，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明，克隆的CD38外段基因的序列与文献^[1,2]的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET28a( ) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物，对进一步制备单克隆抗体，研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节

目的: 建立检测小鼠Toll样受体4(TLR4)mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; 观察小鼠骨髓源树突状细胞(DC)发育成熟过程中TLR4 mRNA表达水平的动态变化以及地塞米松(DEX)对DC TLR4 mRNA表达的影响.方法: (1)用细胞因子定向诱导的方法将小鼠骨髓细胞培养为DC; (2)构建pUCm-T/TLR4和pUCm-T/β-actin重组质粒, 建立检测小鼠TLR4 mRNA水平的实时定量PCR实验; (3)用实时定量PCR技术对体外培养4、 6、 8、 10、 12 d的DC TLR4 mRNA表达水平进行动态观察; (4)在DC培养体系中加入DEX, 与常规培养DC TLR4 mRNA表达水平进行比较.结果: (1)从小鼠骨髓细胞中成功诱导培养了DC, 经免疫磁珠纯化后其纯度可达90%以上; (2)建立了能精确分析小鼠TLR4 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; (3)在DC培养前期TLR4 mRNA表达水平变化不大, 后期则明显升高; (4)DEX可使DC TLR4 mRNA表达增强.结论: 小鼠骨髓源DC TLR4 mRNA表达水平与其发育成熟阶段密切相关; DEX促进DC TLR4 mRNA表达.     

弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株（HT株）ROP5蛋白基因。方法运用RT—PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因，将其克隆人T载体中进行测序和分析．并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp，编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，有12个核苷酸有差异，导致7个氨基酸发生改变，两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．9％。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG的诱导下，可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白，并且能与弓形虫抗体发生血清学反应，表达量占菌体蛋白的15．6％。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

TLR4胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及鉴定

目的：构建谷胱甘肽转硫酶-TLR4融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法：利用PCR从含TLR4全长cDNA序列的质粒中扩增其胞外段，约1800bp，然后将其克隆入pMD18-T载体中。测序确证后重组入谷胱甘肽转硫酶融合表达载体pGEX-4T-1中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果：PCR扩增的TLR4胞外区基因序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒经酶切鉴定及测序证实，TLR4基因已正确插入到pGEX-4T-1中。重组表达质粒转化感受态大肠杆菌HBl01后用IPTG诱导，获得Mr92 000的GST-TLR4融合蛋白；37℃，O.2mmol／L IPTG诱导4h，SDS-PAGE电泳后，经薄层凝胶扫描分析该融合蛋白占菌体蛋白总量34．25％，部分以包涵体存在，可溶性蛋白约占27．84％；亲和层析纯化后纯度大于90％。Western-blot证实GST-TLR4融合蛋白能与TLR4单抗特异性结合。结论：成功地构建融合蛋白表达载体pGEX-TLR4，并在大肠杆菌中获得有效表达，获得了纯度大于90％的可溶性GSI-TLR4融合蛋白，为进一步研究其功能及制备TLR4单克隆抗体奠定了基础。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

福氏志贺菌5a型M90T株GAPDH蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备高效的福氏志贺菌5a M90T3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的多克隆抗体,并对其特异性进行评价。方法提取M90T的全基因组,采用PCR法扩增M90T中的基因gapA克隆到原核表达载体pET-24中,重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,条件优化后纯化GAPDH-His融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体。Western blot法、ELISA鉴定获得的抗血清。结果成功构建了原核表达载体pET24a-gapA,通过一系列诱导条件的优化,确定可溶性条件为30℃、1 mmol/L IPTG诱导2 h。用纯化的融合蛋白GAPDH-His作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blot法、ELISA证明多克隆抗体制备成功。结论成功制备了福氏志贺菌5a M90T特异性的小鼠多克隆抗体。     

人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定北大核心CSCD

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

人八聚体结合蛋白4(Oct4)cDNA的克隆及其在大肠杆菌和HEK293T细胞的表达

目的克隆人八聚体结合蛋白4(Oct4)c DNA,研究其在原核及真核系统中的表达。方法提取人宫颈癌He La细胞中的总RNA,经反转录PCR获得c DNA,PCR扩增Oct4 c DNA并将其分别克隆入表达载体p ET-22b(+)原核质粒和pc DNATM3.1(+)真核质粒,构建含该序列的重组原核表达载体p ET-22b(+)-Oct4和真核表达载体pc DNA3.1(+)-his-Oct4。然后分别进行双酶切和测序鉴定。前者在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至HEK293T细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测细菌和细胞中OCT4蛋白的表达水平。结果 PCR扩增得到约1100 bp目的 DNA片段;重组表达质粒p ET-22b(+)-Oct4和pc DNA3.1(+)-his-Oct4经双酶切鉴定和测序分析证明载体构建成功;p ET-22b(+)-Oct4经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主E.coli BL21(DE3)中高效表达OCT4融合蛋白,相对分子质量(Mr)约38 000,与其理论Mr基本相符;pc DNA3.1(+)-his-Oct4转染HEK293T细胞经Western blot法检测,证实导入的Oct4成功表达。结论在大肠杆菌和HEK293T细胞成功表达OCT4蛋白。     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN(1～4)的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN(tudor staphylococcal nuelease)蛋白SN(1～4)基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与(;"蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN(1～4)重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN(1-4)质粒成功构建和表达.     

弓形虫ROP1基因的体外扩增及克隆

弓形虫棒状体蛋白（ROP1）存在于速殖子棒状体内。根其已知基因序列设计合成一对引物，用PCR技术从弓形虫RH及ZS2株的基因组DNA中扩增出编码ROP1的基因片段，将扩增产物与pBV220原核高效表达质粒重组，构建成功pBV200-RCP1重组子，转化大肠杆菌TG1，DHSα，以进一步诱导表达RCP1非融合蛋白，用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究。     

人Shisa样蛋白1(SHISAL1)抗原表位区预测及其小鼠多克隆抗体的制备

目的 优化人Shisa样蛋白1(SHISAL1)抗原后制备小鼠抗多克隆抗体，并鉴定抗体特异性。方法 利用生物信息学方法预测SHISAL1蛋白的抗原表位区，选取SHISAL1蛋白第28～97位氨基酸残基组成的多肽作为抗原，并命名为(SHISAL1-N);利用分子克隆技术，将其编码序列克隆后插入pET-28a载体中构建重组质粒pET28a-SHISAL1-N。然后将pET28a-SHISAL1-N和已构建的pET28a-SHISAL1全长重组质粒转化BL21(DE3),用异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。两种蛋白纯化后分别免疫雌性昆明小鼠，Western blot法、免疫沉淀及免疫荧光细胞化学染色法观察两种抗体的特异性与灵敏性。结果成功构建pET28a-SHISAL1-N重组质粒，诱导两种融合蛋白表达，获得两种类型的SHISAL1小鼠多克隆抗体。Western blot结果表明以SHISAL1为免疫原所制备的抗体特异性和灵敏性较差，而以SHISAL1-N免疫原所制备的抗体能特异性识别不同的细胞内源性的SHISAL1蛋白；免疫沉淀结果表明SHISAL1-N抗体可以结合肝...     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。