角质细胞生长因子2的优化表达及纯化研究

目的优化工程菌的表达,比较肝素亲和层析、离子交换层析两种方法的角质细胞生长因子2（keratinocyte growthfactor,KGF-2）的纯化产量及纯度,以获取高效的提纯工艺。方法工程菌分别进行生长密度和诱导时间的实验,并将细茵裂解液上两种层析柱进行分步洗脱,收集目标蛋白,进行电泳分析。结果获得高表达KGF-2工程菌,表达率为29％;用两种层析方法获得电泳纯KGF-2。结论 离子交换层析在纯化过程中具有一定优势。     

角质细胞生长因子对上皮细胞损伤的防护作用

角质细胞生长因子（KGF）属于成纤维细胞生长因子家族,由成纤维细胞和其他来源的基质细胞合成分泌,可特异性地促进上皮细胞的增殖分化，在多种组织器官中发挥着重要功能,尤其是在上皮细胞损伤的修复中起重要作用。KGF防护作用的机制可能是通过调节促细胞增殖、抗氧化蛋白等相关基因的表达来实现的。     

角质细胞生长因子2在创面愈合中的作用

角质细胞生长因子2是成纤维细胞生长因子家族近年新发现成员之一,由间质细胞分泌,其受体分布于上皮细胞,能特异性的促进上皮细胞生长、分化和迁移。研究显示角质细胞生长因子2是一个多功能因子,对表皮、真皮和黏膜组织具有显著的促再生和修复作用。     

角质细胞生长因子对人卵巢癌细胞系CAOV3酪氨酸蛋白激酶活性及表达的影响

目的观察角质细胞生长因子(KGF)对人卵巢上皮性癌细胞系CAOV3增殖及酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性及表达的影响。方法培养人卵巢上皮性癌细胞系CAOV3,用四甲基偶氮蓝(MTT)比色法测定不同浓度KGF对细胞增殖的影响;通过免疫沉淀法纯化蛋白并用TPK试剂盒测定TPK活性;免疫印迹法(Western-blot)测定TPK表达。结果实验组CAOV3细胞增殖率、TPK活性及表达均大于对照组(P<0·05)。结论KGF可以促使人卵巢上皮性癌细胞系CAOV3增殖,机制与其增强TPK活性及表达有关。     

乳糖诱导角质细胞生长因子-2在大肠杆菌中的表达

目的：研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行角质细胞生长因子-2(KGF-2)基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。方法：分别比较乳糖诱导浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度对重组表达产物的影响,并以IPTG诱导作为对照,确定较为优化的乳糖诱导条件。结果：对于重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到良好效果,以乳糖为诱导剂的A₆₀₀值较IPTG高,诱导产物的表达量与IPTG诱导产物相当。以终浓度为10 g/L乳糖在33℃下诱导6 h,可以达到良好的诱导效果,并且具有较好的可溶性和促细胞生长活性。结论：乳糖可替代IPTG诱导角质细胞生长因子基因表达,并取得良好效果,为工程
化生产提供了良好的实验依据。     

角质细胞生长因子及其防护作用的研究

角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)是在1989年由Rubin等[1]从人胎肺成纤维细胞的培养上清中分离并纯化的,并发现具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用,故将其定名为角质细胞生长因子.KGF是具有肝素结合特性的成纤维细胞生长因子超家族中的成员,又称为FGF-7[2].     

