一种免疫荧光图像减影技术在鉴定drebrin E亚型的应用

目的:在缺乏drebrin E抗体的情况下利用一种新的免疫荧光计算机图像减影技术的方法鉴定drebrinE亚型。方法:应用drebrin非特异性抗体M2F6和drebrin A特异性抗体DAS2对成年大鼠脑冰冻切片进行双重免疫荧光染色,然后用计算机图像处理软件对同一切片的两种染色照片进行图像减影技术处理,观察drebrin E在成年大鼠脑中的分布情况。结果:通过免疫荧光计算机图像减影技术得到了drebrin E亚型的图像,确认了drebrin E在成年大鼠脑中吻侧迁移流、海马齿状回、梨状皮质的分布。结论:利用免疫荧光图像减影技术可以实现对drebrin E亚型的鉴定,为类似drebrin这样存在两种亚型的蛋白质鉴定提供了一种新的方法。     

胃癌单克隆抗体的研制及其对胃癌活检组织印片细胞的免疫细胞化学反应性

用体外培养的人胃癌细胞脾内免疫BALB/c小鼠,将致敏脾细胞和小鼠SP2/0细胞融合,获得小鼠杂交瘤细胞。用间接免疫荧光法初筛,将初筛克隆扩增后,用正常组织及新鲜肿瘤组织冰冻切片做免疫组化染色,测定其抗体的反应性。然后用有限稀释法克隆3～5     

用导向选择链更替技术建立抗肝癌抗原HAb18G的人源性Fab基因库

目的 :在嵌合HAb18 Fab抗体的基础上 ,利用载体pComb3X ,采用导向选择链更替技术建立全人源性Fab基因库。方法 :用RT PCR自肝癌患者外周血单个核细胞 (PBMC)中 ,扩增全套人抗体Fd基因片段和L链基因。首先 ,将Fd基因克隆入已含嵌合L链基因的展示载体pComb3X/CL中 ,建立人 -鼠杂合的Fab基因库 ,以原核表达的非融合HAb18G的胞外区片段为抗原 ,筛选杂合的Fab基因 ,以得到人Fd基因。然后应用筛选出的Fd基因与人L链基因库配对 ,建立全为人Fab的基因库 ,并筛选全人Fab基因。将IPTG诱导的表达菌裂解 ,取其上清对pⅢ Fab融合蛋白的功能进行分析 ,并对其编码基因进行测序。结果 :建立了库容为 2× 10 7的杂合Fab基因库 ,经 6轮筛选后得到 7株杂合Fab基因。利用筛选的人Fd基因建立了库容为 0 .8× 10 7的全人Fab基因库 ,经 4轮筛选得到 2株亲和力较高、特异性强的人Fab基因。测序结果显示 ,2株Fab基因具有相同的Fd基因序列 ,与亲本抗体同属IgG2亚类 ;L链基因为κ型 ,可变区均属于Vκ3家族。结论 :利用导向选择链更替技术 ,筛选出特异性较强、完全人源化的抗肝癌抗原HAb18G的Fab抗体 ,为进一步的工作打下了基础。     

恶性疟疾疫苗M.RCAg-1与候选佐剂纳米乳配伍的免疫原性研究

为了评价纳米乳作为佐剂对恶性疟疾人工重组蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响,将纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍,于第0、14、28 d肌肉注射免疫小鼠,抗原量为20μg/只。第3次免疫后10 d,眼球取血并取脾细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体水平、抗体亚类及其对抗原单表位的识别,用间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,用ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫应答水平。结果显示疫苗佐剂组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平可达1∶108;疫苗佐剂组产生的特异性Ig G抗体以Ig G1为主;疫苗佐剂组抗体对抗原单表位和天然虫体的识别效果显著。各表位和蛋白诱发免疫小鼠分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数。结果提示纳米乳作为恶性疟疾疫苗M.RCAg-1的佐剂,能够显著提高机体的体液免疫和细胞免疫应答水平。     

抗CMG2单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备鼠抗人毛细血管形态发生基因2(CMG2)单克隆抗体,并将其初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。方法重组表达CMG2胞外区肽段,免疫Balb/c小鼠,常规制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法筛选目标克隆,制备小鼠腹水并经蛋白A亲和纯化获得相应抗体。间接ELISA法鉴定抗体的亚类类型及亲和力;抗原竞争性抑制实验鉴定抗体的特异性。用候选抗体建立流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹及免疫组织化学方法,初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。结果共获得3株针对CMG2胞外区的杂交瘤细胞株,其中以8F3单克隆抗体的亲和力和特异性最好,亚型为Ig G1。8F3单抗能用于胃癌细胞株CMG2表达的流式细胞术和免疫荧光检测以及胃癌组织的免疫组织化学检测。结论成功制备出高效价高特异性的鼠抗人CMG2单克隆抗体,为CMG2的基础和临床应用研究提供了有用工具。     

