Epstein—Barr病毒（EBV）及其介导的细胞永生化

Epstein-Barr病毒（EBV）因其与众多肿瘤的相关性以及其在体外能使B淋巴细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系（LCLs)的特性而成为近年来细胞永生化研究的热点之一。研究表明，EBV主要是通过其潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径而使细胞永生化的，但是病毒蛋白的具体作用机制尚无定论。本综述了EBV生物学特性方面近年来的研究成果，并以LCLs为切入点初步探讨了EBV介导的细胞永生化。     

永生化EB病毒转化B细胞对肝癌细胞抗原的提呈作用

目的 建立EB病毒(Epstein—Barr virus，EBV)转化的永生化B细胞(命名为LEBV)并研究其对肝癌细胞抗原的提呈作用。方法 从人外周血中分离出外周血单个核细胞(Perpheral blood mononuclear cell,PBMC)，用等体积的EBV上清混合培养4周以上建立永生化EBV转化B细胞(LEBV)，用流式细胞计数仪(FACS)检测其细胞表面功能相关分子CD86、CN40、HLA-DR和HLA-ABC的表达情况。LEBV与自体淋巴细胞和肝癌细胞抗原共培养3d，结束培养前12h加入37kBq／孔^3H—标记的胸腺嘧啶(^3H—TdR)，收获细胞，用液体闪烁计数仪测定cpm。结果 培养3周以上即培养出EBV转化的永生化B细胞，可连续培养1年以上。经FACS检测，细胞表面分子CD86、CD40、HAL-DR和HLA—ABC的表达率分别为74％、91％、83％和86．7％。该细胞接触肝癌细胞抗原后刺激自体淋巴细胞增殖的能力增强。结论 EBV转化的永生化B细胞对肝癌细胞抗原具有提呈作用。     

不同类型的HBsAg真核表达质粒在EBV永生化B淋巴母细胞中的表达

目的探讨3种不同类型的HBsAg真核表达质粒在EBV永生化B淋巴母细胞中的表达. 方法用3种不同类型的质粒载体分别构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)真核表达质粒(pCI-S、pMEP4-S、 pLXSN-S);然后用阳离子脂质体介导的转染法分别转染正常人EBV永生化的B淋巴母细胞,经G418或Hygromycin B筛选出抗性细胞克隆,用RT-PCR检测抗性细胞总RNA中目的基因在转录水平的表达;用ELISA检测抗性细胞培养上清和细胞裂解液中HBsAg的含量. 结果 3种不同类型HBsAg重组表达质粒转染的EBV永生化B淋巴母细胞,在转录水平上,可检出HBsAg mRNA的表达;在蛋白水平上,细胞培养上清和细胞裂解液均可检出HBsAg;而以EB病毒表达质粒pMEP4-S表达最高,真核表达质粒pCI-S和逆转录病毒表达质粒pLXSN-S表达HBsAg的量无明显差异. 结论 3种不同类型的HBsAg真核表达质粒均可在EBV永生化B淋巴母细胞中稳定表达,EB病毒表达质粒pMEP4-S表达的HBsAg明显高于真核表达质粒pCI-S和逆转录病毒表达质粒pLXSN-S.     

不同类型的HBsAg真核表达质粒在EBV永生化B淋巴母细胞中的表达

目的 探讨3种不同类型的HBsAg真核表达质粒在EBV永生化B淋巴母细胞中的表达。方法 用3种不同类型的质粒载体分别构建乙型肝炎表面抗原（HBsAg)真核表达质粒（pCI-S,pMEP4-S,pLXSN-S)；然后用阳离子脂质体介导的转染法分别转染正常人EBV永生化的B淋巴母细胞，经G418或HygromycinB筛选出抗性细胞克隆，用RT-PCR检测抗性细胞总RNA中目的基因在转录水平的表达；用ELISA检测抗性细胞培养上清和细胞裂解液中HB-sAg的含量。结果 3种不同类型HBsAg重组表达质粒转染的EBV永生化B淋巴母细胞，在转录水平上，可检出HB-sAgmRNA的表达；在蛋白水平上，细胞增养上清和细胞裂解液均可检出HBsAg；而以EB病毒表达质粒pMEP4-S表达最高，真核表达质粒pCI-S和逆转录病毒表达质粒pLXSN-S表达HBsAg的量无明显差异。结论 3种不同类型的HBsAg真核表达质粒均可在EBV永生化B淋巴母细胞中稳定表达，EB病毒表达质粒pMEP4-S表达的HBsAg明显高于真核表达质粒pCI-S和逆转录病毒表达质粒pLXSN-S。     

潜伏膜蛋白1基因特异性沉默对EB病毒阳性胃上皮细胞影响的初步研究

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是重要的DNA肿瘤病毒.潜伏膜蛋白1(1atent membrane protein 1,LMPl)编码基因是EBV永生化基因中惟一能够转化体外培养的人和啮齿类动物细胞并使之具有致瘤性的基因.     