角质细胞生长因子噬菌体活性肽的构建及其对表皮细胞增殖的作用

目的 构建展示角质细胞生长因子(KGF)噬菌体活性肽,检测其促表皮细胞增殖的作用.方法 选择4个KGF序列,设计引物;用反转录-PCR法获得3个KGF序列(P1、P2和P4),直接合成1个KGF序列(P3);将KGF序列亚克隆至噬菌粒pComb3中;用噬菌体展示技术,将KGF基因片段展示于噬菌体表面;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测KGF噬菌体活性肽促表皮细胞增殖的作用,测定其在570 nm的吸光度(A)值,用免疫荧光法检测其细胞亲和力.结果 获得4种KGF基因,构建在噬菌粒pComb3中;通过噬菌体展示技术将其表达于噬菌体的表面.MTT检测的吸光度(A)值结果显示阴性对照组(0.293±0.017)与KGF对照组(0.520±0.043)及4种KGF噬菌体活性肽组(P1 ～ 4) (0.469±0.057、0.441±0.048、0.438±0.035、0.446±0.037)间差异均有统计学意义(均P＜0.01),免疫荧光检测结果显示KGF和4种KGF噬菌体活性肽与表皮细胞具有较好的亲和力.结论 构建展示的KGF噬菌体活性肽能够显著促进表皮细胞增殖.     

表皮生长因子受体靶向治疗宫颈癌的研究进展

宫颈癌的发生普遍与人乳头瘤病毒（HPV）感染有关,而HPV感染与表皮生长因子受体（EGFR）信号级联上调之间存在较大的相关性。因此,EGFR通常被作为靶点并使用酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体来治疗宫颈癌。本综述旨在整合当代利用EGFR靶向治疗宫颈癌的方法,并强调当前在涉及EGFR突变的宫颈癌中MicroRNA和相关基因的不同作用。对现有的EGFR疗法的潜在耐药性及对更佳疗法的需求进行了回顾和讨论,以期开发出具有更好效果的新型制剂。     

重组截短型人角质细胞生长因子1在昆虫细胞中的表达

目的：探讨重组截短型人角质细胞生长因子1（rhKGF1_d23）蛋白在昆虫细胞中表达的可行性,为rhKGF1_d23蛋白的生产提供新的途径。方法：PCR法扩增昆虫偏爱密码子优化截短序列kgf1_d23亚克隆到pFastbac载体。在辅助质粒的作用下,pFastBac-kgf1_d23载体Tn7片段转座到Bacmid 中mini-attTn7位点,得到穿梭载体Bacmid-kgf1d23,并通过脂质体法转染sf-9细胞得到杆状病毒P1。继续转染细胞扩增病毒并提高病毒滴度,蛋白表达分析从P3代病毒转染细胞开始,收集细胞超声裂解后进行纯化,MTT法检测纯化后目的蛋白生物活性。结果：昆虫偏好密码子改造的kgf1_d23基因构建进转移载体pFastBac-kgf1_d23和穿梭载体Bacmid-kgf1_d23载体中。SDS-PAGE 结果表明,重组蛋白在60 h后开始大量表达,优化的收获蛋白时间在84～96　h;利用肝素亲和层析和SP阳离子交换层析可以去除90%以上的杂蛋白。纯化的rhKGF1D23蛋白在0.3~25.0 μg•L^-1时,随浓度的增加HaCat细胞的促有丝分裂能力增强,在25.0 μg•L^-1时达到平台期。结论：重组截短型角质细胞生长因子rhKGF1_d23蛋白在昆虫细胞中得到表达,保持其特有的肝素亲和特性,并具有免疫原性及细胞生物学活性。     

角质形成细胞凋亡的研究进展

角质形成细胞的凋亡在维持皮肤正常生理功能过程中起着重要作用，其发生与发展受到多种因素的影响；皮肤中角质形成细胞的凋亡与增殖处于一种动态平衡，如平衡被打破则出现多种与之相关的皮肤疾病。现主要就角质形成细胞凋亡的途径及其调控，并结合临床常见的与角质形成细胞凋亡相关皮肤病研究进展进行综述。     