复合组织切片技术在测定自身抗体中的应用

<正> 间接免疫荧光测定循环内自身抗体是临床免疫中最常用的方法之一。一般用不同的基质(组织)来检测不同的自身抗体,例如用大鼠肝脏切片检查抗核抗体,用大鼠肾切片检查抗线粒体抗体,大鼠胃切片检查壁细胞抗体等。我们近年来应用复合组织切片技术,可以在一张切片上同时测定5种以上的自身抗体,并可避免嗜异抗体的假阳性反应。     

抗人大肠癌单克隆抗体的制备及应用

目的制备和纯化抗人大肠癌单克隆抗体(ND-1),分析其在大肠癌诊断中的应用价值。方法常规免疫小鼠制备腹水,腹水经离心和过滤后,应用G蛋白亲和层析法进行纯化。采用SDS-PAGE、间接免疫荧光(IFA)、间接ELISA检测纯化后抗体的纯度、活性、效价和特异性。并用免疫组织化学SP法检测在大肠癌组织中的表达。结果经SDS-PAGE分离可见两条相对分子质量(Mr)分别为55 000和25 000明显的两条蛋白条带。间接ELISA检测抗体效价为1∶1 000 000,ND-1抗体对表达相应抗原的大肠癌细胞株具有特异结合活性。人大肠癌组织切片经ND-1抗体免疫组织化学染色阳性率为82.9%,其中高分化腺癌阳性率为100%。结论应用G蛋白亲和层析法可以很好分离纯化鼠腹水中的IgG1亚型的单克隆抗体,抗体的纯度高,特异性强,生物学活性好,可望成为有效的肿瘤诊断和治疗的手段。     

高压抗原修复方法在免疫组化染色的应用比较

目的:优化免疫组化高压抗原修复法染色效果。方法:同一组织分别采用高压抗原修复直接法或间接法,用柠檬酸缓冲液或EDTA抗原修复液进行抗原修复,检测10种常用抗体的免疫组化染色效果。结果:抗原修复间接法与直接法染色强度有明显差异,直接法优于间接法;两种抗原修复液间也存在差异,EDTA抗原修复液效果优于柠檬酸缓冲液。结论:高压抗原修复直接法并用EDTA抗原修复液对组织切片进行抗原修复效果更好。     

西尼罗病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定

目的以西尼罗病毒非结构蛋白(nonstructural protein1,NS1)为免疫原制备西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体,并鉴定其特异性。方法在表达具有良好抗原性的重组西尼罗病毒NS1蛋白基础上免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光(IFA)和免疫印迹对所获得单克隆抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制试验对m Ab识别的抗原位点进行分析。结果获得39株特异性针对西尼罗病毒NS1蛋白的单克隆抗体,Ig亚类测定结果Ig G3和Ig G2a单抗各2株,Ig G2b单抗5株,Ig G单抗1株,另外29株均为Ig G1。结论成功获得了特异性针对西尼罗病毒NS1蛋白的单克隆抗体,将为进一步建立西尼罗病毒NS1抗原检测方法及探讨NS1蛋白及抗体在西尼罗病毒发病机制中提供依据。     

酶联SPA过氧化物酶染色诊断血吸虫病的初步报告

<正> 酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)代替第二抗体作ELISA,已有较好的效果,而用于血吸虫病免疫酶组化法方面尚未见报道。作者等在神谷晴夫应用日本血吸虫卵肉芽肿肝组织,经福尔马林石蜡包埋切片仍能保持良好抗原性的基础上,用HRP-SPA作间接免疫过氧化物酶染色试验     

氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定与应用.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原,借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物.结果:获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgGl(K),该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离.结论:成功制备了抗人CPSI的mAb,为CPSI的研究提供了有力的工具.     

