三七几丁质酶基因PnCHI1的功能分析

几丁质酶(chitinase)是一种能够将几丁质水解成N-乙酰葡糖胺的糖苷酶,广泛存在于植物细胞中,是抗真菌防卫反应体系的重要组成部分。该文深入分析了1种三七几丁质酶基因PnCHI1的功能。构建PnCHI1的亚细胞定位载体,转入洋葱表皮细胞中瞬时表达,在激光扫描共聚焦显微镜下发现PnCHI1定位于细胞壁中。构建PnCHI1的原核表达载体,诱导并纯化获得重组蛋白,体外平板抑菌实验结果显示PnCHI1原核重组蛋白对尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌3种三七根腐病菌的菌丝生长具有很强的抑制活性。采用反向遗传学技术验证PnCHI1的功能,通过根癌农杆菌介导将PnCHI1转入烟草中过量表达。qRT-PCR分析结果表明PnCHI1在T2代转基因烟草中大量表达,同时叶片接种实验显示PnCHI1转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性增强明显。结论:PnCHI1是定位于细胞壁的几丁质酶,体外能抑制几种三七根腐病真菌,在烟草过表达大大提高了烟草对茄腐镰刀菌的抗性,推测PnCHI1是三七中参与根腐病防卫反应的重要抗病基因。     

实时荧光PCR快速检测鼠疫耶尔森菌方法的建立

目的建立一种能快速检测鼠疫耶尔森菌的实时荧光PCR方法。方法以鼠疫耶尔森菌pla毒力基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,探针的5’端标记荧光报告基团FAM,3’端标记荧光淬灭基团TAMRA;建立一种能快速检测样本中鼠疫耶尔森菌的实时荧光PCR方法,并对方法的特异性和灵敏度进行评价。结果该实时荧光PCR方法只对鼠疫耶尔森菌进行特异扩增,同种属的小肠结肠炎耶尔森菌以及伤寒杆菌、肺炎衣原体、嗜肺军团杆菌其他症状相似病原体均无扩增;该方法在65 min内即可完成检测,操作方便快速,对菌悬液最低可检测至10个菌体。结论本研究建立的实时荧光PCR检测鼠疫耶尔森菌方法不仅能实现对鼠疫杆菌的快速检测,还可为鼠疫耶尔森菌引发疫情的监控和溯源提供参考。     

实时荧光定量PCR法鉴别川贝母掺伪

目的 建立实时荧光定量PCR法检测川贝母样品中掺伪程度.方法 利用川贝母ITS1区序列的特点,设计4条用于特异性鉴别川贝母的正向引物1~4.同时,设计相应的反向引物,配合正向引物组成引物对,进行实时荧光定量PCR扩增.利用川贝母、浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母对照品以及市售川贝母样品,通过PCR扩增来考察引物对1~4鉴别川贝母的准确性.通过实时荧光定量PCR法,考察引物检测川贝母掺伪程度的准确性.结果 引物对1~4可以准确检测川贝母的真伪;通过荧光定量PCR法,可准确检测出川贝母样品中的伪品的掺伪程度.结论 该方法简便、快捷、准确,可用于川贝母样品中掺伪程度的定量鉴别.     

基于Illumina Miseq分析黄精根腐病根际土壤真菌群落结构及多样性＊

目的研究患根腐病和健康黄精的根际土壤真菌群落结构组成、丰富度和多样性变化情况,为查明黄精根腐病发生机制提供线索。方法以4年生黄精根腐病根际土壤(GG组)、4年生健康黄精根际土壤(GJ组)和未种过黄精的土壤(GK组)为研究对象,采用Illumina Miseq技术分析土壤真菌群落结构组成。结果 9个土壤样品基因组共获得有效ITS1序列1063335条,病株组土样真菌OTUs数显著少于健康组和空白组土样。种群多样性指数显示病株组最低,空白组最高,在门分类水平上,患根腐病组及健康组土样的主要优势菌群均为子囊菌门、担子菌门、Zoopagomycota、毛霉门、壶菌门。在属分类水平上,3组真菌群落结构组成及丰度差别较大,与黄精根腐病相关的病原菌镰刀菌属Fusarium存在于所有样品中,而有益菌木霉菌属在健康组和空白组土样的丰度显著高于患病组土样。结论黄精根腐病株和健康株根际土壤微生物组成具有显著性差异,对于探究黄精根腐病发生的微生态机制和改良种植黄精土壤微生物具有理论指导作用。     