重组截短型人角质细胞生长因子-1的表达及纯化

目的：构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1( rhKGF1_dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法：利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1_dest23及sumo基因片段,构建4种原核表达载体pET22b-rhKGF1_dest23﹑pET22b-sumo-rhKGF1_dest23﹑pET3c-rhKGF1_dest23和pET3c-sumo-rhKGF1_dest23,分别转化原核表达宿主菌Rosetta(DE3) plysS、BL21(DE3) 、BL21(DE3)Star plysS、origima(DE3) 和BL21AI,筛选rhKGF1_dest23蛋白表达的最佳质粒与宿主菌组合。CM离子交换和肝素亲和层析法纯化rhKGF1_dest23蛋白,Western blotting法鉴定rhKGF1_dest23蛋白。结果： pET22b-rhKGF1_dest23质粒与BL21AI 宿主菌为最佳组合表达,经IPTG与阿拉伯糖诱导, SDS-PAGE电泳后表明目的蛋白大部分以可溶性形式存在,约占菌体总蛋白的10％,经CM和肝素两步纯化后rhKGF1_dest23蛋白纯度为95%以上,Western blotting法鉴定为rhKGF1_dest23蛋白。结论：成功构建表达人KGF1_dest23重组蛋白的基因工程菌,经IPTG与阿拉伯糖诱导,CM弱阳离子与肝素亲合层析后,得到了纯化的rhKGF1_dest23蛋白。     

肝细胞生长因子及其受体与ⅡA期宫颈癌临床病理关系分析

目的 探讨ⅡA期宫颈癌患者血清肝细胞生长因子(Hepatocyte growth facto, HGF)水平及其受体c-Met表达与官颈癌临床病理特征的关系.方法 采用酶联免疫吸附法(ELLSA)及免疫组化法测定48例宫颈癌ⅡA期患者外周血HGF的含量及其组织c-Met受体的表达并分析HGF/c-Met与宫颈癌临床病理特征的关系.结果 血清HGF水平与病理分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关(P＜0.05);组织中c-Met表达阳性率72.9%,与病理分级、浸润深度有关(P＜0.05);宫颈癌患者血清HGF水平与其组织中c-Met表达阳性率成正相关.结论 HGE/c-Met参与了宫颈癌的发生发展,其表达升高可能在宫颈癌的发生、侵袭及转移中起促进作用,HGF/c-Met的联合检测可望成为判断宫颈癌预后的指标.     

不同物理和化学因素对重组人角质细胞生长因子2稳定性的影响

目的:研究重组人角质细胞生长因子2 (rhKGF-2)在不同保存条件下的稳定性,阐明温度、pH值、缓冲溶液及反复冻融因素对rhKGF-2稳定性的影响作用。方法: rhKGF-2在不同温度(－20℃、4℃、25℃、40℃)、pH值(pH 4～9)、缓冲溶液（柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、吉斐氏缓冲溶液）及反复冻融条件下分别保存,采用RP-HPLC法检测rhKGF-2纯度,同时观察外观性状。结果：－20℃、4℃分别保存时,rhKGF-2的各项性质在观察期内都无明显变化;25℃时,rhKGF-2存放28 d纯度较0 h(100.00%)下降至(68.20±0.14)%;40℃时,rhKGF-2存放9 h纯度较0 h(100.00%)下降至(4.80±0.39)%。rhKGF-2(pH　6.0)在25℃条件下保存90 d纯度较0 h(100.00%)下降至(79.20±0.12)%,与对照组(0 h)比较差异有显著性(P<0.05);pH值为4.0、9.0的rhKGF-2液体在25℃条件下分别保存120　h纯度较0 h(100.00%)下降至(15.60±0.30)%和(67.30±0.10)%,与对照组(0 h)比较差异有显著性(P<0.01)。rhKGF-2在柠檬酸缓冲液中25℃条件下保存60　d纯度较0 h(100.00%)下降至(79.20±0.15)%,与对照组(0 h)比较差异有显著性(P<0.01)。rhKGF-2原液反复冻融后其纯度变化差异无显著性(P>0.05)。结论：rhKGF-2在低温和pH 6.0～7.0中性条件下稳定。高温、偏酸性和偏碱性条件下均不利于rhKGF-2稳定。柠檬酸缓冲液有利于rhKGF-2稳定。反复冻融对rhKGF-2稳定性影响不明显。     

