检测可溶型CD226双mAb夹心ELISA的建立及初步应用

目的 :建立一种检测可溶型CD2 2 6 (sCD2 2 6 )的双mAb夹心ELISA ,并用于临床标本的检测。方法 :确定包被mAbLeoA1和HRP mAbFMU3的最佳工作浓度及最佳稀释液后 ,建立双mAb夹心ELISA ,并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行鉴定。再以建立的方法检测临床标本。结果 :包被mAbLeoA1的最佳工作浓度为 2 .5mg/L ,HRP mAbFMU3的最佳工作浓度 1∶4 0 0 ,标准品及HRP mAb的最佳稀释液分别为 1g/LBSA 1mL/LTween2 0 PBS和 30 g/LPEG PBS .建立的双mAb夹心ELISA ,其特异性 (与人IgG无交叉反应 ,阻断实验中阻断效应呈剂量依赖性 )、敏感性 (检出下限为 110ng/L标准品CD2 2 6 /Fc融合蛋白 )及稳定性 (CV <10 .2 % )均较良好。对部分临床标本的检测中 ,发现 6例类风湿关节炎(RA)患者血清sCD2 2 6的水平升高 ,与正常人血清sCD2 2 6水平相比差异显著 (P <0 .0 1)。结论 :建立一种特异性高、重复性好、较敏感的检测sCD2 2 6的双mAb夹心ELISA ,初步证明可用于临床标本的检测     

外周血标本处理方法和时间影响可溶型CD100的水平

目的观察血清和血浆标本不同处理方法和时间对外周血可溶型CD100(sCD100)水平的影响。方法用未加促凝剂血清采血管、含硅化涂层促凝管以及肝素抗凝管、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管和枸橼酸钠抗凝管,分别在凝血1、4、8 h,分别收集2种血清收集管内血清标本。采用ELISA检测标本中sCD100水平,比较不同标本和时间处理对sCD100检测水平的影响。结果不同抗凝剂处理后的血浆标本中,sCD100检测结果无明显差异。血清标本sCD100水平明显高于血浆标本。使用促凝剂血清sCD100水平高于无促凝剂血清sCD100水平。在室温条件下,血清标本随着凝血时间的延长,sCD100水平逐渐升高。结论血清中sCD100水平显著高于血浆,处理时间延长可引起血清sCD100水平进一步增高。在定量检测白细胞和血小板膜分子的可溶型标志物时,应注意标本收集过程中的标准化。     

孕酮化学发光免疫分析方法的建立

目的 建立具有较宽检测范围的孕酮(P)化学发光免疫分析方法.方法 采用竞争一步法原理建立P化学发光免疫分析检测体系,对各种影响因素如免疫试剂的稀释度、免疫试剂的稀释体系及温育时间等进行了考察和优化,最终选定的实验条件分别对该体系的最低检出限、线性、精密度、准确性、特异性进行评估,并与进口全自动化学发光试剂检测结果进行对比.结果 本系统线性范围为0.5~90 ng/mL,最低检出限为0.05ng/mL,批内批间变异变异系数均小于10%,与高浓度孕烯醇酮、雄烯二酮、雌二醇均无交叉反应,添加回收率在96.1%~106.2%.与进口全自动化学发光试剂同时测定175份样本的P浓度,二者测定结果的相关系数r为0.981.结论 成功建立了孕酮化学发光免疫分析法,该方法线性范围宽,灵敏度高,可作为进口化学发光试剂的替代试剂在临床进行推广.     

类风湿性关节炎活动期外周血CT4+T细胞的表型变化

目的观察类风湿性关节炎(RA)活动期外周血CT4+T淋巴细胞的表型变化,探讨其免疫病理机制。方法采用ELISA和双标记免疫荧光法检测50例活动期RA患者和50例健康成人外周血CD4+T细胞表面CD154、CD69的表达以及血清、血浆可溶性CD154(sCD154)的含量。结果活动期RA患者的外周血CD4+T细胞CD154(16.8%±7.9%)和CD69(14.1%±8.2%)的表达水平均显著高于健康人,其血清sCD154(18.56±6.32,ng/ml)和血浆sCD154(8.41±3.51,ng/ml)含量亦分别高于健康人血清sCD154(9.56±4.71,ng/ml)和血浆sCD154(2.98±1.13,ng/ml)。结论CD4+T细胞表达的CD154、CD69以及血浆sCD154含量与RA的活动相关,可以作为RA的辅助诊断、疗效评价和预后判断的有价值的实验室参数。     

