应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒E1蛋白反式激活基因

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)E1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVE1蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVE1表达质粒pcDNA3 .1( -) E1转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( -)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成 2组 ,分别与 2种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果　成功构建人HCVE1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 89个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 10 0 10 0 0bp插入片段。挑取 46个含有插入片段的阳性克隆测序分析 ,获得 44个已知基因序列和 2个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录。结论　应用SSH技术成功构建了HCVE1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE1反式调节的靶基因及致肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据     

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA，克隆HCV-F蛋白反式激活相关基因。方法 以HCV-F表达质粒pcDNA3．1（-）-F转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HcVF蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000bP插入片段的克隆，随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，其中2个为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HBV XTP12蛋白反式激活基因的上调基因

目的 克隆并筛选乙型肝炎病毒(HBV)反式激活基因XTP12的上调基因,了解其可能存在的调节功能.方法 应用抑制性消减杂交技术克隆并筛选XTP12反式激活的新型靶基因.以XTP12表达质粒pcDNA3.1(-)-XTP12转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果 成功构建人XTP12反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000 bp插入片段.随机挑选其中28个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果 共获得28种编码基因,其中26种为已知基因编码蛋白,2种为未知功能的新基因.结论 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞牛长调节、物质代谢、免疫及肿瘤等密切相关的蛋白编码基因,推测了XTP12可能存在的调控机制的线索.     

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒全S蛋白反式激活基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBV全S蛋白反式激活相关基因.方法以HBV全S表达质粒pcDNA3.1(-)-全S转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果成功构建人HBV全S蛋白反式激活基因差异表达的cD-NA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取35个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得33个已知基因序列,和2个未知基因,通过生物信息学分析获得其全长序列,其中之一命名为全S蛋白反式激活基因1(CSTP1),已在GenBank中注册,注册号:AY553877.未知基因的功能还正在研究中.结论应用SSH技术成功构建了HBV全S反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBV全S反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.     

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白的反式激活基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(TP)反式激活基因的差异表达的cDNA消减文库，克隆TP反式激活相关基因。方法 以TP表达质粒pcDNA3．1(-)-TP转染HepG2细胞，以空载休peDNA3，1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsal酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落聚合酶链反应(PCR)分析，得到34个200-1000bp插入片段。对所得片段测序，并进行同源性分析，显示14种己知基因编码蛋白和1种未加功能基因序列，可能是TP反式激活靶基因。结论 成功构建乙型肝炎病毒TP反式激活基因差异发达的cDNA消减文库，为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活的相关基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆前-S1反式激活相关基因,以期发现前-S1蛋白反式激活作用的靶位点,为阐明前-S1蛋白的反式激活作用的分子生物学机制,以及HBV相关肝细胞癌(Hcc)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向。方法以HBV前-S1表达质粒pcDNA3．1(-)-preS1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌DH5a进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到67个阳性克隆,经菌落PCR分析,得到51个200～1000bp插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得32种编码基因,其中26个为已知功能基因,另外6个为未知功能序列,可能是前-S1蛋白反式激活新的靶基因。结论成功构建HBV前-S1反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。为进一步阐明前-S1蛋白反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法。     

应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP4反式激活基因

目的：应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆NS5A-TP4反式激活相关基因，了解该基因的可能生物学功能。方法：以NS5A-TP4表达质粒pcDNA3．1(-)-TP4转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照；制备转染后的细胞裂解液，从总RNA中提取mRNA并逆转录为cDNA，经RSaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR)，将产物与pGEM-Teasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果：成功构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到63个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的36个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得20种已知功能基因序列和5个未知功能基因。结论：应用SSH技术成功构建了NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为阐明NS5A-TP4生物学功能提供理论依据。     

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCV NS2蛋白的反式调节基因.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)-NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析.结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3, GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α-2-HS-糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled-coil-helix结构的新蛋白、未知功能基因.结论:成功构建HCV NS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索.     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒 E2蛋白反式调节基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVE2蛋白反式调节相关基因。方法以HCVE2表达质粒pcDNA3.1(-)_E2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCVE2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到78个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100～1000bp插入片段。挑取38个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得35个已知基因序列和3个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列,其功能正在研究中。结论应用SSH技术成功构建了HCVE2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE2反式调节的靶基因及致慢性肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据。     

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1的反式调节基因

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1反式激活的新型靶基因．方法:以HBV DNAPTP1表达质粒pcDNA3．1(-)- DNAPTP1 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建 cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果:成功构建DNAPTP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库．文库扩增后得到60个白色克隆,经菌落PCR分析,得到32个200-1 000 bp插入片段．对所得片段测序,并进行同源性分析,获得3个差异表达的已知蛋白基因和4个未知功能的染色体序列．结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了DNAPTP1可能存在的调控机制的线索．     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