角质形成细胞凋亡与银屑病病情的关系

目的：探讨角质形成细胞（KC）凋亡与银屑病病情的相关性。方法：比色法检测30例银屑病患者皮损中活性半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（caspase-3）的含量;TUNEL技术检测KC凋亡并计算凋亡指数（AI）;采用银屑病皮损面积和严重性指数（PASI）及局部病变的严重程度评分对其中26例寻常型银屑病患者予以病情程度评分。结果：30例银屑病中,脓疱型银屑病AI高于寻常型银屑病（P〈0．05）;26例寻常型银屑病患者中,进行期患者AI、活性caspase-3的含量均显著高于静止期和消退期（P〈0．05）;而静止期和消退期患者之间差别无统计学意义（P〉0．05）;PASI评分与AI及活性caspase-3含量之间均无直线相关性（P〉0．05）;银屑病皮损局部病变的严重程度评分与AI、活性caspase-3含量均呈直线正相关（P〈0．05）。结论：KC凋亡的程度与银屑病的不同型别、疾病的不同分期有关,与局部病变的严重程度有关,与银屑病病情严重性指数无关。     

角质细胞生长因子在卵巢癌细胞迁移和侵袭中的作用

目的研究角质细胞生长因子（KGF）在卵巢癌细胞系侵袭和迁移过程中的作用,进一步探讨其在卵巢癌转移和侵袭过程中的分子学机制。方法选用人类卵巢癌细胞系HO-8910PM（高转移）及小鼠NIH3T3成纤维细胞系,采用细胞划痕实验和四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）分别检测不同浓度KGF对卵巢癌细胞系迁移和增殖的影响,用Western Blot和免疫荧光法研究KGF在活化的NIH3T3中的表达,并验证IL-1β、TGF-β1以及卵巢癌细胞系的条件培养基（CM）对其表达产生的活化和诱导作用。结果细胞划痕实验结果显示,KGF对卵巢癌细胞系的迁移能力有促进作用,其中KGF 100 pmol/L组、30 pmol/L组和300 pmol/L组与对照组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。MTT实验显示,KGF对卵巢癌细胞系的增殖有促进作用,其中KGF 100 pmol/L组与对照组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。Western Blot证实IL-1β、TGF-β1及CM对KGF在成纤维细胞上的表达有诱导作用,而免疫荧光验证了IL-1β、TGF-β1及CM对成纤维细胞的活化作用。结论 KGF对卵巢癌细胞系的增殖、迁移和侵袭有促进作用,而IL-1β、TGF-β1以及CM对成纤维细胞的活化及KGF在成纤维细胞上的表达有不同程度的诱导作用。     

表皮生长因子受体反义寡核苷酸对紫外线诱导的表皮角质形成细胞c-jun 活性的影响

目的探讨表皮生长因子受体（EGF-R）反义寡核苷酸转染体外培养的表皮角质形成细胞株HaCaT后,对紫外线诱导的表皮角质形成细胞转录因子c-jun活性的影响。方法用一种高灵敏度、高特异性的比色法测定不同剂量中波紫外线（UVB）辐射后以及EGF-R反义寡核苷酸转染后紫外线辐射的角质形成细胞c-jun活性的变化;RT-PCR方法测定EGF-R反义寡核苷酸转染后EGF-RmRNA的表达。结果10、20、30mJ/cm^2 UVB辐射角质形成细胞后均可显著增强c-jun活性（P〈0.05）,不同浓度的EGF-R反义寡核苷酸转染后对30mJ/cm^2 UVB诱导的EGF-RmRNA表达和c-jun活性均有显著抑制作用（P〈0.01）。结论脂质体介导的EGF-R反义寡核苷酸转染表皮角质形成细胞可以抑制UVB辐射诱导的表皮角质形成细胞c-jun活性,表明紫外线诱导角质形成细胞c-jun激活是通过EGF-R介导的。     

角质细胞生长因子在常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿组织中的表达定位

目的：在蛋白水平研究角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF)在常染色体显性遗传性多囊肾病（autosomel dominant polycystic kidney disease,ADPKD)囊肿组织中的表达及定位。方法：分别采用蛋白质印迹及免疫组化方法分析ADPKD患者囊肿组织中KGF的表达和进行细胞定位。结果：与正常肾组织相比，ADPKD患者的囊肿组织KGF含量明显增高，约是前者的4倍，主要在囊肿衬里上皮细胞和残存的正常肾小管上皮细胞中表达.结论：KGF在ADPKD囊肿组织局部的过度表达可能是ADPKD囊肿形成和发展的重要因素之一。     

