生长激素促进体外培养的Bel-7402肝癌细胞增殖

  【目的】 了解重组人生长激素(rhGH)对体外培养的Bel-7402肝癌细胞增殖的影响｡【方法】 应用放射性配体法了解GHR在Bel-7402肝癌细胞株的表达情况;采用肿瘤细胞计数､噻唑蓝比色法和集落形成实验了解Bel-7402肝癌细胞株在不同浓度rhGH(0､1､10､100､1 000､10 000 ng/mL)作用下的药物敏感性,计算细胞生长率,集落形成率;并用3H-TdR渗入法了解肿瘤细胞DNA代谢情况｡【结果】 放射配体法发现Bel-7402肝癌细胞表达GHR, rhGH对体外培养的7402肝癌细胞的生长具有一定程度的刺激作用,表现为rhGH在100 ng/mL的浓度时促进肝癌细胞的增殖较为显著,而rhGH在其它浓度时(1､10､1 000､10 000 ng/mL)的部分时段,对肝癌细胞的增殖虽也能表现出一定程度的促进作用,但总体效果较rhGH 在100 ng/mL浓度时为弱｡【结论】 一定浓度范围的rhGH对7402肝癌细胞的增殖有促进作用,原因可能与7402肝癌细胞表达GHR有关｡     

鳖甲煎丸含药血清对肝癌细胞Bel-7402增殖的影响及其可能机制

【立题依据及设计思路】 原发性肝癌是一种常见恶性肿瘤,探索行之有效的治疗方法,是一个亟待解决的问题。鳖甲煎丸是医圣张仲景所创,研究表明具有较好的抑制肝癌生长,防止肝癌转移的作用,但其机制不明。本实验拟观察鳖甲煎丸含药血清对肝癌Bel-7402细胞生长的影响,从细胞凋亡和肿瘤血管新生角度探讨其抗癌机制,为临床应用此方治疗肝癌提供理论与实验依据。 【实验内容】 (1)大鼠含药血清的制备;(2)MTT法检测不同剂量鳖甲煎丸含药血清对Bel-7402细胞增殖的影响;(3)流式细胞术检测含药血清对Bel-7402细胞凋亡情况;(4)蛋白质印迹法检测Bcl-2、Bax、ERK1、p-ERK、JNK、p-JNK等相关凋亡蛋白含量的变化,探讨其影响MAPK信号通路传导,促进肿瘤细胞凋亡的作用机制;(5)蛋白质印迹法检测肿瘤细胞VEGF、Delta-4、NICD等蛋白表达变化,探讨鳖甲煎丸影响VEGF-D114-Notch信号通路传导,抑制肿瘤血管生成的作用机制。 【材料】 SD大鼠、胎牛血清、中药、5-FU、相关抗体等。 【可行性】 (1)鳖甲煎丸以活血、补益、散结为主,既有攻伐之效,亦含补益之功。课题组前期在体实验证明鳖甲煎丸具有较好的抑瘤功效。血清药理学对于中药复方制剂的复杂化学成分能更好的反映药物在体内环境中产生药理效应的真实过程,在理论上具可行性。(2)课题组成员已掌握相关实验技术。(3)科研中心仪器设备能满足实验所需。 【创新性】 中药在抑制肝癌细胞增殖、控制瘤体生长等方面具有独特的优势。目前对中药抗肿瘤的研究仍以单味药或药物单体成分及临床经验方为主,而中医经典复方对肿瘤相关信号通路影响的研究则相当少见。本课题在前期鳖甲煎丸抑制S180实体瘤研究的基础上,通过体外实验观察其对人肝癌细胞Bel-7402的影响,并运用血清药理学、形态学、流式细胞术、MTT、蛋白质印迹等方法,试图从促进肿瘤细胞凋亡及阻碍瘤体内血管生成两方面,探讨鳖甲煎丸治疗肝癌的可能机制。本研究在思路上,将传统中医药理论与现代医学分子生物学理论相结合,探讨中药复方治疗肝癌机制。为中医经典复方治疗肿瘤提供理论基础。     

