转化生长因子β1对肌成纤维细胞膜型基质金属蛋白酶1的影响

目的观察转化生长因子β1（TGF-β1）对鼠肌成纤维细胞（C2C12细胞）分泌膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）的影响,探讨其内在机制。方法用不同浓度的TGF-β1（0、1、5、10ng/mL）干预C2C12细胞5h,200pmol/L siRNA-smad3转染C2C12细胞24h,用Western blot和Northern blot方法测定MT1-MMP及其mRNA表达。结果0、1、5、10ng/mLTGF-β1干预C2C12细胞5h,Western blot半定量检测MT1-MMP的结果分别为2.86±0.28、2.05±0.31、1.60±0.21、1.02±0.24,F=224.9,P〈0.01;Northern blot定性结果显示,mRNA条带显示逐渐变弱。5ng/mLTGF-β1干预C2C12细胞4、12、24h,Western blot半定量检测结果分别为1.02±0.29、0.80±0.21、0.4±0.12,各时间点值比较,均P〈0.05。Northern blot定性结果显示,mRNA条带显示随时间延长而逐渐变弱。200pmol/L siRNA-smad3转染C2C12细胞24h,再用5ng/mLTGF-β1干预C2C12细胞5h,半定量Western blot检测结果显示：内对照组0.82±0.12（siRNA-control＋5ng/mLTGF-β1）、空白对照组1.61±0.21（siRNA-control）、实验组1.84±0.23（siRNA-Smad3＋5ng/mLTGF-β1）,内对照组和实验组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;Northern blot定性结果显示：MT1-MMPmRNA表达在实验组和空白对照组较强,而内对照组较弱。结论TGF-β1抑制鼠C2C12细胞分泌MT1-MMP,呈剂量和时间依赖性;siRNA阻断Smad3表达可消除TGF-β1对MT1-MMP的抑制作用。     

TGF-β1 shRNA真核表达质粒抑制人肺成纤维细胞TGF-β1的表达

目的:观察构建成功的三个针对人转化生长因子β1(TGF-β1)的小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒抑制人肺成纤维细胞TGF-β1的表达.方法:将真核表达载体psiSTRIKE-RNAi1、psiSTRIKE-RNAi2、psiSTRIKE-RNAi3和对应的阴性对照载体经酶切鉴定和测序分析后,以Lipofectamine2000介导转染人肺成纤维细胞,48小时后应用实时荧光定量PCR检测人肺成纤维细胞TGF-β1 mRNA的表达并用ELISA检测细胞上清液中TGF-β1蛋白质的浓度.结果:重组质粒经酶切和DNA测序证实插入片段的碱基序列与预期设计一致.转染组细胞TGF-β1表达受到明显抑制,以psiSTRIKE-RNAi2的抑制效应最为显著(P＜0.01).结论:三个针对TGF-β1shRNA的重组质粒均能抑制TGF-β1在人肺成纤维细胞中的表达.     

RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β1刺激后胶原合成的影响

目的 体外构建结缔组织生长因子(CTGF)序列特异性小干扰RNA表达载体,转染导人后研究其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKFs)胶原蛋白分泌的影响.方法 体外构建CTGF序列特异性小干扰RNA质粒表达载体,Dosper脂质体转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后,观察加入10 ng/mL剂量的转化生长因子(TCF-β1)刺激前后胶原蛋白水平的变化.结果 转染小干扰RNA质粒后,胶原蛋白分泌水平降为正常表达的51.6%;经TGF-β1刺激后,蛋白表达仍无明显变化.结论 小干扰RNA质粒表达载体可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原蛋白分泌,为临床上瘢痕疙瘩的基因治疗提供理论依据.     

缺氧对肺动脉成纤维细胞MMP-2、TIMP-1表达的影响

目的：探讨缺氧对肺动脉成纤维细胞（Fpa）分泌基质金属蛋白酶（MMPs）、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）的影响。 方法： 采用酶谱法测定Fpa培养基中MMP-2的酶活性，免疫印迹法检测培养基中MMP-2、TIMP-1 的蛋白水平，免疫组化法测定细胞原位的蛋白表达， RT-PCR法检测mRNA表达量。 结果： 缺氧后Fpa分泌的MMP-2酶活性、细胞内外蛋白表达量、mRNA表达量均下降；而TIMP-1的表达则呈相反变化。 结论： 缺氧可使肺动脉成纤维细胞MMP-2/TIMP-1的表达失衡，可能参与缺氧性肺血管重建。     

