两株抗幽门螺杆菌特异性卵黄抗体的制备及性能

目的分别制备抗幽门螺杆菌(H.pylori)全菌(SS1株)和尿素酶I和尿素酶B的重组蛋白(r IB)的特异性卵黄抗体(Ig Y),纯化后研究其体外抑菌效果。方法分别以超声破碎SS1菌液和r IB为抗原免疫来杭鸡,用水稀释法和硫酸铵沉淀法纯化获得相应特异性Ig Y(SS1-Ig Y、IB-Ig Y)。将特异性Ig Y与SS1混合作用后共培养检测其抑菌效果,快速脲酶试验检测其抗尿素酶作用。结果成功制备2种特异性Ig Y:SS1-Ig Y和IB-Ig Y,效价超过1∶12 800,纯度超过80%。SS1-Ig Y和IB-Ig Y均有体外抗尿素酶活性和抑菌作用。结论 SS1-Ig Y和IB-Ig Y均具有在体外抑制H.pylori尿素酶活性和抑制H.pylori生长的作用。     

抗幽门螺杆菌黏附素A卵黄抗体的制备及评估

目的制备及评估一种以幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)为靶点的特异性卵黄抗体。方法脲酶阳性胃黏膜样本采自富顺县人民医院,微需氧条件下分离培养幽门螺杆菌;PCR扩增HpaA片段,原核表达形式获得HpaA重组蛋白并以Western blot检测其抗原性;与弗氏佐剂充分乳化后免疫产蛋鸡,水稀释-盐析法纯化卵黄抗体;SDS-PAGE、ELISA及Dot blot分析其生物学特性并评估对分离株体外生长的抑制效果。结果分离株脲酶、氧化酶、触酶反应阳性;HpaA片段长702 bp,重组HpaA蛋白相对分子质量约为45 000,可溶形式表达且具有良好的抗原性;以其制备的IgY-HpaA滴度高达1∶150 000,1∶1 000稀释后仍能良好地识别分离株,5 mg/ml剂量可显著抑制分离株的生长。结论以HpaA为靶点制备的卵黄抗体在体外可特异性识别并抑制幽门螺杆菌的生长。     

抗肠道病毒71型特异性卵黄抗体的制备及鉴定

目的:制备特异性抗肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的卵黄抗体并检测其生物学性能,这对EV71感染手足口病的预防和治疗具有重大的意义。方法:用纯化并灭活后EV71作为抗原免疫健康产蛋鸡。采用本实验室水提综合聚乙二醇法提取纯化鸡卵黄抗体;用Bradford法测定卵黄抗体提取液的蛋白含量;还原性SDS-PAGE凝胶电泳分析测定提取蛋白的纯度及相对分子质量;分别用ELISA、双向免疫琼脂扩散检测纯化特异性卵黄抗体抗EV71效价;Western blot分析特异性卵黄抗体的免疫反应性。结果:卵黄中卵黄抗体含量达7.76 mg/ml,卵黄抗体的纯度为94.86%。初免10天后蛋黄中可检测到特异性抗EV71卵黄抗体,初免40天后ELISA检测抗体效价高达1∶20 480,双向琼脂扩散检测效价达1∶16。提取的卵黄抗体具有良好的免疫反应性,能与EV71特异性结合。结论:水提综合聚乙二醇法提取纯化得到的抗EV71卵黄抗体产量和纯度高、效价好且具有良好的免疫反应性。     