磁性白蛋白纳米球作为基因载体的研究

目的 制备载基因的磁性白蛋白纳米球,评估磁性白蛋白纳米球作为基因载体的可行性及体外的磁靶向性。方法 采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,分别运用透射电镜（TEM）、动态光散射分析（DLS）对其形态、粒径进行表征。应用绿色荧光蛋白基因系统（pGFP）,观察载基因磁性白蛋白纳米球体外释放基因速率的情况及转染细胞的情况。运用普鲁士蓝染色法观察磁性纳米球的体外磁靶向性。结果 载基因磁性纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在载基因磁性纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。DLS显示载基因免疫磁性纳米球的水合粒径约为209nm。体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料13h释放基因为95.25%,曲线平缓;转染实验结果显示载基因磁性纳米球能够有效转染SMMC-7721细胞,且转染效率高于载基因纳米球。普鲁士蓝染色实验结果显示磁靶向组细胞内的铁颗粒明显多于非靶向组。结论 成功制备了载基因磁性白蛋白纳米球,具有缓释基因的作用,并且能高效转染人肝癌细胞SMMC-7721。磁性白蛋白纳米球基因载体具有体外靶向性,有望作为一种潜在的靶向基因载体应用到生物医学领域。     

MNPs-exosomes联合载药系统的制备及其在肿瘤治疗中的可行性探索

【立论依据】 药物靶向输送系统在肿瘤治疗中至关重要。磁性纳米颗粒(MNPs)可在外磁场引导下使其负载药物定向于肿瘤组织,达到肿瘤化疗中低毒高效的目的。然而,它的非生物源性使它不能在体液和组织中稳定地存在。Exosomes是一种由体内多种细胞释放的、直径介于50~150纳米的微囊体。因不引起补体或凝血因子的激活,以及难以被单核巨噬细胞吞噬,故可以在体内稳定存在,也是药物的理想载体。但由于靶向性较弱,难以富集至肿瘤组织。 【设计思路】 本项目拟设计并制备MNPs-exosomes二者联合的载药系统,以达到优势互补的效果,并通过体内外实验探讨其是否具有协同效应,从而为构建肿瘤靶向给药系统提供一种新思路。 【实验内容】 (1)制备3种药物载体:MNPs、exosomes、MNPs-exosomes联合载药体;(2)将3种药物载体分别与药物结合:选用多柔比星;(3)体内外实验验证其靶向性;(4)体内外实验评价其治疗效果。 【材料】 RAW-264.7细胞、HEPG-2细胞、MNPs、四氧化三铁悬液、250nm二氧化硅粒子悬液、聚苯乙烯、甲苯。 【可行性】 本课题组已进行了制备MNPs-exosomes联合载药体的预实验,实验结果符合预期。在以往的研究中,我们已经掌握了进行上述实验所需要的技术和方法,具备一定的科研悟性和热情,可以完成此研究。 【创新性】 (1)首次提出将MNPs与exosomes联合载药,通过二者的优势互补,来观察联合体是否具有协同作用;(2)我们拟通过制作超小粒径分子筛分离提纯exosomes,避免了传统方法的弊端。     