MG132抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞活化

目的探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化的影响及机制。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),随机分为对照组、TGF-β1组(10μg/L)和MG132(0.5μmol/L)处理组。Western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1A1)的表达;RT-PCR和Western blot法分别检测细胞Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-βI型受体(TβRI)、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白的表达。结果与对照组比较,TGF-β1促进了α-SMA和COL1A1蛋白表达(P0.05),MG132抑制了TGF-β1的上述作用(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN mRNA表达较对照组增加(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN蛋白表达较对照组减少(P0.05),而MG132组Smad7和SnoN蛋白水平较TGF-β1组增加(P0.05)。结论 MG132可能通过阻止Smad7和SnoN蛋白泛素化降解,抑制TGF-β1诱导人肺成纤维细胞活化。     

TGFβ1对照射的人肺成纤维细胞细胞周期的影响及其信号转导机制

目的 :检测转化生长因子β1(TGFβ1)对正常及γ射线照射的人肺成纤维细胞 (HLF)的增殖活力及细胞周期的影响 ,并初步探讨其信号转导机制。方法 :培养HLF ,经 3Gyγ射线照射后 ,应用 0 .0 1、0 .1、1和 10 μg/L的TGFβ1处理。采用MTT比色法、DNA倍体分析、免疫酶 /荧光细胞化学及流式细胞仪蛋白质分析等方法 ,检测细胞增殖活力、细胞周期的变化 ,以及信号蛋白Smad3和Smad4表达的变化。结果 :γ射线照射的HLF经 10 μg/L的TGFβ1处理后 ,其增殖活力增强 ,处于S期的细胞增多 ,信号蛋白Smad4发生核转位 ,同时信号蛋白Smad3表达增加。结论 :一定剂量的TGFβ1可通过调控γ射线照射的HLF的细胞周期促进其增殖 ,这可能与其Smad通路的活化相关     

小分子干扰RNA对新生鼠肺成纤维细胞转化生长因子β1的干预效果及意义

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)小分子干扰RNA(siRNA)体外转染新牛鼠肺成纤维细胞的干预效果,研究TGF-β1 siRNA的最佳干预剂量及维持时间. 方法 首先采用化学合成TGF-β1 siRNA对新生鼠肺成纤维细胞进行干预,通过实时定量PCR检测技术筛选出有效干扰片段;然后构建TGF-β1 siRNA腺病毒载体,体外转染新生鼠肺成纤维细胞,半定量PCR检测体外转染后TGF-β1基因的抑制效果,确定其最佳干预剂量及维持时间. 结果 (1)化学合成siRNA抑制TGF-β1基因表达的效果:siRNA剂量为20 pmol,转染后24 h检测抑制效果,第2、3、4条siRNA均有不同效果,其中第3条siRNA抑制效率>70%;(2)TGF-β1 siRNA腺病毒载体转染细胞,观察20、50μl不同剂量转染后24 h抑制情况,并与20μl阴性和空白对照比较,结果显示20、50μl均有明显抑制效果;观察转染后24、48、72 h的抑制效果,比较显示转染后24 h有明显抑制效果,72 h抑制效果最强,说明随着转染时间延长,抑制作用越明显. 结论 TGF-β1 siRNA腺病毒载体体外转染新生鼠肺成纤维细胞对TGF-β1的表达均有明显抑制效果.     

低氧对人胚肺成纤维细胞转化生长因子β1表达的影响

应用核酸原位杂交及增强化学发光免疫斑点法,观察常氧（Ｎ）、低氧（Ｈ）、常氧和低氧猪肺动脉内皮细胞条 件培养液（ＮＥＣＣＭ和 ＨＥＣＣＭ）对人胚肺成纤维细胞转化生长因子β_１（ＴＧＦβ_１） ｍＲＮＡ和蛋白表达的影响。结果表 明：Ｈ组ＴＧＦβ_１ｍＲＮＡ表达为Ｎ组的１．３６倍（Ｐ＜０．０１）,同时在其培养上清液中,ＴＧＦβ_１蛋白含量也明显升高为Ｎ 组的１．８倍。ＨＥＣＣＭ组ＴＧＦβ_１ｍＲＮＡ和蛋白表达较ＮＥＣＣＭ组均下降,ｍＲＮＡ为ＮＥＣＣＭ组的９０％,Ｐ＜０．０１。蛋 白含量为后者的６２．２％。提示：（１）低氧促进入胚肺成纤维细胞合成和分泌ＴＧＦβ_１。（２）在低氧条件下,肺动脉内皮 细胞可能合成某种因子,抑制成纤维细胞ＴＧＦβ_１基因转录和蛋白表达。     