两种快速鉴定甘草方法的比较

目的:建立快速检测中药材甘草的荧光定量PCR和环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)两种技术,并对它们的特异性和灵敏性进行比较。方法:以中药材甘草作为实验对象,提取DNA后,用设计的PCR引物及LAMP引物组合分别对甘草进行普通PCR、荧光定量PCR以及LAMP实验,检测引物的特异性,同时建立模板DNA的浓度梯度,对荧光定量PCR及LAMP的灵敏性进行检测。结果:甘草的特异性序列可以通过荧光定量PCR得到有效扩增,而与甘草相近的混伪品结果显示阴性。荧光定量PCR最低可检测到甘草的浓度为0.67×10~(-4)ng/μL。在LAMP特异性检测中,甘草出现浊度值,其他混伪品显示阴性。灵敏度性检测中,LAMP检测在60 min反应时间内同样检测到的甘草的最低DNA浓度为0.67×10~(-4)ng/μL,反应产物加入荧光染料SYBR GreenⅠ后反应液呈现肉眼可观察的明显的亮绿色。结论:LAMP检测和real-time PCR检测具有相似的特异性、灵敏度和精确性,但LAMP检测方法更为简单、方便,所需时间更短,而且不需要昂贵的仪器。因此,LAMP检测中药的方法更适合于对中药材甘草检测的推广使用。     

美洲大蠊TaqMan探针实时荧光PCR方法的建立及应用

目的 本研究旨在建立一种具有高特异性的TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应(PCR)方法,用于美洲大蠊药材以及中药饮片美洲大蠊粉的鉴别。方法 依据美洲大蠊基因组序列的特点,设计出适用于实时荧光PCR检测的特异性引物和探针,并对探针浓度、循环数和退火温度进行优化,建立能够快速鉴别美洲大蠊的TaqMan探针实时荧光PCR最佳方法,进一步验证该方法的特异性和灵敏度。结果 研究表明特异性引物和探针仅对美洲大蠊药材以及美洲大蠊粉有特异性扩增,对杜比亚蟑螂、土鳖虫、德国小蠊和九香虫均未扩增出荧光曲线。结论 所建立的TaqMan探针实时荧光PCR法能够准确、快速对美洲大蠊及常见混伪品进行鉴别,为美洲大蠊的鉴别提供一种专属性更强的技术手段参考。     

环介导等温扩增联合核酸层析试纸快速鉴定燕窝基原

目的:应用环介导等温扩增技术(LAMP)联合核酸层析试纸(LFD),基于燕窝中残留的线粒体DNA(mtDNA)建立燕窝基原的鉴定方法。方法:以不同生物基原的燕窝样品及伪品为研究对象,提取mtDNA,设计LAMP引物,建立LAMP扩增方法,并评价LAMP扩增浊度法检测与恒温水浴LAMP扩增联合LFD检测方法的特异性及灵敏度。结果:当反应温度为63℃时,燕窝线粒体中的细胞色素基因(mtDNA-cytb)的扩增效果最佳,而且LAMP扩增浊度检测与恒温水浴LAMP扩增联合LFD检测表现出一致的结果,均能有效区分燕窝样品的基原及伪品;在4.32×10~8～4.32×10~3 copies/μL的质粒标准品中具有良好的扩增检测效果。结论:LAMP扩增联合LFD的检测方法可以检测出燕窝核酸成分,对燕窝的基原鉴定具有良好的特异性和灵敏度,用于燕窝的检测快速准确,灵敏简便。     