靶向/促穿膜双功能肽介导的肿瘤靶向基因递送系统的构建及其抗肿瘤作用研究

【立论依据】 基因治疗(gene therapy)现已成为攻克肿瘤最具潜力,也是研究最活跃的领域,许多学者为基因治疗能成功应用于临床进行了大量相关研究。要成功地实施基因治疗,必须具备3个关键因素:针对性的治疗基因;基因传递系统;基因表达调节系统。基因传递系统是基因治疗的核心技术,而转染效率与细胞毒性相矛盾、稳定性与穿膜能力相矛盾以及靶向性差,是基因递送系统存在的3个关键问题。本课题旨在为肿瘤的基因治疗寻找到一种兼具高转染效率、高肿瘤细胞和组织特异靶向性及良好安全性和体内外稳定性的基因递药系统。 【设计思路】 首选通过将低分子量聚乙烯亚胺(LMW-PEI)连接到能形成单分子聚合物胶束的普朗尼克(Pluronic)表面,制得PEI衍生物;然后采用固相法合成兼具靶向和促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),其中DR5短肽对正常细胞无毒副作用、对肿瘤细胞具有高特异性和高选择性且自身具有抗肿瘤活性,TAT是具有促细胞穿膜作用的穿膜肽;再利用SMCC法将D21与Pluronic-PEI偶联,构建肿瘤靶向纳米基因载体递送系统(D21-Pluronic-PEI),并对其体内外性能进行评价。 【实验内容】 (1) Pluronic-PEI的合成,DNA/Pluronic-PEI纳米胶束的制备及其性能考察;(2) D21-Pluronic-PEI的构建及其性能考察; (3)载p53的靶向纳米非病毒基因给药系统 (p53/D21-Pluronic-PEI)的制备及其体内靶向特性和抗肿瘤效果评价 【材料】 分支状聚乙烯亚胺Pluronic 123 (Mw=2000 Da),DR5短肽,细胞穿膜肽TAT,p53等。 【可行性】 项目组有一定的专业基础,具有较强的创新意识和研究探索精神,具备开展该项目的素质与能力。该实验设计思路新颖、制定的项目方案切实可行,具有可靠的实施条件,可以保证该训练计划实施成效。项目组所在学校对学生实践创新及实验实训一贯积极支持和鼓励,匹配经费到位,配套扶持政策完善。因此,项目开展所需的人员、场地、实验设备、材料和经费等条件均可以保证。 【创新性】 (1)本课题拟采用不同PO/EO比的Pluronic连接低分子量PEI,并在此基础上合成具有可实现肿瘤靶向和具促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),将其与所得的PEI衍生物偶联,得到高效、低毒的新型基因靶向载体系统 (D21-Pluronic-PEI),该研究国内外尚未见报道。(2)重组人p53腺病毒注射液已应用于临床,但该药选择的载体为病毒基因载体-5型腺病毒,本课题拟采用高效,低毒且可主动靶向肿瘤细胞的新型聚阳离子载体系统(D21-Pluronic-PEI)作为p53载体,拟为p53的应用开辟新途径,国内外未见相关报道,具有潜在的应用价值。     

六味地黄丸入血成分增效自杀基因杀伤肝癌细胞的缝隙连接机制

【目的】探讨六味地黄丸主要入血成分处理的淋巴上清对大鼠肝癌细胞CBRH7919缝隙连接功能的影响,以期阐明其增强自杀基因疗法杀伤肝癌细胞效应的作用机制。【方法】取大鼠脾淋巴细胞,加入六味地黄丸的5种主要入血成分,体外培养后取含药淋巴上清,采用流式细胞术结合荧光示踪法分析其对细胞缝隙连接通讯功能(GJIC)的影响;利用Western blot法检测含药淋巴上清对大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响;利用GJ阻滞剂甘草次酸(GA)观察阻滞GJIC后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用的影响。【结果】流式细胞术结合荧光示踪法结果表明,占培养液15%(体积分数)的含药淋巴上清能促进大鼠肝癌CBRH7919细胞的GJIC功能;Western blot法结果显示,含药淋巴细胞上清能提高大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白的表达水平;GA阻断GJIC功能后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用降低。【结论】六味地黄丸入血成分处理的淋巴上清可通过缝隙连接机制发挥对自杀基因杀伤大鼠肝癌细胞的增效作用。     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达.MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用.结果 成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV 可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响.结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞.     