肝癌候选标志物HCCR单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备肝癌候选标志物HCCR蛋白的单克隆抗体(mAb).方法:重组表达HCCR-1167-360蛋白用于动物免疫,用含有HCCR蛋白抗原表位YLGTRR的重组蛋白(Ep-HCCR)检测血清抗体效价及筛选阳性克隆.通过ELISA、Western blot、免疫荧光和免疫组化方法鉴定制备的HCCR抗体的性质.结果:获得1株分泌HCCR抗体杂交瘤细胞株,通过ELISA方法测定抗体的亲和力常数为5.4×106L/mol;Western blot结果显示,该抗体能特异识别肝癌HepG2细胞中HCCR-1和HCCR-2蛋白;免疫荧光检测显示,HCCR蛋白主要分布在细胞质和细胞膜中;免疫组化检测到肝癌组织中有HCCR蛋白表达但在正常组织中没有.结论:成功制备了1株抗HCCR特异性mAb,为建立基于HCCR的肝癌检测方法奠定了基础.     

八肽胆囊收缩素与甲—脑啡肽在EC细胞中的共存及含量的相互关系

用免疫组织化学相邻切片多重标记技术，观察了ＣＣＫ－８与Ｍ－ＥＮＫ在小肠ＥＣ细胞中的共存，并结合图像分析技术研究同一细胞中共存物质含量的关系。实验取猪十二指肠，Ｂｏｕｉｎ液固定，制备１μｍ厚连续石蜡切片。在相切片上分别用兔抗５－ＨＴ，ＣＣＫ－８和Ｍ－ＥＮＫ抗体进行ＰＡＰ法免疫组织化学染色。     

流感嗜血杆菌D蛋白黏膜免疫保护效果研究

目的评估D蛋白(protein D,PD)黏膜免疫对流感嗜血杆菌感染的保护效果,研究其免疫应答机制,为发展新疫苗提供依据。方法运用分子克隆技术构建PD蛋白表达质粒;用含有或无霍乱毒素(cholera toxin,CT)的PD蛋白黏膜免疫C57BL/6小鼠,ELISA方法检测血清Ig G、唾液Ig A及脾细胞的细胞因子分泌水平;建立定植和致死性感染模型,观察细菌清除及小鼠生存情况;以裸鼠和μMT小鼠来研究细胞和体液免疫应答在PD免疫保护效果中的作用。结果单独PD蛋白黏膜免疫野生鼠能诱导高滴度的抗PD Ig G和s Ig A,血清中Ig G1、Ig G2a和Ig G2b亚型水平相当,脾细胞分泌IL-17A增加,小鼠鼻咽部流感嗜血杆菌清除增加,致死性感染生存率为82%;裸鼠和μMT小鼠免疫PD后对流感嗜血杆菌的清除效应和致死性感染保护作用受损,PD抗血清被动免疫μMT小鼠后其抗感染能力恢复;PD+CT组抗体滴度及脾细胞分泌IL-4和IL-17A水平均高于PD组,细菌清除效应与PD组相似,但无致死性感染保护能力。结论无佐剂PD蛋白黏膜免疫能有效诱导黏膜应答,抵抗流感嗜血杆菌的定植与致死性感染,为黏膜疫苗的发展提供了可能的选择。     

不同免疫方案制备抗HAb18G/CD147胞外区多克隆抗血清的比较

目的: 制备针对肝癌相关抗原HAb18G/CD147胞外区不同表位的抗血清, 比较不同免疫方案的免疫效果。方法: 以原核表达的GST -HAb18GEF融合蛋白、重组真核表达质粒pcDNA3 /HAb18G及HCC细胞为免疫原, 分别采用蛋白常规免疫、DNA肌肉免疫及pcDNA3 /HAb18G -HCCbooster(DNA -cellbooster)免疫接种BALB/c小鼠。采用间接ELISA和细胞ELISA, 同时测定免疫血清中抗变性和天然HAb18GEFIgG抗体的滴度和Ig亚类。用Westernblot检测各免疫方案制备的抗血清, 与变性HAb18GEF抗原结合的特异性。用免疫荧光法验证DNA- cellbooster免疫接种法制备的抗血清, 与细胞膜上天然HAb18G抗原的结合特异性。结果:以GST- HAb18GEF常规免疫后, 可诱导高滴度的IgG1抗体产生, 但针对的多为HAb18GEF的变性或线性表位; 以pcD -NA3 /HAb18G肌肉免疫后, 可诱导针对其天然表位的IgG2a抗体产生, 但滴度较低; 以DNA -cellbooster免疫后, 可诱导中等滴度、针对其天然表位的IgG2a和IgG1抗体产生。结论: 不同免疫方案可诱导针对HAb18GEF不同表位、不同滴度的多克隆抗血清, 为淘筛针对其不同表位的多样性抗体奠定了基础。     