双重实时荧光PCR快速鉴别人参和西洋参＊

目的 建立一种能够快速鉴定人参和西洋参的双重实时荧光PCR方法。方法 通过对人参属及其近似种基因序列的分析比对，设计特异性的引物探针，建立双重实时荧光PCR检测方法。PCR反应体系为Premix Ex Taq （Probe qPCR） 10 μL，人参上下游引物各0.5 μL，西洋参上下游引物各0.3 μL，人参与西洋参特异性探针各0.4 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水补至20 μL。反应条件为95℃预变性30 s；然后以95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s进行40个循环。应用该方法测试了27份DNA样品，包括7份人参、6份西洋参、4份人参与西洋参混合样、10份其他人参属样品及其他常见中药材样品的DNA，以确定该方法的特异性。将人参与西洋参样品DNA混合后10倍稀释成不同浓度后进行检测，用以确定该方法的灵敏度。结果 人参及西洋参样品均在特定的荧光通道下出现典型的阳性扩增曲线，人参与西洋参混合样品均同时出现两条阳性扩增曲线，其它对照样品及空白对照均没有出现阳性扩增曲线。灵敏度检测结果显示该方法检测人参及西洋参的最低检测限均为2 pg DNA/反应。结论 本实验建立的双重实时荧光PCR方法能够同时快速、准确、灵敏地鉴别出人参和西洋参。     

一种鉴定西红花和红花源性成分的实时荧光PCR方法

该研究根据GenBank中的ITS2序列设计引物,基于SYBRGreen荧光PCR技术建立了一种能快速、灵敏和特异的鉴别西红花和红花源性的实时荧光定量PCR检测体系。与中草药DNA条形码技术相比,该方法检测时间短、特异性强、灵敏度高。利用该方法检测15份样品,其中4份为红花,8份样品为西红花,3份为其他源性,与中草药DNA条形码检测结果一致。该方法为药材中西红花与红花源性的快速鉴定奠定了基础。     

三七几丁质酶基因PnCHI1的克隆及表达特性分析

几丁质酶(chitinase,EC3.2.1.14)广泛存在于多种生物体中,催化水解几丁质(chitin),在抗真菌防卫反应体系中具有重要作用,同时几丁质酶还调控植物的生长和发育,参与细胞的程序性死亡(programmed cell death,PCD)。该实验基于三七Panax notoginseng中编码几丁质酶的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到1个新的几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为PnCHI1。PnCHI1的cDNA全长为1 022 bp,含有822 bp的开放阅读框,26 bp 5'-非翻译区以及174bp的3'-非翻译区,编码具有273个氨基酸的蛋白质。该基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族成员,进化树分析表明PnCHI1编码的氨基酸序列属于IV类几丁质酶。qRT-PCR分析结果显示,植物信号分子水杨酸、茉莉酸甲酯、H_2O_2和乙烯处理可均明显诱导三七根中PnCHI1的转录水平;三七叶片接种人参链格孢Altemaria panax后,PnCHI1的表达量迅速升高,呈波动上升趋势;外源茉莉酸甲酯预处理三七根部,PnCHI1的表达水平上升,接种茄腐镰刀菌Fusarium solani后,PnCHI1的转录水平急剧上升,接种后4 h达到最高转录水平;而无菌水预处理三七受茄腐镰刀菌侵染过程中,PnCHI1的表达量逐渐上升,至48h达到最大值。上述结果表明PnCHI1参与三七对根腐病菌以及黑斑病菌的防卫反应。     