携反义基质金属蛋白酶-2的重组腺病毒对肝癌生长的影响

目的探讨携带反义二型基质金属蛋白酶（MMP2）基因的重组腺病毒（Ad-MMP2^AS）对人肝癌细胞株（Bel-7402）体外侵袭性和人肝癌动物模型生长的抑制作用。方法用已构建的Ad-MMP2^AS感染人肝癌细胞株（Bel-7402）,用侵袭小室模型检测Ad-MMP2^AS对Bel-7402细胞降解人工基底膜的抑制作用;用Western Blot和明胶酶谱检测Ad-MMP2^AS对Bel-7402细胞分泌MMP2的影响;用感染了Ad-MMP2^AS的Bel-7402细胞接种于裸鼠皮下,使其在裸鼠体内成瘤,以观察其成瘤能力;用Ad-MMP2^AS瘤内注射,以观察它对肝癌生长的抑制作用。结果Ad-MMP2^AS感染的Bel-7402细胞分泌MMP2被抑制、穿过人工基底膜Matrigel的Bel-7402细胞数下降52％、感染Ad-MMP2^AS的Bel-7402细胞的成瘤量下降4．3倍,Ad-MMP2^AS瘤内注射后瘤体生长减少63％。结论Ad-MMP2^AS能明显抑制肝癌的生长,对肝癌有治疗潜力。     

探讨苯并吲哚荧光标记的2-脱氧-D-葡萄糖的设计合成及其在肿瘤糖代谢的应用

【立论依据】 代谢改变是肿瘤的重要特征之一,其与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤细胞无论在有氧或无氧条件下,均需通过糖酵解(glycolysis)途径吸收大量的葡萄糖产生能量,满足快速生长需求,肿瘤细胞的这一代谢特点是肿瘤细胞具有的普遍现象和规律,被称为Warbrug效应。基于上述效应和系列研究工作基础,采用光稳定性好的苯并吲哚类荧光探针对2-脱氧-D-葡萄糖进行标记并在体内外评价其对肿瘤的靶向成像能力,考察肿瘤在体内的转移情况及治疗效果,从而为肿瘤检测和评估治疗效果提供一个新型检测探针。 【设计思路】 在新型苯并吲哚类荧光探针光稳定好以及肿瘤组织中存在异常旺盛的无氧葡萄糖酵解现象的基础之上,将苯并吲哚类荧光探针对2-脱氧-D-葡萄糖进行标记,设计合成苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物,探讨其在肿瘤糖代谢方面的应用。 【实验内容】 拟合成苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物,采用NMR、IR光谱及质谱表征苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物的化学结构和纯度,测定其理化特性,细胞毒性、生物相容性和体外细胞的荧光成像性能,评价其在活体动物内的光学成像能力,并通过肿瘤组织的免疫荧光病理检查,证实在体内肿瘤组织位置。 【材料】 1,1,2-三甲基-1氢-苯并吲哚,4-甲醛基苯甲酸,无水乙醇和醋酸铵,二氯甲烷,2-脱氧-D-葡萄糖。 【可行性】 前期研究和预实验结果表明苯并吲哚类荧光染料具有良好的光稳定性、合适的水溶性及很好的细胞膜通透性, 而且在细胞内具有较强的荧光。这类染料的合成非常简单, 收率高,基于苯并吲哚类染料的荧光探针,并成功地将其用应用于活细胞荧光成像为本课题核心假设的提出奠定了重要的理论和实验基础。 【创新性】 新型的苯并吲哚类荧光标记的葡萄糖类似物:(1)光稳定性好;(2)可通过葡萄糖靶向介导作用,实现主动靶向介导内吞;(3)能够示踪肿瘤细胞是否发生转移及其治疗效果,是应用于检测动物实验肿瘤转移模型的最佳标记物。     