生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备与鉴定

目的在成功制备中和性生长抑素(SS)单克隆抗体的基础上,制备了SS抗独特型卵黄抗体Ab2,鉴定其生物学特性,探讨其在促进动物生长方面的应用。方法用对SS具有免疫中和性的单克隆抗体2E7免疫产蛋鸡,筛选并收集有高效价抗独特型卵黄抗体的鸡蛋,分离蛋黄,破碎蛋黄组织,用稀释和酸化沉淀法除脂蛋白,用冷酒精沉淀法纯化抗独特型卵黄抗体Ab2。用间接ELISA检测卵黄Ab2的特异性、效价和浓度,用竞争抑制和动物免疫检测卵黄Ab2β,用动物实验检测卵黄Ab2β促进鸡生长的效力。结果该SS抗独特型卵黄抗体Ab2效价为10~(-5),含量为8 mg/mL。且与兔抗SS抗体发生免疫反应,不与兔抗生长激素抗体、兔抗胰岛素抗体、兔抗胃泌素抗体发生免疫反应。该SS卵黄Ab2能和异种动物兔产生的SS抗体发生免疫反应,该免疫反应能被SS竞争抑制,该SS卵黄Ab2能诱导小鼠产生SS Ab3,该SS Ab3能和SS发生免疫反应,说明它是SS卵黄Ab2β。用其作疫苗,以0.8μg/只和3.2μg/只分别皮下注射免疫小鼠,以0.8μg/羽和3.2μg/羽分别肌肉注射免疫鸡,以3.2μg/尾浸泡免疫多宝鱼。一个月后,实验小鼠平均体质量比对照组分别增加33.5%和37.9%,实验鸡平均体质量比对照组分别增加25.6%和34.1%,实验鱼平均体质量比对照组增加24.8%。结论成功制备了特异性强、效价高的SS卵黄抗体Ab2β,以其作疫苗免疫动物,以较小剂量一次性免疫即可产生显著的促鸡和多宝鱼生长效果。     

幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的：制备幽门螺杆菌（Hp）尿素酶B（ureB）单克隆抗体并鉴定。 方法： 以Hp重组纯化蛋白ureB为抗原，运用杂交瘤技术制备ureB单克隆抗体，用间接ELISA法检测抗体免疫学活性，用双抗夹心的IRMA法检测不同单抗是否识别相同的表位，并用于检测Hp感染。 结果： 获得两株识别不同表位的ureB单抗杂交瘤细胞，可测得Hp 感染的相关抗原。 结论： 抗ureB单抗可特异性与Hp结合，可用于建立幽门螺杆菌现症感染的检测方法。     

沙鼠IgG兔抗血清的制备及其在IgG抗体检测中的应用

目的用纯化的蒙古沙鼠血清IgG制备相应兔抗血清,并用于幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）疫苗免疫后沙鼠血清中抗原特异性IgG的检测。方法采用饱和硫酸铵沉淀法和Q sepharose high performance阴离子交换层析法纯化蒙古沙鼠血清IgG,免疫日本大白耳兔制备兔抗沙鼠IgG抗血清并进行rProtein A亲和纯化,建立间接ELISA方法用于检测Hp疫苗注射免疫蒙古沙鼠后血清抗原特异性IgG水平。结果以纯化的蒙古沙鼠血清IgG（纯度大于98％）免疫日本大白耳兔获得相应兔抗血清,经亲和层析后其纯度大于90％,回收率约为85％,双扩效价为1：16,ELISA效价为1：320000;ELISA检测结果显示Hp疫苗注射免疫蒙古沙鼠于第2次免疫后产生高水平IgG,第4次免疫后第7天IgG水平达到高峰,随后几周仍然保持高水平。结论所制备的兔抗沙鼠IgG抗体可以用于蒙古沙鼠血清中抗原特异性IgG的检测。     

卵黄抗幽门螺杆菌抗体的制备及特性研究

幽门螺杆菌 (H .pylori,Hp)与慢性胃炎、消化性溃疡和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤有密切关系。采用抗生素三联或四联疗法治疗Hp感染 ,但Hp易耐药。用特异性抗体防治传染病是经典的方法 ,抗HpIgG是防治Hp感染的途径 ,因此 ,我们采用鸡卵黄免疫球蛋白G抗体 (又称IgY)防治Hp。IgY是母鸡血中的IgG选择性地转移到卵黄中 ,是卵黄中惟一的免疫球蛋白类 ,具有与血清IgG一样的抗体活性。这提示 ,可以从免疫母鸡的蛋中获得大量特异性抗体。用 2 5株Hp菌株的培养液作为免疫材料 ,其中NCTC116 37、NCTC116 39、SS1三株由中国预防科学院流行病…     

抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体制备和鉴定及其应用

目的制备抗幽门螺杆菌(Hp)的单克隆抗体(mAb),并对该Hp mAb进行分析鉴定,建立一种检测患者由于Hp感染而在血清中产生Hp抗体的竞争ELISA检测方法。方法用灭活的Hp免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备Hp mAb。我们采用Hp混合蛋白包括毒素相关蛋白A(CagA)、空泡毒素A(VacA)和尿素酶以及灭活的Hp菌体筛选阳性杂交瘤细胞株,用ELISA和Western blot等技术对所获得的Hp mAb进行鉴定。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记所筛选的Hp mAb来建立一个可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。结果通过大规模的杂交瘤筛选,我们选择了1株将其命名为C3 Hp mAb,其抗体亚型为IgG2a,腹水效价可达1×107。Western blot法、ELISA和质谱检测结果显示,该C3 Hp mAb能特异地识别Hp的尿素酶B亚单位。用这个C3 Hp mAb,我们建立了一种可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。结论成功获得一种可以特异识别Hp尿素酶B亚单位的mAb,建立了一种可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。     

Balb/c小鼠口服幽门螺杆菌疫苗rLTB-HspA的免疫应答

目的　研究幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A (rHspA)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)融合蛋白 (rLTB HspA)作为口服疫苗的免疫应答效果。方法　采用rLTB HspA口服免疫Balb c小鼠 ,ELISA分析小鼠血清、胃肠黏液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL 4、IFN γ的变化。结果　Balb c小鼠口服rLTB HspA能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。结论　Balb crLTB HspA可作为预防和治疗Hp感染的候选疫苗之一     

抗人蔗糖酶卵黄抗体的制备及其稳定性和体外活性研究

目的:制备抗人蔗糖酶(Sucrase,SUC)卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin Y,IgY)并对其稳定性、体外活性进行研究。方法:采用人SUC 蛋白为抗原,免疫海兰灰蛋鸡,水稀释和盐析法提取纯化IgY;间接ELISA 法监测抗体效价变化并评价其稳定性;SDS-PAGE 和Western blot 分析IgY 的纯度和特异性;PNPG 法测IgY 对琢鄄葡萄糖苷酶的体外抑制效果。结果:初次免疫10 d 后检测到IgY,40 d 后效价最高达到1 12 800;提取的IgY 重链和轻链分别在65 kD 和25 kD 处,且能够与抗原蛋白特异性结合;29 ~69益范围内水浴15 min 和pH 4 ~7 之间37益水浴4 h,抗体效价无变化;胰蛋白酶与胃蛋白酶作用IgY2 h,抗体效价降至一半,延长作用时间,IgY 对胃蛋白酶耐受力较胰蛋白酶耐受力更强;IgY 对琢鄄葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用,呈现剂量相关性,半抑制浓度(IC50)值为0郾540 mg/ ml。结论:抗人蔗糖酶卵黄抗体(S-IgY)的成功制备为后续用于2型糖尿病大鼠模型体内实验研究奠定基础。     

幽门螺杆菌免疫兔血清抗体特异性分析

对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)抗原、抗体的研究是Hp分型、检测及疫苗开发的基础.Hp免疫血清的制备已成为常规技术,但血清制备过程中的各种因素均可能影响免疫血清的抗体谱,从而引起同类研究间因所用Hp抗体不同导致的结果的差异.本研究对Hp全菌免疫的兔血清抗体谱加以分析,讨论坳免疫血清制备中存在的一些问题和应对方法.     