AcSDKP对大鼠心成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性和MMP-1表达的影响

目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对10%血清和血小板源性生长因子(PDGF)诱导的大鼠心成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性和MMP-1表达的调节作用。方法明胶酶谱法检测心成纤维细胞MMP-2、MMP-9的活性。Western blot法检测心成纤维细胞MMP-1的表达。结果10%血清和PDGF使心成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性增强,也促进MMP-1的表达;AcSDKP能够进一步增加由10%血清和PDGF诱导的心成纤维细胞MMP-2、MMP-9的活性,并促进MMP-1的表达。结论AcSDKP上调了由PDGF介导的心成纤维细胞MMPs活性或表达,这可能与AcSDKP抗心肌纤维化的作用相关。     

视黄醇X受体激动剂通过调控Smad2通路抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞胶原合成

目的:探讨视黄醇X受体(RXR)激动剂9-顺式视黄酸(9-cis-RA)干预对缺氧条件下转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠心肌成纤维细胞(CFs)胶原合成的影响和分子机制。方法:心肌组织块干涸法培养大鼠CFs,持续通氮气法建立细胞缺氧环境,评价9-cis-RA和TGF-β1对CFs胶原合成的影响;ELISA法测CFs上清液Ⅰ、Ⅲ型胶原水平,Western blot法检测胞浆、胞核和细胞的Smad2及p-Smad2水平,细胞免疫化学法观察p-Smad2的亚细胞定位。结果:TGF-β1(0.01~10μg/L)在缺氧条件下呈浓度依赖性地诱导CFs合成Ⅰ型和Ⅲ胶原,当浓度达到5μg/L时,Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成水平显著增高(P0.01)。9-cis-RA(10-9~10-6mol/L)则呈浓度依赖性抑制TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs胶原合成,当浓度为10-7mol/L时,Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成水平显著降低(P0.01)。Smad2抑制剂(20 nmol/L)亦可显著抑制TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成。免疫杂交和细胞免疫化学结果显示,与TGF-β1干预相比,TGF-β1和9-cis-RA联合干预组的CFs其胞浆内p-Smad2的水平显著增加,但胞核内p-Smad2的水平明显降低(P0.05)。结论:RXR激动剂9-cis-RA显著下调TGF-β1在缺氧条件下诱导的CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成,其机制与其抑制TGF-β1诱导的p-Smad2细胞核转位有关。     

miR-21对人心肌成纤维细胞MMP2表达和大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的探讨mi R-21对人心肌成纤维细胞MMP2表达和大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法采用实时荧光定量PCR方法检测MMP2 m RNA表达水平,应用Cell Titer-Fluor?细胞活力检测试剂盒测定心肌细胞增殖,Caspase-Glo试剂盒检测心肌细胞半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的活力。结果 mi R-21上调人心肌成纤维细胞MMP2 m RNA的表达,促进大鼠心肌细胞增殖,抑制caspase-3在大鼠心肌细胞的活力。结论 mi R-21可能是参与心肌重构调控的重要基因。     

高糖与同型半胱氨酸对大鼠皮肤成纤维细胞MMP-9表达及活性的影响

目的: 观察不同浓度糖及同型半胱氨酸对大鼠皮肤成纤维细胞MMP-9表达量及活性的影响。方法: 取1 d龄正常SD大鼠背部皮肤分离成纤维细胞,于含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养。2-4代生长状态良好的细胞进行24 h血清剥夺(0.5%FBS)后,分为正常糖浓度组、高糖组、高糖+高同型半胱氨酸组分别培养6 h,之后用RT-PCR、Western blotting和明胶酶谱方法分别检测MMP-9 mRNA、蛋白表达量以及细胞外MMP-9活性。结果: 高糖(22 mmol/L)组MMP-9 mRNA、蛋白表达量及其活性均增高,分别为正常糖浓度组的1.15倍、1.59倍和1.34倍,P<0.05;高糖+高同型半胱氨酸(100 μmol/L)增高组更加明显,依次为正常糖浓度组的1.25倍、2.63倍和2.52倍,P<0.05。结论: 大鼠皮肤成纤维细胞在体外高糖环境下可高表达MMP-9;高同型半胱氨酸在高糖环境下可使MMP-9 表达及酶活性增高更为明显,表明高同型半胱氨酸血症也参与了对MMP-9的调节,可进一步增加高糖环境下成纤维细胞表达MMP-9。     