大蓟抗结核杆菌的活性成分及作用机制研究

目的 从大蓟根中分离抗结核杆菌活性成分,并初步探讨其抗结核杆菌的作用机制。方法 采用活性跟踪分离方法,从大蓟根中分离抗结核杆菌活性成分,运用棋盘试验法研究大蓟活性成分与异烟肼、利福平和吡嗪酰胺的联合抗菌作用,运用分子对接软件初步探讨活性单体成分与KatG酶的亲和力,采用qRT-PCR法考察活性化合物干预结核分枝杆菌后KatG酶基因的相对转录量,采用紫外分光光度法测定KatG酶的活力,采用扫描电镜观察结核杆菌的形态。结果 从大蓟根分离得到具有抗结核杆菌活性的化合物HP01,鉴定为槲皮素。槲皮素抑制结核杆菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）值为160 μg/mL。槲皮素与吡嗪酰胺存在相加作用,与异烟肼、利福平无拮抗作用。分子对接显示,槲皮素与KatG酶具有较强的亲和力。酶活力测试结果表明槲皮素对结核杆菌KatG酶具有抑制作用。结核杆菌被槲皮素处理后其KatG基因转录出现明显的补偿上调。扫描电镜结果显示,槲皮素能破坏结核杆菌细胞壁。结论 大蓟抗结核杆菌的活性成分为槲皮素,槲皮素能够抑制结核杆菌KatG酶活性,导致结核杆菌结构破坏,从而杀死结核杆菌。在设计新的抗结核组合用药方案时,可以考虑加入槲皮素。     

瑶药材搜山虎的化学成分研究

目的 研究搜山虎（岭南花椒Zanthoxylumau strosinense的根和茎）的化学成分,为双虎肿痛宁酊剂的药效物质基础研究和质量标准提升提供依据。方法 利用AB-8大孔树脂、硅胶、制备色谱进行成分分离,并结合核磁共振氢谱、碳谱和质谱鉴定化合物结构;采用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞对化合物进行抗炎活性的研究;采用小鼠醋酸扭体法、热板法对分离得到的成分进行镇痛活性的研究。结果 从搜山虎根中共分离得到10个化合物,分别鉴定为胡芦巴碱（1）、甲芬那酸（2）、4-羟基肉桂酸（3）、小檗碱（4）、橙皮苷（5）、新绿原酸（6）、白藜芦醇（7）、芥子酸（8）、脯氨酸（9）和甘草次酸（10）。抗炎活性研究结果表明,化合物2、4～7、10能够显著抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的释放。镇痛实验结果表明,化合物2、4、7能够显著降低小鼠扭体次数,显著提高痛阈值。结论 所有化合物均为首次从该植物及花椒属植物中分离得到,化合物2、4、7具有很好的抗炎和镇痛作用。     

鹿藿的化学成分研究

目的研究鹿藿Rhynchosia volubilis的化学成分。方法采用硅胶、ODS、Toyopearl HW-40C、Sephadex LH-20柱色谱以及半制备HPLC等方法进行纯化,根据理化性质及波谱数据对化合物进行结构鉴定。结果从鹿藿石油醚提取物中分离得到13个化合物,分别鉴定为(-)-sigmoidin E(1)、lupinifolin(2)、precatorin B(3)、木豆酮(4)、槐花多糖B(5)、5,3′-二羟基-4′-甲氧基-5′-γ,γ-二甲基烯丙基-2″,2″-二甲基吡喃并[5,6:6,7]异黄烷酮(6)、染料木素(7)、甘草异黄酮A(8)、erylatissin B(9)、neo-bavaisoflavone(10)、羽扇豆醇(11)、桦木醛(12)、穿贝海绵甾醇(13)。化合物1～10均为含异戊烯基的黄酮类,其中化合物1、2为二氢黄酮、3～6为二氢异黄酮、7～10为异黄酮。化合物11～12为羽扇豆烷型三萜,化合物13为甾醇类。结论化合物1、5～6、8～10、12、13均为首次从鹿藿属植物中分离得到,化合物1～3、5～13均为首次从该植物中分离得到。     