siRNA介导核干因子基因沉默抑制肝癌细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 核干因子(nucleostemin, NS)是最近发现的一个GTP结合蛋白,在神经干细胞、胚胎干细胞以及某些肿瘤细胞中均有表达。NS在多种肿瘤细胞增殖和凋亡调控中具有重要作用,然而其在肝癌中的作用尚未清楚。本研究通过检测其在不同肝癌细胞系和组织中的表达,并利用siRNA干扰技术,以探究NS在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用。 【方法】 以肝癌组织和多种肝癌细胞系为研究对象,首先通过定量PCR及蛋白质印迹法分析细胞及肝癌组织中NS的表达。接着通过siRNA瞬时转染的方法降低NS的表达,并通过定量PCR和蛋白质印迹法检测干涉效果,利用MTT试验和细胞增长实时监控技术检测细胞增殖情况,流式细胞术探究紫外线(ultraviolet, UV)或血清饥饿诱导下细胞凋亡情况。 【结果】 蛋白质印迹及定量PCR结果显示NS在多种肝癌细胞系及肝癌组织中都有较高的表达,且在MHCC97H和Bel7402细胞中,MTT试验和细胞增长实时监控显示降低NS的表达能够抑制细胞增殖,流式细胞术和蛋白质印迹结果显示NS基因沉默能够促进UV和血清饥饿诱导的细胞凋亡。即NS可能具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。 【结论】 NS在肝癌组织和细胞中都有较高的表达,在MHCC79H和Bel7402细胞中,降低NS表达可抑制细胞增殖,促进UV及血清饥饿诱导的细胞凋亡。     

针对肝癌化疗耐药的多靶标siRNA的构建和功能鉴定

【立论依据】 肿瘤耐药机制复杂多样,是多基因,多步骤综合作用的结果,仅使用单一阻断的方法,尚不能取得令人满意的逆转效果。因此,针对肝癌多种耐药机理,设计和构建能降低肝癌细胞化疗耐药性的新型纳米药物是改善肝癌药物治疗效果的关键科学问题。近年来韩国科学家Dong-Ki Lee构建了一种可同时靶向4个癌基因(Survivin、β-catenin、STAT3、MET)的,由4个RNA双螺旋组成的四聚体RNAi(quadruple interfering RNAs, qiRNA),其转染效率和干扰效率优于传统的siRNA。 因此,本项目拟采用该策略,针对肝癌细胞膜上固有的高表达ABC蛋白和肝脏独特的代谢解毒机制以及肝癌干细胞的耐药机制,选取了4个多药耐药相关的关键基因:编码细胞膜上ABC转运蛋白的MDR1基因、参与肝细胞解毒功能的谷胱甘肽转移酶基因-GST pi、抑制细胞凋亡的Survivin基因和参与肝癌干细胞“干性”维持的Snail基因,将其构建成四合一的四聚体qiRNA;采用肝癌细胞耐长春新碱(VCR)耐药株(SMMC7721/VCR)作为多药耐药细胞,通过观察转染四聚体qiRNA后各个靶基因的表达情况以及细胞增殖、细胞凋亡和瘤体抑制率的变化,以评价四聚体qiRNA对改善肝癌细胞耐药性的效果。 【设计思路】 本项目围绕着降低肝癌化疗耐药性的科学问题,设计和构建针对肝癌不同耐药基因和信号通路的多靶点RNAi药物,并在细胞水平上检测其靶基因的干扰效率及肝癌耐药株细胞耐药性的改变,试图获得有效降低肝癌化疗耐药性的新型多聚siRNA,为开发新型的多靶点抗肿瘤药物奠定基础。 【实验内容】 (1)肝癌多药耐药相关基因siRNA序列的筛选。(2)多聚siRNA的构建与表征。(3)jetPEI介导多聚siRNA的抗肿瘤活性评价。 【材料】 肝癌药物敏感细胞株SMMC7721及肝癌耐长春新碱细胞株SMMC7721-VCR,qiRNA或NC序列的合成由广州瑞博生物有限公司完成。其他常规试剂实验室都有储存。 【可行性】 该实验设计思路新颖、制定的项目方案切实可行,项目组所在学校对学生实践创新及实验实训一贯积极支持和鼓励,匹配经费到位,配套扶持政策完善。因此,项目开展所需的人员、场地、实验设备、材料和经费等条件均可以保证。 【创新性】 (1)本课题首次构建一种新型的多靶点的单一多聚siRNA制剂。(2)课题组首次获得有效降低肿瘤多药耐药性的多靶点siRNA分子。     