角质细胞生长因子对无排卵型功血子宫内膜上皮细胞生长与分泌CA125的影响

目的观察角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）对离体培养的无排卵型功血子宫内膜上皮细胞生长和分泌CAl25的影响。方法体外培养无排卵型功血子宫内膜上皮细胞，加入不同浓度的KGF作用后，微量噻唑蓝分析法检测细胞量，了解生长情况，磁酶免法测定CAl25分泌，分析两者之间的相关性，并与培养的正常子宫内膜上皮细胞进行比较。结果①无排卵型功血子宫内膜上皮细胞与正常子宫内膜上皮细胞的外观特征相似；CKl9免疫组化染色结果为无排卵型功血子宫内膜上皮细胞的细胞质被染成棕黄色。②不同浓度的KGF作用体外培养的无排卵型功血子宫内膜上皮细胞后，细胞增生明显，但增生程度不如正常子宫内膜上皮细胞（P〈0．05）。③不同浓度KGF作用后两组子宫内膜上皮细胞的CAl25浓度均升高，无排卵型功血子宫内膜上皮细胞的增高程度明显低于正常子宫内膜上皮细胞（P〈0．05）。④正常和功血的子宫内膜上皮细胞中二者的吸光度值与细胞培养上清液中的CAl25浓度有显著的相关性，两者的相关系数分别为0．681和0．885（P〈0．05）。结论KGF对体外培养的无排卵型功血子宫内膜上皮细胞有促进生长和分泌CAl25的作用，但促进作用的程度不如正常子宫内膜上皮细胞，提示无排卵型功血子宫内膜上皮细胞存在与正常子宫内膜上皮细胞不同的生长机制和功能，可能参与无排卵型功血的发病。     

重组人角质细胞生长因子-2对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用

目的: 研究外用旋滴重组人角质细胞生长因子-2（KGF-2）对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用,为角膜上皮损伤的早期治疗探索新方法。 方法: 制备兔角膜碱烧伤模型,60只日本大耳白兔随机分为碱烧伤对照组和KGF-2组（25 mg/L）(n=30);各组日本大耳白兔于造模后以50 μL药物滴眼,每日3次。7和14 d裂隙灯观察角膜烧伤面积以及角膜新生血管的形成,MTT法检测角膜上皮细胞活性,免疫组化方法进行病理组织学检查。结果：碱烧伤后7和14 d,KGF-2组角膜烧伤面积小于碱烧伤对照组,差异有显著性（P<0.01）。碱烧伤对照组7 d角膜新生血管发生率为17.50%,KGF-2组为7.32%;碱烧伤对照组14 d角膜新生血管发生率为41.67%,KGF-2组为32.5０%。MTT检测结果显示：碱烧伤后7和14 d,KGF-2组492 nm吸光度与碱烧伤对照组比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。碱烧伤后7和14 d,病理切片HE染色显示：对照组角膜基质水肿,板层纤维排列松散、紊乱,炎症反应反复出现,角膜上皮层变薄,部分脱落,角膜内皮层内侧有大量成纤维细胞增生;KGF-2组碱烧伤后7 d,角膜上皮细胞生长良好,基质轻度增厚,无明显的炎症反应;碱烧伤后14 d,未出现炎症复发,角膜上皮细胞生长良好,排列整齐,角膜基质仅有轻度增厚。结论：外用旋滴25 mg/LKGF-2可加速角膜上皮损伤的恢复,减轻角膜烧伤的各种炎症反应症状;减轻角膜基质水肿和纤维化,同时KGF-2 亦表现出显著的抑制角膜新生血管形成的作用;KGF-2有可能成为另一个对角膜上皮损伤具有重要调控作用的生长因子。