抗重组幽门螺杆菌VacA单克隆抗体的制备

目的 制备抗重组幽门螺杆菌致细胞空泡毒素抗原(VacA)的单克隆抗体(mAb).方法 用基因工程菌pQr30-v-DH5α大最表达重组蛋白VaeA,经Ni2+-NTA树脂纯化后,Western blot鉴定抗原性,免疫家兔后ELISA法检测血清VacA抗体鉴定其免疫原性.用重组vacA免疫Balb/c小鼠.取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/O细胞融合,HAT选择性培养和间接EIJSA进行筛选,并检测所分泌抗体的效价和分析Ig类别.结果 获得4株能稳定分泌VacA mAb的杂交瘤细胞,能分泌IgG2b、lgM和IgG1 3类抗体,轻链均为k型.其中,IgG1 mAb经Western blot鉴定能与重组VacA发牛特异性反应.结论 应用纯化的重组VacA,成功获得了能稳定分泌幽门螺杆菌VacA单克隆抗体的杂交瘤细胞,并制备了单克隆抗体.为进一步研制检测VacA的试剂盒及探讨VacA的致病机制奠定了基础.     

针对不同抗原决定簇的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体间存在交叉反应独特型

用鼠抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体(18A1)免疫家兔,取抗血清流穿以正常鼠Ig与无关单抗(MIg-Lp-Sepharose 4B)制备的亲和层析柱,吸除抗同种型及同种异型抗体。经ELISA竞争抑制、中和抑制试验证明制备出了抗TG独特型抗体(TG-Ab2)。用此TG-Ab2包被固相载体,建立了两种竞争ELISA法检测针对不同抗原决定簇的抗TG单抗之间的CRI。实验结果显示,抗TG单抗间存在CRI,从而提示自身抗体的产生可能是受胚系基因所控制。     

口服幽门螺杆菌疫苗后小鼠粘膜免疫应答研究

为观测幽门螺杆菌 (Hp )全菌抗原和粘膜佐剂LT口服免疫Balb/c小鼠后的粘膜免疫应答 ,采用ELISPOT和ELISA法分析免疫小鼠胃粘膜、派伊尔小结 (PP )抗原特异性抗体分泌细胞和小肠粘液唾液sIgA抗体。结果表明抗原免疫组、抗原 +佐剂组胃粘膜、PP抗原特异性sIgA ASC、IgG ASC数量明显增加 ,尤以sIgA ASC为甚 ,并且抗原 +佐剂组明显高于单纯抗原组和对照组 ;小肠粘液唾液特异sIgA水平两免疫组均明显高于对照组 ,提示口服免疫可有效诱导粘膜免疫应答 ,局部特异sIgA在抗Hp感染中具有重要作用     

抗日本血吸虫SEA特异性IgY应用于循环抗原检测的研究

本研究应用抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)建立敏感、特异的检测循环抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验( ELISA).用SEA皮下多点注射法免疫海蓝鸡,水稀释法制备IgY抗体,以辣根过氧化物酶标记纯化的IgY抗体(IgY-E)和兔抗IgG抗体(IgG-E)分别作为检测抗体,IgY抗体和兔抗...     

以DNA免疫和细胞抗原加强制备抗DAF单克隆抗体及特性分析

目的:联合应用DNA免疫和细胞抗原加强制备抗DAF单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:利用分子克隆的方法构建重组质粒pcDNA3.1/DAF。以其免疫BALB/c小鼠股四头肌3次,并在融合前用表达DAF分子的HPB-ALL细胞为抗原加强免疫1次,制备抗DAFmAb。以ELISA法测定mAb的Ig亚类。采用流式细胞术和Westernblot鉴定mAb的特异性和结合活性。以非免疫竞争法测定mAb的亲和常数。结果:成功地获得2株可识别DAF分子不同抗原表位的mAbB6E和2B6B,其Ig亚类均为IgG2a。mAb2B6E的亲和常数为1.81×10-7mol/L,与天然的细胞膜蛋白、变性的膜蛋白以及重组DAF蛋白都有良好的结合活性和特异性。结论:先以pcDNA3.1/DAF肌肉内免疫,再应用细胞抗原加强免疫的方法制备特异性的mAb,为在无法获得纯化蛋白质的情况下开拓了研制特异性抗体的新途径,也为日后改造抗DAFmAb进行靶向治疗研究打下了基础。     