中华眼镜蛇神经毒素可溶性微针的制备、表征及其离体皮肤渗透研究

目的 筛选多种常用的微针基质辅料,制备具有合适机械强度和柔韧性的载中华眼镜蛇神经毒素（neurotoxin,NT）可溶性微针（dissolvable microneedles,DMN）（DMN-NT）,并对其进行体内外评价。方法 采用两步真空模板填充法制备不同材料构成的DMN,并对其进行力学特性分析,通过重量法对其吸湿性进行考察,利用正置显微镜对其形态特征进行考察,筛选最佳基质材料后制备DMN-NT,并对微针的载药量、机械性能、在体溶解、在体恢复、体外释放度、离体皮肤渗透与稳定性等进行评价。结果 针尖最佳基质材料为20%聚乙烯吡咯烷酮K90（PVP K90）和20%透明质酸（相对分子质量为10 000）,背衬层最佳基质材料为7.5%羟丙基甲基纤维素（HPMC,E5LV型）和15%聚乙烯醇（PVA-0588）。正置显微镜和体式显微镜下观察发现DMN-NT针体垂直,排列整齐;每片DMN-NT的载药量为（172.22±1.30）μg或（17.38±0.57）μg;力学性能测试结果显示,DMN-NT针尖受力可达（39.88±3.09）N,大于微针穿刺皮肤所需的破坏力0.05 N,表明DMN-NT有较好的机械强度,亚甲基蓝染色实验结果表明微针具有较好的穿刺性;在体溶解实验结果显示,在10 min内DMN-NT大部分溶解;在体恢复实验结果为给药30 min后针孔痕迹几乎不见,表明DMN-NT的生物相容性好,安全性高;体外释放结果表明DMN-NT在pH值为7.4的PBS中8 min的累积释放率达（93.65±4.29）%;离体皮肤渗透结果显示,10 h后微针的累积药物渗透百分率达到（97.99±2.80）%,而药物水溶液中药物几乎没有透过皮肤;DMN-NT稳定性初步评价结果良好。结论 制备的DMN可以穿刺皮肤角质层,具有较好的溶解性和生物相容性,可以高效经皮递送大分子药物。     

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术比较板蓝根和大青叶的化学成分

目的 采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术比较板蓝根Isatidis Radix和大青叶Isatidis Folium的化学成分。方法 采用Accliam 120 C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm;Thermo Fisher）,以0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%甲酸的水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量为0.3 mL/min,柱温为40 ℃,采用电喷雾离子源（ESI）,在正、负离子模式下进行数据采集,以PeakView 1.2质谱分析软件分析数据。结果 通过化合物的保留时间、精确质荷比、二级质谱裂解碎片等信息,结合对照品、参考文献和Massbank等数据库共鉴定或指认出板蓝根和大青叶的71个共有成分,主要包括生物碱、黄酮、木脂素、含硫化合物、有机酸等类化合物;板蓝根特有成分6个,主要包括含硫化合物类等;大青叶特有成分2个,均为生物碱类。结论 该方法能够系统、快速地比较分析板蓝根和大青叶的化学成分,为其质量控制和药效物质基础研究提供了重要依据。     

椴叶鼠尾草中1个新的克罗烷型二萜化合物

目的研究椴叶鼠尾草Salviatiliifolia地上部分的化学成分。方法采用硅胶、ODS、SephadexLH-20、HPLC等各种现代色谱分离技术进行系统地分离纯化,根据波谱数据对化合物进行结构鉴定。结果从椴叶鼠尾草地上部分丙酮提取物中分离得到了2个化合物,分别鉴定为1-(3-呋喃基)-8-(2-酮-2,5-二氢呋喃基)-1,7,8,9-四氢萘并[1,2-c]呋喃-3,6-二酮(1)和dugesin B(2)。结论化合物1为1个新的克罗烷型二萜化合物,命名为椴叶鼠尾酮A,活性测试结果表明化合物1无明显细胞毒活性。     