正电荷载基因纳米微泡的超声成像及靶向杀伤肝癌细胞的研究

目的：制备载基因纳米微泡并探讨其体内外超声成像和靶向杀伤肝癌细胞的效果。方法：采用薄膜水化?机械震荡法制备磷脂为壳膜、六氟化硫（suphurhexafluoride,SF6）气体为核心的正电荷纳米微泡,再偶联甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）启动子的单纯疱疹病毒胸苷激酶（simplex herpes virus thymidine kinase,HSV?TK）质粒DNA制备载基因纳泡。对其形态、平均粒径、zeta电位、DNA结合力、基因转染进行检测;然后对其体内外超声成像特性进行考察;最后采用CCK?8和流式细胞（FCM）分析检测载基因纳泡联合超声靶向微泡击破（ultrasound?targeted microbubble destruction,UTMD）技术对BEL?7402和SMCC?7721细胞的杀伤作用。结果：电镜显示纳泡呈圆球形壳核结构;平均水合粒径约为667 nm,带正电;琼脂糖凝胶电泳显示质量比≥5时,纳泡可有效结合质粒DNA;体内外超声显示载基因纳泡具有良好的超声对比增强特性;RT?PCR检测显示纳泡联合UTMD能使HSV?TK在AFP阳性肝癌细胞内表达。CCK?8 和FCM分析显示载基因纳泡+UTMD组能显著抑制BEL?7402细胞的增殖和诱导其凋亡,与其他组相比差异具有显著性（P < 0.05）。结论：具有良好超声成像功能的载基因纳泡能够高效靶向杀伤AFP阳性的肝癌细胞。     

生长激素促进体外培养的Bel-7402肝癌细胞增殖

【目的】了解重组人生长激素（rhGH）对体外培养的Bel-7402肝癌细胞增殖的影响。【方法】应用放射性配体法了解GHR在Bel-7402肝癌细胞株的表达情况;采用肿瘤细胞计数、噻唑蓝比色法和集落形成实验了解Bel-7402肝癌细胞株在不同浓度rhGH（0、1、10、100、1000、10000ng／mL）作用下的药物敏感性,计算细胞生长率,集落形成率;并用,H—TdR渗入法了解肿瘤细胞DNA代谢情况。【结果】放射配体法发现Bel-7402肝癌细胞表达GHR,rhGH对体外培养的7402肝癌细胞的生长具有一定程度的刺激作用,表现为rhGH在100ng／mL的浓度时促进肝癌细胞的增殖较为显著,而rhGH在其它浓度时（1、10、1000、10000ng／mL）的部分时段,对肝癌细胞的增殖虽也能表现出一定程度的促进作用,但总体效果较rhGH在100ng／mL浓度时为弱。【结论】一定浓度范围的rhGH对7402肝癌细胞的增殖有促进作用,原因可能与7402肝癌细胞表达GHR有关。     

应用SELDI-TOF-MS技术筛选人肝癌细胞多药耐药相关差异表达蛋白

【目的】通过SELDI-TOF-MS技术筛选体外培养人肝癌细胞多药耐药相关差异表达蛋白。【方法】采用体外培养人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶细胞Bel-FU,MTT法检测Bel-FU的多药耐药性;SELDI-TOF-MS技术结合CM-10芯片检测Bel-7402与Bel-FU蛋白质指纹图谱。【结果】细胞Bel-FU对于5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素、柔红霉素的耐药指数分别为:89.6倍、3.9倍、37.2倍、16.5倍、3.7倍。在质荷比(M/Z)2 000～50 000的范围内,Bel-FU与Bel-7402间共检测到8个差异蛋白(P<0.05),其中上调蛋白有3个,下调蛋白有5个。【结论】SELDI-TOF-MS技术为筛选肝癌MDR蛋白标志物提供了一个简便、有效的方法。     