基质金属蛋白酶2/9促进T细胞CD100脱落在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的作用

目的观察CD100、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP2)、MMP9在冠心病患者中的变化,评估MMP2/9对T细胞中CD100的调控在冠心病发病中的作用。方法 24例稳定性心绞痛(stable angina, SA)、22例不稳定性心绞痛(unstable angina, UA)、31例急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)和18例对照者入组本研究。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆可溶型CD100(sCD100)、MMP2、MMP9水平,流式细胞术检测T细胞中膜型CD100(mCD100)平均荧光强度(MFI)。分选CD4~+和CD8~+T细胞,使用CD100、MMP2/9和抗CD100抗体刺激,ELISA法检测上清中细胞因子水平,实时定量PCR法检测CD4~+T细胞中转录因子T-bet、GATA-3、FoxP3、RORγt和CD8~+T细胞中穿孔素、颗粒酶B mRNA相对表达量。结果 AMI组血浆sCD100、MMP2、MMP9水平高于对照组、SA组和UA组,AMI组CD4~+和CD8~+T细胞中mCD100 MFI低于对照组、SA组和UA组(P0.05)。CD100刺激后CD4~+T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-17、IL-22水平及T-bet、RORγt mRNA相对表达量升高(P0.05)。CD100刺激后CD8~+T细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、IFN-γ水平及穿孔素、颗粒酶B mRNA相对表达量升高(P0.05)。MMP2或MMP9单独刺激AMI患者CD4~+T细胞,上清sCD100、mCD100 MFI无明显变化,MMP2+MMP9联合刺激后,上清sCD100升高,mCD100 MFI降低,分泌IFN-γ、IL-17、IL-22水平及T-bet、RORγt mRNA相对表达量升高(P0.05),加入抗CD100抗体后CD4~+T细胞中上述指标较联合刺激组降低(P0.05)。MMP2、MMP9或MMP2+MMP9联合刺激AMI患者CD8~+T细胞,上清sCD100升高,mCD100 MFI降低,TNF-α、IFN-γ水平及穿孔素、颗粒酶B mRNA相对表达量升高(P0.05),加入抗CD100抗体后CD8~+T细胞中上述指标较联合刺激组降低(P0.05)。结论 AMI患者中,高表达的MMP2/9促进T细胞mCD100脱落,上调sCD100水平,诱导T细胞活化。     

普门电化学发光仪检测降钙素原的性能分析

目的分析普门(Lifotronic)eCL8000电化学发光仪检测降钙素原(procalcitonin,PCT)的性能。方法以降钙素原(PCT)作为检测指标,根据临床和实验室标准协会(CLSI)文件要求从精密度、正确度(方法学比对)、线性范围、生物参考区间等方面评价普门eCL8000电化学发光仪的性能。结果普门eCL8000电化学发光仪检测PCT的批内精密度变异系数CV高低值分别为2.60%和2.11%,批间精密度CV值分别为3.92%和2.22%。PCT检测结果最大偏倚为14.29%(≤1/2TEa),且与参考方法拟合相关系数R^2=0.9977。线性范围相关系数R2=0.9993,生物参考区间为≤0.05ng/mL。结论普门eCL8000电化学发光仪检测PCT整体性能良好,能满足实验室的工作要求,可用于临床标本的检测。     

人S100蛋白的表达及其抗血清的制备和脑脊液中S100含量测定方法的建立

目的：建立定量检测脑脊液（CSF）及血清中S100蛋白的方法，探讨S100蛋白的检测在辅助诊断克－雅病（CJD）中的应用。方法：利用脑cDNA文库，经PCR获得了S100基因并克隆至原核表达载体pGEX-2T上，在大肠埃希菌中表达了谷胱甘肽－S－转移酶（GST）－S100融合蛋白；融合蛋白经亲和纯化后，免疫家兔，制备抗体；抗体经纯化后，用生物素（BNHS）标记，建立了可定量检测S100蛋白的生物素－亲和素系统ELISA方法，并初步用于临床脑脊液的检测中。结果：所表达的GST－S100蛋白相对分子质量约为35000，以其为抗原制备的S100特异性抗血清具有良好的免疫反应性。建立了定量检测脑脊液中S100蛋白的双抗体夹心ELISA方法，对3例“可能性的CJD”患者（14－3－3蛋白阳性）和15例无痴呆症状患者脑脊液进行检测，结果显示，3例CJD患者脑脊液S100含量均超过2．900μg/L,而在无痴呆症状患者组中14例患者脑脊液S100含量都低于0．180μg/L。对正常人和CJD患者血清进行检测，显示S100蛋白含量个体间差异很大。结论：所建立的方法可用于脑脊液中S100蛋白的检测，进一步扩大标本量有助于明确脑脊液中S100蛋白的检测在辅助诊断CJD中的价值。     