转化生长因子β1与成纤维细胞的相互作用影响食管癌细胞环氧合酶2表达

目的：探讨转化生长因子β1(TGF-β1)可否通过与成纤维细胞的相互作用调节食管癌细胞环氧合酶2(COX-2)表达。 方法： 以FS液、FSTB液(分别为10%FCS和加入5 μg/L TGF-β1培养24 h后的成纤维细胞培养上清)及含5 μg/L TGF-β1的完全培养基分别为食管癌细胞ECa-109、EC-18培养体系完全换液，24 h后逆转录-PCR及Western blotting分别检测各组COX-2 mRNA和COX-2、TGF-β受体Ⅰ、Ⅱ(RI、Ⅱ)蛋白表达。 结果： EC-18表达TGF-β RI、Ⅱ，ECa-109有RI而无RII表达。TGF-β1组、FS组及FSTB组COX-2蛋白与mRNA表达在EC-18细胞中分别为原来的0.103、2.368、2.793倍和0.368、1.895和4倍(均P<0.05)；在ECa-109细胞中为0.978、1.011(均P>0.05)、2.292倍(P<0.05)和0.980(P>0.05)、1.959、2.531倍(均P<0.05)。 结论： TGF-β1可能通过刺激成纤维细胞转而上调COX-2表达。     

TGF-β对细胞外基质降解酶及其抑制因子的调节

TGF-β是多功能细胞因子,在创伤愈合及组织修复中起关键作用.它可促进细胞外基质的合成,减少细胞外基质的降解,过表达能导致器官的纤维化.基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)在器官纤维化、自身免疫性疾病及肿瘤侵袭中的作用日益受到重视.MMPs/TIMPs受多种细胞因子尤其是转化生长因子-β的调节.     

N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对转化生长因子β1介导的心成纤维细胞MMP-1/TIMP-1表达的调节作用

目的:探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对转化生长因子β_1(TGF-β_1)介导的大鼠心成纤维细胞MMP-1/TIMP-1的调节作用。方法:差速贴壁法分离与获取新生大鼠心成纤维细胞。分别采用免疫细胞化学法和Western印迹法检测心成纤维细胞MMP-1、TIMP-1蛋白表达。结果:TGF-β_1可使心成纤维细胞MMP-1蛋白表达水平下降,而促进TIMP-1蛋白表达,MMP-1/TIMP-1比值下降。AcSDKP可以抑制TGF-β_1对心成纤维细胞MMP-1表达的下调作用,使MMP-1蛋白表达增加,而对TGF-β_1介导的TIMP-1蛋白表达无明显影响,MMP-1/ TIMP-1比值增加。结论:AcSDKP可以通过上调TGF-β_1介导的心成纤维细胞MMP-1蛋白表达并增加MMP-1/ TIMP-1比值,以加速细胞外基质降解,这可能与AcSDKP抗心纤维化的作用有关。     

中晚期糖尿病肾病患者交感神经兴奋性与肾脏纤维化血清指标TGF-β1、MMP-2水平的相关性分析

目的:回顾性分析中晚期糖尿病肾病(DN,MogensonⅢ至Ⅴ期)患者交感神经兴奋性与肾纤维化指标的相关性。方法:DN患者86例(DN组,其中Ⅲ期组26例,Ⅳ期组32例,Ⅴ期组28例),2型糖尿病(T2DM)患者30例作为对照组。收集各组患者血压(SBP)、心率(HR)、血红蛋白(Hb)、肾小球滤过率(GFR)、24h尿蛋白(24hUpro)等病例资料;采用ELISA法测定纤维化指标:转化生长因子β1(TGF-β1)和金属基质蛋白酶-2(MMP-2)血清水平,采用高效液相色谱法检测交感神经兴奋性指标:去甲肾上腺素(NE)浓度。比较各组SBP、HR、HB、GFR、24hUpro、TGF-β1、MMP-2、NE水平差异,分析DN患者血清NE水平与TGF-β1、MMP-2水平的相关性。结果:DNⅤ期患者SBP、HR显著高于对照组(P0.05),DNⅣ期、Ⅴ期患者GFR较对照组明显下降(均P0.05);DNⅢ-V期患者NE水平明显高于对照组(均P0.05),DNⅣ期、Ⅴ期患者MMP-2、TGF-β1水平高于对照组(均P0.05),DN患者血清NE水平与MMP-2、TGF-β1均呈正相关(r=0.962、0.920,均P0.01)。结论:DN患者交感神经兴奋性和肾脏纤维化在其晚期表现明显,尤以交感神经兴奋性升高出现更早,提示交感神经过度兴奋可能参与了DN患者肾脏纤维化、肾功能衰竭的病变过程。     