牛至挥发油体内外抗白色念珠菌的活性与机制研究

目的 研究牛至挥发油（Origanum vulgare volatile oil,OVO）抗外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis,VVC）的作用及机制。方法 体外实验评价OVO对白色念珠菌的抑菌效果。建立VVC小鼠模型,给予OVO干预后,检测小鼠阴道灌洗液中炎症因子含量,苏木素-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色、PAS染色及扫描电镜观察阴道组织的病理变化,Western blotting检测阴道组织Dectin-1信号通路相关蛋白的表达情况。结果 在体外抑菌实验中,OVO对白色念珠菌的抑菌圈直径为（24±2）mm,最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）为1.95 mg/mL;OVO明显抑制了白色念珠菌的生物膜形成、疏水性及黏附性（P＜0.05、0.01）。在动物实验中,与模型组比较,OVO组小鼠阴道冲洗液中菌落数和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、IL-17、IL-22含量显著减少（P＜0.05、0.01、0.001）,阴道组织上皮角化、炎细胞浸润及真菌负荷量明显减少,阴道组织中树突状细胞相关性C型凝集素-1（dendritic cell-associated C-type lectin 1,Dectin-1）、脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）、磷脂酶-Cγ2（phospholipase-Cγ2,PLCγ-2）、胱天蛋白酶募集域蛋白9（caspase-associated recruitment domain-containing protein 9,CARD9）、磷酸化核因子-κB p65（phosphorylated nuclear factor-κB p65,p-NF-κB p65）蛋白表达水平明显降低（P＜0.05、0.01）。结论 OVO可能通过抑制小鼠阴道组织中的炎症反应来改善VVC,并有望成为治疗VVC感染的潜在候选药物。     

买麻藤中1个新的含氮芪类化合物

目的 研究买麻藤Gnetum montanum藤茎的化学成分。方法 利用正相硅胶、Sephadex LH-20凝胶、中压制备液相色谱和半制备HPLC等多种柱色谱技术进行分离纯化,并综合运用ESI-MS、HR-ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC等方法鉴定化合物的结构。结果 从买麻藤藤茎的95%乙醇提取物中分离得到14个化合物,分别鉴定为（Z）-5-（2,4-二羟基-6-（4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基）苯基）吡咯烷-2-酮（1）、银松素单甲醚（2）、3-羟基-5,4''-二甲氧基芪（3）、银松素（4）、买麻藤醇（5）、刚果买麻藤素F（6）、异丹叶大黄素（7）、闭苞买麻藤素（8）、白藜芦醇（9）、顺式-ε-葡萄素（10）、ε-葡萄素（11）、双异食用大黄苷元A（12）、顺式-射干素B（13）和小叶买麻藤素A（14）。结论 化合物1为新化合物,命名为顺式买麻藤内酰胺（cis-gnetumamide）,化合物3、10、13和14为首次从该植物中分离得到。     

羊踯躅化学成分及其药理作用研究进展

羊踯躅Rhododendron molle为杜鹃花科杜鹃花属植物,民间常用于治疗类风湿性关节炎。现代药理学研究证实二萜类成分是其主要药效成分,具有抗炎、镇痛等药理作用。通过查阅国内外文献,对羊踯躅化学成分、药理作用等方面的研究进展进行综述,并对羊踯躅的研究前景进行了简要展望,以期为羊踯躅的深入研究提供参考。     

商陆的研究进展

查阅本草和国内外相关文献,从商陆本草考证、真伪鉴定、炮制、成分与药理、临床研究及工农业资源开发等方面进行归纳总结。本草考证表明历代古籍有商陆或当陆或章陆等名称,其功效为外敷痈肿疮毒、内服利尿消肿,产地由西北向东南转移;商陆根具备同心环异常结构,有别于常见8种混伪品。商陆主要以醋制法进行减毒增效炮制。商陆主要有效成分为三萜皂苷、多糖和抗病毒蛋白(PAPs),具有利尿泻下、改善肾脏、肝脏、呼吸道炎症和神经性炎性疾病的作用,及抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性。临床主要用于组方治疗肝硬化腹水、肾病综合症等,外敷治疗便秘。商陆还在植物抗病、抗虫、环境修复等方面有重要应用价值,为该药用资源的合理开发和综合利用提供支持。