化学发光免疫分析血清C肽方法建立

双抗体夹心一步法建立人C肽(C-peptide) 化学发光免疫分析(CLIA)方法.方法可测范围0.15～15ng/mL,灵敏度0.02ng/mL,批内、批间变异系数(CV)分别为4.2%～6.5%和6.8%～9.3%,与胰岛素无交叉反应,与胰岛素原的交叉反应率为7.3%.本方法与国外同类试剂盒同时检测40份C-肽释放试验血清,相关系数为0.9709.本方法各项指标均满足临床检测要求,达到国外同类产品水平.     

可溶性CD40在肝病患者血清中的表达及其临床意义

目的:研究可溶性CD40(solubleCD40,sCD40)在急性肝炎、重型肝炎和原发性肝癌患者血清中的表达,探讨其与生化指标和疾病预后的关系。方法:使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测急性肝炎(49例)、重型肝炎(22例)和原发性肝癌(13例)患者入院次日清晨空腹血清标本和健康体检者(44例)血清标本中sCD40浓度,分析其与急性肝炎患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的关系,并初步探讨sCD40水平与重型肝炎患者疾病预后的关系。流式细胞术检测患者血清sCD40与CD40配体(CD40L)的结合活性。结果:三种肝脏疾病患者血清中sCD40水平(149.70±86.82)pg/mL较健康对照组(47.33±27.49)pg/mL显著升高(P<0.001),但各组患者之间无统计学意义(P=0.475)。重型肝炎死亡患者血清sCD40浓度较存活患者显著升高(P<0.05)。急性肝炎患者血清sCD40浓度与ALT、AST水平呈显著正相关(r=0.50,P<0.001;r=0.47,P<0.01)。体外实验显示患者血清sCD40具有与CD40L结合的活性。结论:肝脏疾病患者血清异常高表达sCD40,这是评价急性肝细胞损伤的辅助指标,有助于判断重型肝炎患者的病情和预后。CD40-CD40L作用可能参与了肝细胞损伤和免疫失调的病理过程。     

IL-35对可溶性CD40配体诱导血管内皮细胞损伤的影响

目的 探索深静脉血栓(DVT)患者外周血可溶性CD40配体(sCD40L)和白细胞介素(IL)-35浓度,并研究IL-35对sCD40L诱导血管内皮细胞损伤的保护作用。方法 收集深静脉血栓急性期患者30例(DVT组)、健康对照者30名(HC组)外周静脉血3 mL。ELISA检测外周血清IL-35、sCD40L、IL-1β、IL-18的水平;体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)并分为3组,对照组(磷酸盐缓冲液)、sCD40L组(25μg/mL sCD40L)、IL-35组(20 ng/mL IL-35和25μg/mL sCD40L);CCK8法检测HUVECs的活力;ELISA检测细胞培养上清IL-1β、IL-18的水平;Western blot检测细胞GSDMD-N、cleaved caspase-1蛋白的表达。结果 DVT患者外周血IL-35水平显著低于对照者,sCD40L、IL-1β、IL-18的水平显著高于对照者(P<0.05)。DVT患者外周血IL-35与sCD40L呈负相关。体外实验表明：IL-35能抑制sCD40L诱导内皮细胞活力的损伤,降低sCD40L组细胞...     

人肌酸激酶同工酶MB(质量法)化学发光免疫分析定量检测方法的建立及性能评价

利用化学发光免疫分析技术,建立一种人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)定量检测方法。采用基于化学发光免疫分析的双抗体夹心法(以纳米磁微粒为固相载体包被抗人CK-MB抗体,以另一抗体交联碱性磷酸酶为标记物)研制CK-MB化学发光免疫定量检测试剂盒。并进行一系列性能评估及临床相关性试验。该检测方法的线性范围为(0.1~300)ng/ml;空白限为0.1 ng/ml;批内精密度和批间精密度均小于5%;准确度:添加回收率在(100±5)%以内;在正常人血清中添加100 ng/ml的CK-BB及10000 ng/ml的CK-MM,对测定结果没有产生影响;当样本中存在高浓度的甘油三酯、血红蛋白、胆红素以及RF和HAMA时测试偏差在±15%范围以内;试剂在37℃放置72h后。稳定性良好,各性能指标均达到要求;相关性试验结果r0.98,一致性结果良好。参考值范围为:(0.42~6.34)ng/ml。本研究建立的CK-MB化学发光免疫分析定量检测方法的各项性能指标均达到了临床检测要求,可用于临床血清CK-MB检测。     