靶向脐带间充质干细胞的构建及其在小鼠脾脏内的定位

目的 构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体, 用携带P1-GFP融合基因的慢病毒感染MSC, 使MSC具有靶向性, 将靶向MSC注入小鼠体内后观察MSC在小鼠脾脏的定位及与淋巴细胞的关系。方法 用组织片贴壁法培养健康人脐带间充质干细胞, 用基因工程技术构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体并感染人脐带间充质干细胞, 通过尾静脉将转入P1-GFP融合基因的MSC注入小鼠体内, 18 h后免疫组化染色观察GFP在小鼠脾脏的定位。 结果 培养的健康人脐带间充质干细胞生长良好, MSC感染含P1-GFP融合基因的慢病毒18 h后MSC开始出现绿色荧光, 随着培养时间的延长, 荧光强度逐渐增强, 72 h达高峰。靶向MSC表达髓系干细胞的表面标记 CD105(90.0%)/CD44(98%),CD73(85.0%)/CD90(98.5%)。将靶向MSC经尾静脉注入小鼠体内, 18 h后小鼠脾脏出现大量GFP阳性细胞, 并与脾脏淋巴细胞密切接触。结论 本研究成功构建了含P1-GFP融合基因的靶向MSC, 靶向MSC成功定向脾脏, 并与脾脏淋巴细胞密切接触, 可用于后续的实验研究。     

Ad-VEGFP-CD/TK系统抑制乳腺癌细胞增殖的体内外实验研究

目的 探讨腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CD/TK)对乳腺癌细胞MCF-7的体内外靶向杀伤作用.方法 用重组腺病毒Ad-VEGFP-CD/TK体外感染表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染率,然后给予前药GCV和5-FC,用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响及其旁观者效应;用流式细胞术观察细胞周期及细胞内DNA含量的变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad-VEGFP-CD/TK,腹腔注射前药14 d,观察肿瘤生长抑制效应.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似.MTT法检测显示MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而乳腺上皮细胞对前药不敏感,且观察到该体系对MCF-7细胞明显的旁观者效应.在感染复数为100时,用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中,该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的生长.结论 VEGF启动子可调控双自杀基因体系选择性杀伤人乳腺癌细胞MCF-7并诱导细胞凋亡,并可显著抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长.     

肝癌细胞株Bel-7402中侧群细胞的分离和致瘤能力

【目的】 分选肝癌Bel-7402细胞中的侧群(SP)细胞并分析其生物学特性?【方法】 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将Bel-7402细胞分为SP细胞和非侧群(NSP) 细胞2亚群?实验分组:SP组与NSP组?细胞生长曲线法和平板克隆法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力和克隆形成能力;RT-PCR法检测SP细胞和NSP细胞的CD133?三磷酸腺苷结合盒转动蛋白G2(ABCG2)表达;流式细胞术分析细胞凋亡率;无血清培养法检测SP细胞及NSP细胞成球率;非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内成瘤实验比较SP细胞和NSP细胞的致瘤性?【结果】 Bel-7402细胞中分选出的SP细胞比例为(2.4 ± 0.0)%?生长曲线表明SP细胞的增殖速度快于NSP细胞(P < 0.05)?SP?NSP细胞的克隆形成率分别为(20.5 ± 2.6)%?(5.1 ± 0.9)%,两者差异明显(P < 0.05)?SP细胞ABCG2 mRNA和CD133 mRNA平均表达水平分别是NSP细胞的3.03倍(P < 0.01)和1.98倍(P < 0.01)?SP细胞凋亡率为(0.89 ± 0.23)%,低于NSP细胞 (P < 0.05)?在无血清培养基中,SP细胞成球率为(14.1 ± 1.9)%,高于NSP细胞(P < 0.05)?1 × 103?104?105数量的SP细胞形成皮下移植瘤(P > 0.05,P < 0.05,P < 0.05),而1 × 105 NSP细胞则还不能成瘤?【结论】 肝癌 Bel-7402细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞?     

叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA在裸鼠体内靶向治疗作用的初步研究

目的研究叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN基因小干扰性RNA在神经母细胞瘤裸鼠骨髓、骨转移模型中的靶向性及治疗作用。方法 16只成功建立神经母细胞瘤骨髓、骨转移模型的裸鼠,将其随机分为靶向性研究组（4只）和疗效性研究组（12只）。靶向性研究组裸鼠静脉给予CY3荧光标记叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA,荧光显微镜检测CY3在体内瘤组织及重要器官的荧光强度。疗效性研究组12只裸鼠随机分MYCN siRNA组和无关siRNA组,静脉分别给予叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA与叶酸脂质体包裹的无关siRNA,采用荧光定量PCR检测肿瘤组织MYCN mRNA表达,原位细胞凋亡检测法（TUNEL）观察肿瘤细胞凋亡数。结果 CY3荧光标记的叶酸脂质体MYCN siRNA给药8 h后,荧光主要分布在肿瘤组织内,MYCN siRNA组瘤组织中MYCN mRNA的表达量明显较无关siRNA组降低（P〈0.05）,MYCN siRNA组凋亡细胞数量高于无关siRNA组（P〈0.05）。结论①叶酸脂质体MYCN siRNA经静脉给药后主要靶向瘤组织,叶酸脂质体是肿瘤基因治疗的有效载体;②叶酸脂质体MYCNsiRNA在体内显著下调肿瘤MYCN mRNA的表达,促进肿瘤细胞凋亡,有望成为神经母细胞瘤治疗的新药物。     

骨髓间充质干细胞两种示踪方法的优缺点比较

  【目的】 探讨荧光染料CM-DiI直接标记和慢病毒感染法EGFP标记人骨髓间充质干细胞(hMSC)用于体内示踪的优缺点&#65377;【方法】 利用FUGW质粒构建携带EGFP基因的慢病毒载体,并感染P3代hMSC,荧光倒置显微镜下观察细胞的感染效果及传代前后细胞EGFP表达情况的变化;CM-DiI直接标记P3代hMSC,观察CM-DiI 标记对细胞生物学特性的影响及传代前后细胞标记效果的变化&#65377;分别将CM-DiI和EGFP标记的P3代hMSC移植入新生大鼠左侧脑室,2周后取大鼠脑组织行冰冻切片,比较两种标记方法用于体内示踪的效果&#65377;【结果】 慢病毒感染hMSC 48 h后,约40%细胞表达绿色荧光,体外培养1个月,EGFP阳性细胞数增至50%左右,荧光强度基本保持不变,细胞生长不受病毒转染的影响&#65377;CM-DiI标记hMSC 12 h后,95%以上细胞呈现很强的红色荧光,1个月后,阳性细胞减少至50%左右,荧光强度也有一定程度降低,未见染料对细胞形态和生长产生明显影响&#65377;CM-DiI标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片可以找到红色荧光的标记细胞, EGFP标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片未找到绿色荧光细胞&#65377; 【结论】 CM-DiI和EGFP均可在体外高效标记hMSC,但CM-DiI 标记的hMSC体内示踪效果优于EGFP标记&#65377;     

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的：探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。 方法：构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。 结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高（P<0.001）,细胞周期各期细胞数有所减少（P<0.05）。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,［HRE］hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低（P<0.01）,诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高（P<0.01）,G₁期和^G0期细胞数有所增高（P<0.05）,S期细胞数减少（P<0.05）。结论：HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。