免疫荧光双重染色的激光共聚焦显微镜样品制备及观察

目的 详尽介绍免疫荧光双标染色方法,为激光共聚焦显微镜观察提供理想的样品.方法 大鼠腹腔注射Brdu,40g/L多聚甲醛灌注固定,取脑组织冰冻切片,用抗GFAP多克隆抗体孵育和FITC荧光标记二抗染色,再用抗Brdu单克隆抗体孵育和Cy3荧光标记二抗染色,在激光共聚焦显微镜下连续断层扫描,图像叠加.结果 清晰可见处于增殖期(S期)细胞胞核呈红色荧光,星形胶质细胞胞质呈绿色荧光.结论 影响免疫荧光双重标记样品效果的环节和因素很多,其中最重要的因素是2个一抗的搭配和协调.     

抗人P185~(erbB_2)单克隆抗体的制备及特性分析

目的制备可特异识别 P185 erb B2 胞外区的单抗 ,选出亲和力较高并具有抑瘤作用的克隆。方法以高表达 erb B2 的人乳腺癌细胞系 SKBR3免疫 BABL / c小鼠 ,用纯化的重组 DNA表达的 P185胞外区蛋白作为抗原 ,以间接 EL ISA方法筛选阳性克隆。结果获得 10株稳定分泌抗 P185胞外区单抗的杂交瘤细胞株。 4株为 Ig G1、1株为 Ig G3、5株为 Ig M,分别可识别 P185胞外区 3个不同表位 ,且只与天然形式的 P185胞外区特异结合。其中 4株 Ig G1类抗体可明显抑制 SKBR3及 SKOV3细胞增殖。免疫组化实验可使 SKBR3及 SKOV3细胞膜特异性染色 ,且可检出乳腺癌、卵巢癌等石蜡切片标本中 erb B2 高表达的阳性细胞。结论所获单抗可特异识别 P185胞外区抗原 ,具有肿瘤诊断、判断预后及人源化改造后用于治疗的应用潜力。     

抗人肝细胞肝癌单抗的产生及体内定位研究

本文用临床肝癌手术标本,制备成细胞悬液,三次免疫BALB/c小鼠,融合产生杂交瘤,用ABC法筛选单抗(肿瘤组织低温石蜡切片)。获得两株选择性较好的杂交癌-HH10、HD_2。抗体亚类为IgG_1。1.组织化学染色;肝癌阳性例数HH10 37/50;HD_(12)30/50。     

针对Nogo-66受体分子不同抗体的反应性比较

目的: 比较几种不同的针对Nogo -66受体的抗体的反应性。方法: 利用Westernblot技术, 用不同的NgR的抗体检测转染Flag -NgR或Flag- NgRH1 /H2的COS细胞, 以验证NgR抗体的反应性和特异性; 利用间接免疫荧光染色技术,检测不同的NgR的抗体对转染细胞以及颗粒神经元表达的NgR蛋白的反应性。结果: Westernblot结果显示, AB5615sc- 25659和NgRpAb都可特异识别NgR, 并且不和同源家族分子NgRH1 /H2产生交叉反应; 转染Flag -NgR细胞的免疫荧光双标结果显示 5种NgR的抗体均能与NgR产生特异反应, 其中仅Ngr11- A使核周NgR染色, 其余抗体可使胞膜和胞质均着色; CGN细胞荧光染色结果显示, 除Ngr11- A未观察到细胞染色外, 其余抗体均可使细胞的胞膜和突起特异着色, sc -16708和NgRpAb亦可使胞质着色。结论: 针对Nogo-66受体的这几种抗体都可以与NgR产生特异性反应; 不同NgR的抗体在Westernblot和免疫荧光染色上的表现模式存在一定的差异。     

微波快速免疫组化双重、多重标记方法的研究

免疫组化的双重和多重标记及原位杂交和免疫组化相结合的双重和多重标记已有文献报道,尤其是癌基因产物的抗体化,使得多重标记方法的应用更为重要,但因其染色流程过长,切片长时间浸泡,易发生脱片、组织结构破坏等问题.本研究应用微波辐射进行免疫组化多重标记及原位杂交(ISH)与免疫组化相结合进行的多重标记,乳腺肿瘤、结肠癌及肺癌(各选10例标本)组织切片上12种癌基因蛋白和3种基因探针组合的多重标记.结果利用微波辐射不仅可缩短多重标记的时间,而且克服组织切片的脱片、组织结构破坏等缺点,避免了可能发生的交叉反应.