可溶性CD40配体酶联检测试剂盒的研制及其运用

目的 :建立灵敏、特异和稳定的人可溶性CD4 0配体 (sCD4 0L)酶联检测试剂盒。方法 :采用鼠抗人CD4 0L单克隆抗体 1B1为包被抗体 ,识别人CD4 0L不同位点的单克隆抗体 4F1经琥珀酰羟基生物素 (BNHS)标记后为检测抗体 ,建立双抗体夹心的人sCD4 0L酶联检测方法。在此基础上 ,测定 2 0 0例健康供血员血清和血浆中sCD4 0L的含量。结果 :成功研制人sCD4 0L酶联检测试剂盒 ,灵敏度为 0 5ng ml。该试剂盒 4℃放置 3个月 ,离散度 (CV) <± 6 9% ,回收率为 94 7%～ 10 4 8% ,提示该检测系统具有良好的灵敏度、稳定性和准确性 ,与国外商品化试剂盒的分析结果相似。应用该试剂盒测得的健康供血员血清和血浆sCD4 0L含量分别为 9 5 6± 4 71、2 98± 1 13ng ml。结论 :研制成灵敏、特异和稳定的人sCD4 0L酶标检测试剂盒 ,能够对血清和血浆中sCD4 0L进行准确定量分析 ,并首次证实血清和血浆中sCD4 0L水平的差异性     

基于光激化学发光技术开发的多表位检测cTnI的方法

目的建立一种多表位识别检测人血清心肌肌钙蛋白水平的光激化学发光免疫检测分析方法。方法采用双抗体夹心法,通过多表位识别建立检测人血清中心肌肌钙蛋白水平的方法,评估其分析灵敏度、回收率和批内精密度,并与Siemens(化学发光法)进行比较。结果心肌肌钙蛋白I的分析灵敏度为0.06 ng/ml,回收率为93.43%,批内精密度(CV)为0.62%~1.55%,与化学发光法的符合率好(r=0.99)。结论光激化学发光免疫分析方法多表位测定心肌肌钙蛋白I具有超高灵敏度、精密度和准确性,与化学发光法的符合率较好,适用于临床。     

基于光激化学发光技术开发的多表位检测cTnI的方法

目的建立一种多表位识别检测人血清心肌肌钙蛋白水平的光激化学发光免疫检测分析方法。方法采用双抗体夹心法,通过多表位识别建立检测人血清中心肌肌钙蛋白水平的方法,评估其分析灵敏度、回收率和批内精密度,并与Siemens(化学发光法)进行比较。结果心肌肌钙蛋白I的分析灵敏度为0.06 ng/ml,回收率为93.43%,批内精密度(CV)为0.62%~1.55%,与化学发光法的符合率好(r=0.99)。结论光激化学发光免疫分析方法多表位测定心肌肌钙蛋白I具有超高灵敏度、精密度和准确性,与化学发光法的符合率较好,适用于临床。     

AFP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制及其临床应用

目的:研制AFP时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)试剂盒。方法:采用双抗体夹心法建立AFP-Tr-FIA试剂盒,对反应条件进行优化,并对试剂盒的各项指标进行评价。结果:抗体包被浓度确定为5μg/m l,铕标抗体最佳稀释比为1 50。试剂盒的线性范围为1ng/m l~1210ng/m l,灵敏度为0.41ng/m l,准确度高,批内和批间变异系数分别5.1%~8.8%,6.7%~11.9%。与CA199、CA125、CEA和白蛋白无交叉反应。破坏试验表明试剂在37℃可稳定7d。收集50例肝癌患者和370例健康人血清,用本试剂盒测得肝癌患者血清AFP浓度(557.3ng/m l±322.1ng/m l)显著高于健康人(6.5ng/m l±5.4ng/m l)(P<0.001)。370例正常人血清标本测试该试剂盒的正常参考范围为(0~12.0)ng/m l。本试剂盒检测结果与商用W allac AFP试剂盒检测结果相关系数为0.9988。结论:试剂盒各项指标达到规定的要求,可用于临床血清AFP检测。     

测定癌胚抗原的吖啶酯化学发光免疫分析方法的建立

目的建立一种定量测定血清中癌胚抗原（CEA）含量的检测方法。方法根据双抗体夹心法实验原理,利用吖啶酯化学发光免疫分析技术-结合生物素-亲和素磁颗粒分离技术。结果方法的最低检测限为0.2ng/mL,线性范围为2.2~360ng/mL,批内变异为1.9%~2.2%,总变异为6.5%~8.1%,与ROCHE公司的癌胚抗原检测试剂盒（电化学发光法）测定结果的拟合方程为Y=0.9969X＋0.6168,相关系数为r=0.9921。结论本方法的各项指标均满足临床检测的要求,适合临床推广应用。     