人单核细胞泡沫化敏感候选基因的筛选

为克隆调控单核细胞源性泡沫细胞形成的相关基因 ,采用抑制消减杂交法筛选U937细胞经氧化型低密度脂蛋白温育形成泡沫细胞后差异表达的基因。经过正向、反向两轮消减杂交和巢式聚合酶链反应扩增 ,获得了富集的差异表达的cDNA片段 ,即表达序列标签 ,克隆化后挑选经鉴定含有插入片段的质粒测序。经Genbank数据库进行同源比较 ,获得 2 0余个差异表达的EST ,其中 2个克隆FRG4和FRG1 4只有片段同源序列而无全长同源序列 ,提示可能来自新基因。Genbank登录号为 :FRG4(BI 50 2 586)和FRG1 4 (BI 50 2 587)。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法：以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-pre-S1转染HepG2细胞．以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果：对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白2(PS1TP2),已在GenBank中注册,注册号：AY426673。PS1TP2基因的编码序列全长为573个核苷酸(nt),编码产物由190个氨基酸残基(aa)组成。结论：HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要作用,最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,从而改变宿主正常的免疫应答水平,引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶中核糖核酸酶RNase H反式调节基因DNAPTP4的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒(HBV)核糖核酸酶RNaseH蛋白反式激活基因差异表达的cDNA,克隆RNaseH反式激活相关靶基因。方法以RNaseH表达质粒pcDNA31(-)RNaseH转染HepG2细胞,以空载体pcDNA31(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,其未知基因片段通过Kozak规则和多聚腺苷酸信号序列,初步确定。以逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实。结果该新基因被命名为DNAPTP4,在GenBank中注册,注册号为AY450392。DNAPTP4基因的编码序列全长为828个核苷酸(nt),编码产物由276个氨基酸残基(aa)组成。结论应用SSH技术成功筛选与克隆RNaseH反式激活新型靶基因DNAPTP4,为进一步阐明RNaseH反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法。     

HBV X蛋白反式调节基因XTP11的克隆化研究

目的:应用寡核苷酸基因芯片技术及生物信息学分析,筛选并克隆乙肝病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA 3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA 3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行寡核苷酸基因芯片分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索和比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从转染了pcDNA 3.1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:该新基因命名为XTP11,在GenBank中注册,注册号为AY740520.该基因的编码序列全长为1 344个核苷酸(nt),编码产物由448个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBxAg反式激活新型靶基因XTP11的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制奠定基础.     

胆固醇诱导血管内皮细胞基因的差异表达

为探讨高胆固醇致动脉粥样硬化的分子机理，利用抑制消减杂交技术克隆胆固醇诱导脐静脉内皮细胞产生的差异表达基因，并对其表达进行初步研究。经顺、反两向消减杂交和巢式聚合酶链反应扩增，获得了差异表达的cDNA片段，克隆化后挑选部分进行测序、同源性比较及应用半定量逆转录－聚合酶链反应分析部分差异基因的表达情况，得到23个差异表达的cDNA片段，其中6个新差异表达cDNA片段被GenBank接受。已知基因中的血小板反应蛋白1和蛋白酶体亚单位基因表达的改变可能与高胆固醇致动脉粥样硬化作用相关。     

NS5A-TP5蛋白结合蛋白1的基因克隆化研究

目的 :应用酵母双杂交技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆NS5A TP5蛋白结合蛋白基因1(NBP1)。方法 :应用酵母双杂交系统 3 ,构建NS5A TP5诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y 187进行配合 ,于涂有x α gal营养缺陷型培养基 (SD/Trp Leu His Ade)上筛选生长。 结果 :挑选蓝色克隆 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序 ,然后进行生物信息学分析 ,新基因的开放读码框架长度为 2 40个核苷酸 (nt) ,编码产物由 79个氨基酸残基 (aa)组成 ,命名为NBP1,GenBank注册号为AY 45 92 91。结论 :NBP1的筛选与克隆 ,可为进一步研究HCVNS5A TP5蛋白相互作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础     

抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP13 蛋白的上调基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5ATP13蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5ATP13蛋白反式激活靶基因。方法 以HCV NS5ATP13表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5ATPl3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCV-NS5ATPl3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到102个白色克隆，进行菌落PCR分析，其中96个均得到100～1000bp插入片段。挑取40个插入片段测序分析，其中2个cDNA片段为未知序列，通过生物信息学分析获得其全长序列，已被GenBank收录，另有34个为已知功能序列。结论成功筛选出2个新的cDNA序列，并获得其全长序列，可能为HCV NS5ATPl3蛋白反式激活相关靶基因。