幽门螺杆菌cagA蛋白的制备级复性和纯化

目的通过优化复性液的组成、pH值、稀释度等,建立幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(cytotoxin associated gene A,cagA)表达产物的制备级复性及纯化方法。方法以包涵体形式存在的cagA表达产物先用5mL/LTritonX-100进行初步纯化,使其纯度达到约90%;再用含8mol/L脲的变性剂溶解包涵体,用复性液[0.1mol/LTris-HCl、2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、8mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)及50mmol/L精氨酸(Arg),pH8.0]稀释复性后,用DEAE-HP阴离子交换色谱进行纯化。结果用稀释法复性及液相色谱法纯化,一次可得到100~140mg的cagA。ELISA检测其抗原活性为1∶16000;SDS-PAGE检测纯度为98%。结论用制备级复性、纯化制备的cagA,可作为抗原用于制备检测抗幽门螺杆菌抗体的检测芯片,效果良好,并已获得国家新药批文。     

UreA/KatA双价减毒沙门菌疫苗株抗幽门螺杆菌的免疫保护作用

目的探讨由2种幽门螺杆菌(Hp)抗原组合的双价疫苗在防治Hp感染中的作用以及减毒鼠伤寒沙门菌作为传递Hp抗原的活疫苗载体的可行性.方法PCR技术扩增尿素酶A亚单位(ureA)和过氧化氢酶(katA)基因片段,构建表达UreA/KatA融合蛋白的重组质粒,重组质粒宿主菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Westernblot分析UreA/KatA的表达情况.将该重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261株中构建重组口服活疫苗株,经口服免疫C57BL/6小鼠,再用Hp悉尼株进行攻击,用快速尿素酶试验和细菌定量培养对胃粘膜中Hp的定植及生长情况进行观察.结果SDS-PAGE电泳图上显示1条相对分子质量(Mr)约108×103的新生蛋白带,占细菌总蛋白的5%,并能与抗GST抗体发生特异性反应.动物实验结果显示,经UreA/KatA双价疫苗免疫的小鼠能有效防御Hp的感染.结论表达UreA/KatA融合蛋白的双价减毒沙门菌疫苗株能诱导抗Hp保护性免疫反应,有望在Hp感染及其相关性疾病的防治中发挥积极作用.     

幽门螺杆菌感染后引起IgA肾病的作用及机制研究近况

Ig A肾病(Ig AN)是指肾小球系膜区以Ig A或Ig A沉积为主的原发性肾小球疾病,因其在临床治疗中频繁出现而引起世界范围内的广泛研究。尽管Ig A肾病的具体发病机制尚未明确,但越来越多的临床案例表明幽门螺杆菌(Hp)感染对Ig A肾病的产生及发展有重要影响,可能是Ig A肾病的潜在诱因之一。本论文基于国内外的研究进展,在已有的研究基础上进一步综述了幽门螺杆菌感染对Ig A肾病发生、发展的影响及其潜在作用机制。     

带有HBsAg表位内影像的单克隆抗独特型抗体的建立和鉴定

本文采用鼠单克隆抗-HBs(Ab_1)作抗原免疫同系鼠,取免疫鼠的脾细胞与SP_2/0骨髓瘤细胞融合,经过反复筛选、克隆化获得两株(B_3,C_2)持续分泌单克隆的抗独特型抗体其(Ab_2)。对其中之一B_3作了深入鉴定。B_3的Ig类型为IgG,亚类为IgG_2a。核型分析结果染色体数为106条。通过ELISA抑制试验对B_3进行鉴定,发现B_3一方面能与纯化HBsAg发生阳性的竞争性抑制,另一方面又能与不同来源的抗-HBs发生结合,出现阳性的中和抑制。无论竞争性抑制还是中和抑制,都呈现剂量依赖关系。将B_3Ig免疫同系鼠,经一次免疫后就能诱导出具有抗-HBs活性的抗-抗-独特型抗体(Ab_3)。以上结果表明:B_3株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗独特型抗体是带有HBsAg表位内影像的单克隆抗体。并对B_3Ig的可能应用意义进行了讨论。