电化学发光法检测鳞状上皮细胞癌抗原的性能验证及与化学发光微粒子法检测的一致性评价

目的对罗氏Cobas e602电化学发光法检测鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)进行性能验证,并对电化学发光法和新产业Maglumi 2000 Plus化学发光微粒子法检测SCCA结果进行一致性评价。方法对电化学发光法检测SCCA的精密度、线性范围、稀释倍数、参考区间进行性能验证。用化学发光微粒子法和电化学发光法同时检测107例血清样本SCCA,对两种方法检测结果进行一致性评价。结果电化学发光法检测SCCA低值和高值的批内 CV 分别为2.4%和3.7%,批间 CV 分别为1.2%和1.6%;在0.32~68.26 ng/mL范围内线性良好, R 2 =0.9997;在1 ∶10和1 ∶20稀释倍数性能良好,临床可报告范围上限达到1400 ng/mL;20名表观健康者均在试剂盒给定的参考区间内(0~2.7ng/mL)。电化学发光法和化学发光微粒子法一致性评价结果显示,组内相关系数ICC=0.836,两种方法总体一致性良好;Bland- Altman偏差分析显示两种方法SCCA结果在低值部分(0~5.0ng/mL)一致性良好,随着SCCA浓度增加,偏差逐渐增大。结论罗氏Cobas e602电化学发光法检测SCCA的精密度、线性范围、稀释倍数、参考区间均符合检测要求。罗氏Cobas e602电化学发光法和新产业Maglumi 2000 Plus化学发光微粒子法检测SCCA在低值部分一致性良好,随着SCCA浓度升高,偏差逐渐增大。     

人血清抵抗素ELISA方法的研究及其临床初步应用

用兔抗人抵抗素(resistin)片断(22～34氨基酸残基)的多克隆抗体(PcAb)包被固相板,用辣根过氧化物酶(HRP)标记PcAb得HRP-PcAb.在包被PcAb的孔中加入抵抗素标准品(或待测样品),加入HRP-PcAb,形成PcAb-resistin-HRP-PcAb复合物,加酶底物邻苯二胺(OPD)显色,用酶标仪在492nm波长处测定OD值,绘制标准曲线.从标准曲线读出样本中抵抗素含量.本方法特异性强,灵敏度高,精密度好.该法测定范围0.5～100ng/mL,最低检出量0.5ng/mL,批内和批间CV%分别为3.4%和7.2%.50例2型糖尿病患者血清抵抗素含量为23.2±3.9 ng/mL,明显高于正常值16.0±2.5ng/mL.结果表明该法稳定,灵敏度适于检测人血清抵抗素水平.     

抗人Apo B100单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗人载脂蛋白B100(Apo B100)单克隆抗体(mAb),建立人Apo B100双抗体夹心ELISA检测方法。方法:将人Apo B100抗原免疫小鼠,通过细胞融合、筛选后得到杂交瘤细胞株。将细胞株用无血清培养基扩大培养并纯化上清获得抗体,测定抗体亲和力、亚型、特异性及表位,最后建立双抗体夹心ELISA方法。结果:获得4株抗人Apo B100的杂交瘤细胞株(4-1-2、4-2-2、4-3-2、4-6-3),其分泌的抗体不与其他相关蛋白交叉反应,亲和力达到1×109L/mol。用4-3-2和4-6-3建立的双抗体夹心法的检测范围为(1.3～80)ng/mL,灵敏度1.24 ng/mL,批内变异系数均小于10%,批间变异系数均小于15%,回收率在90%以上。结论:成功制备了抗人Apo B100mAb,建立了定量检测人Apo B100的双抗体夹心ELISA方法,为Apo B100检测及疾病的诊断奠定基础。     

UF-100尿流式细胞仪应用于脑脊液细胞计数

目的 建立流式细胞仪计数脑脊液标本细胞的快速、准确、直观的检测方法并验证该方法的可行性.方法 无菌条件下采集患者脑脊液标本,使用UF-100流式细胞仪分别对117例脑脊液标本中红细胞与白细胞数计数,并与采用镜检法检测相同脑脊液标本所得的结果用统计学方法进行比较.结果 流式细胞仪法与镜检法计数脑脊液中的血细胞结果差异无显著性.结论 流式细胞仪计数脑脊液中的血细胞快速、结果准确且重复性好,适合临床常规检测脑脊液标本.