香烟提取物和脂多糖对人胚肺成纤维细胞TGF-β1 mRNA及蛋白表达的影响

目的 :探讨香烟提取物 (CSE)和脂多糖 (LPS)对体外培养的人胚肺成纤维细胞 (HELF)转化生长因子- β1(TGF - β1)mRNA及其蛋白表达的影响。方法 :应用不同浓度的CSE(1∶5 0、1∶2 5和 1∶10 )、LPS(0 1mg/L、1mg/L和 10mg/L)及CSE(1∶2 5 )与LPS(1mg/L)联合作用于HELF ,37℃作用 2 4h后 ,提取细胞总RNA ,应用逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)及免疫细胞化学技术检测TGF - β1mRNA和蛋白表达的变化。结果 :CSE低浓度 (1∶5 0和 1∶2 5 )时可增加HELFTGF - β1mRNA及蛋白的表达 (P <0 0 5 ) ,高浓度 (1∶10 )时未引起TGF - β1mRNA及蛋白表达增强 (P >0 0 5 )。不同浓度的LPS均引起HELFTGF - β1mRNA及蛋白表达增强 (P <0 0 5 )。CSE与LPS联合作用也可增加HELFTGF - β1mRNA及蛋白的表达 (P <0 0 5 )。结论 :一定浓度的CSE和LPS可上调肺成纤维细胞TGF - β1mRNA及蛋白表达。     

碱性成纤维细胞生长因子对瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对瘢痕成纤维细胞生物学特性的影响。方法采用细胞培养、MTT、ELISA法、氯胺T和RT—PCR法检测bFGF在不同作用剂量下对瘢痕来源的成纤维细胞生长增殖和细胞外基质（ECM）合成的影响。结果（1）MTT检测bFGF对瘢痕成纤维细胞有明确的促增殖作用，并具有剂量相关性；（2）氯胺T法显示实验组和对照组HPr含量无显著性差异，RT—PCR法显示各组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达水平无明显变化；说明bFGF对瘢痕成纤维细胞胶原蛋白的合成无促进作用；（3）ELISA法表明随着bFGF作用浓度的升高，FN的表达表现为增高趋势，且以100ng／ml浓度下作用最显著。结论bFGF可以促进创面愈合，但不引起瘢痕的过度形成。     

RT-PCR联合凝胶电泳成像技术检测体外培养小鼠肺成纤维细胞转化生长因子β1的表达北大核心

背景:RT-PCR技术是将RNA的反转录和cD NA的聚合酶链反应相结合的技术。常用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cD NA序列等。目的:运用RT-PCR技术检测Stealth siRNA对转化生长因子β1的抑制作用。方法:实验分为空白对照组、空转染组、stealth_48组、stealth_166组和stealth_594组。针对BALB/c小鼠转化生长因子β1基因组,选择不同位点设计3套siRNA基因序列,转染体外培养的小鼠肺成纤维细胞,RT-PCR法检测其对转化生长因子β1和下游结缔组织生长因子表达的影响。结果与结论:(1)RT-PCR结果显示3种Stealth siRNA对转化生长因子β1表达在不同时间有不同程度的抑制作用,以Stealth_166效果更为明显;抑制效果与转染时间长短相关,48 h后就可检测出明显抑制,72 h达到最高峰,96 h后开始减弱;(2)结果说明,RT-PCR技术可用于特异性Stealth siRNA抑制转化生长因子β1在小鼠肺成纤维细胞的表达效果的检测。     

肠道缺血再灌流对肾内源性碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β基因表达的影响

目的和方法:研究肠道缺血再灌流过程对肾脏内源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β(bTGFβ)基因表达的影响.采用肠系膜上动脉夹闭45min与再灌流6 h和24 h动物模型,用原位杂交与逆转录PCR(RT-PCR)技术研究两种生长因子基因在正常、缺血以及再灌流肾组织中的表达.结果:两种因子的mRNA在正常肾脏均有少量表达.缺血45min后,两种因子基因表达减少.再灌流6 h,肾组织中TGFβ基因表达明显增加,而bFGF基因表达仍然较少.再灌流24 h,两种因子基因表达恢复至正常对照.结论:肠道缺血再灌流可以引起肾组织内源性bFGF与TGF β基因表达的改变,这种变化过程与肾缺血性损伤后自我修复机制密切相关.