HPV L1保守序列多肽抗血清降解HPV6感染能力的测试

目的：明确对不同类型人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白（HPV L1）具有交叉反应性的HPV L1 C-末端保守序列抗体是否具有降解HPV6感染能力的作用。方法：收集尖锐湿疣标本,从收集的标本中找出HPV6型感染病例,并提取病毒。将多肽抗血清按不同比例稀释,与得到的病毒共同培养并中和,接触单层培养的人永生化角质形成细胞,PCR检验经HPV6病毒接触后人永生化角质形成细胞中HPV6 DNA含量,ELISA检验此细胞中HPV6 L1蛋白存在与否。结果：经不同稀释浓度抗血清中和的HPV6病毒感染的人永生化角质形成细胞,其DNA提取物的PCR产物经电泳,在凝胶280 bp处,HPV6特异性区间呈现不同强度的阳性条带,阳性条带的强度随抗血清浓度的升高逐渐降低。ELISA对经抗血清中和病毒接触的人永生化角质形成细胞提取蛋白进行测试,HPV L1蛋白表达量显示出与上述PCR检测结果同样的梯度变化趋势,变化差异具有统计学意义。结论：初步证明,HPV6 L1保守序列多肽抗血清可部分降解该病毒的感染,该抗血清具有针对更多型HPV进行中和研究的价值。     

人CD40-IgG1Fc段融合蛋白对EBV转化的B细胞凋亡的影响

目的 探讨人CD40-IgG1Fc段融合蛋白对EB病毒(EBV)转化的B淋巴细胞在细胞生长及凋亡方面的影响.方法 应用流式细胞术检测EBV转化的B淋巴细胞膜表面异位表达CD40L;应用本研究所构建的CD40-IgG1Fc段融合蛋白CHO稳定表达株的培养上清与EBV转化的B淋巴细胞共孵育,通过MTT法检测B细胞的生长变化,吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)双染色法和DNA ladder法检测融合蛋白对B细胞凋亡的影响.结果 EBV转化的B细胞膜表面异位表达CD40L;CD40IgG1Fc段融合蛋白可有效抑制EB病毒转化的B细胞生长,抑制程度与蛋白浓度呈正相关;AO与EB双染色法及DNA ladder法均检测到B细胞凋亡明显增加,与共孵育时间呈正相关.结论 CD40-CD40L的相互作用是EBV转化的B细胞异常激活的重要机制,人CD40-IgG1Fc段融合蛋白能阻断CD40-CD40L的相互作用,抑制EB病毒转化的B细胞的生长,促进其凋亡,为下一步自身免疫性疾病的临床实验治疗奠定了基础.     

EB病毒相关胃癌研究进展

世界范围内约10％的胃癌组织中可检测到EBV，研究显示：EBV感染能使原代培养的正常胃上皮细胞永生化，EBV相关胃癌是由一个EBV感染的细胞单克隆增殖形成，提示EBV感染在EBV相关胃癌的发展中起重要作用。本文就EBV相关胃癌的诊断、病毒存在形式和基因表达、影响其发生发展的协同因素以及EBV对上皮细胞的生长促进作用作一综述。     

EBV转化的B淋巴母细胞系的建立及应用

EBV转化B淋巴细胞后，形成永生化的B淋巴母细胞系(B-LCL)。B-LCL在体外能无限增殖，广泛应用于医学生物学研究领域。本文就EBV对B淋巴细胞的转化机制、建立B-LCL应注意的问题以及B-LCL在细胞与分子遗传学、免疫学、EBV相关肿瘤的免疫治疗等方面的进展作一简要综述。     

c-myc基因在EBV转化人胃上皮细胞中的作用

目的研究EBV感染人胃上皮细胞系GES-1后c-myc基因的表达状况及转化作用,以探讨c-myc基因在Epstein-Barr病毒(EBV)相关胃癌发生中所起的作用。方法用携带NEO~r基因的重组EBV产生细胞系Akata 1061以密切接触法感染人胃上皮细胞系GES-1,采用脂质体介导法将c-myc基因转染至同一细胞,以pcDNA3空载体质粒转染同一细胞为对照;经G418筛选获得感染或转染的抗性细胞克隆;采用免疫细胞化学法测定EBNA1的表达以鉴定EBV感染细胞克隆,测定EBV感染和c-myc基因转染细胞中C-myc蛋白的表达;通过形态学观察、细胞生长曲线测定及流式细胞分析等方法观察细胞生物学特性的变化。结果与对照组相比,EBV感染及c-myc转染后细胞发生明显的形态学变化,生长速度明显加快,S期细胞比例显著提高,分别为(70.96±0.91)%和(60.67±3.06)%vs(34.74±1.03)%,P<0.05,表明EBV感染及c-myc基因转染均使细胞增殖加快。结论EBV感染及c-myc基因转染可使人胃上皮细胞的增殖速度加快,细胞恶性程度增强,但并未导致肿瘤的发生。EBV对人胃上皮细胞的转化作用可能与c-myc基因的过度表达有关。     

EBV转化的B淋巴母细胞系的建立及应用

EBV转化B淋巴细胞后 ,形成永生化的B淋巴母细胞系 (B LCL)。B LCL在体外能无限增殖 ,广泛应用于医学生物学研究领域。本文就EBV对B淋巴细胞的转化机制、建立B LCL应注意的问题以及B LCL在细胞与分子遗传学、免疫学、EBV相关肿瘤的免疫治疗等方面的进展作一简要综述     

EB病毒编码的信号转导模拟分子研究进展

EB病毒 (EBV)与人类的伯基特淋巴瘤、霍杰金氏淋巴瘤、鼻咽癌密切相关 ,现在越来越多的肿瘤中发现有该病毒。在EBV编码的多种蛋白中 ,有些蛋白分子从结构或功能上模拟、利用了细胞内外的信号转导分子从而干扰了细胞正常的信号转导 ,导致EBV感染组织或细胞出现多种异常的生物学效应。     

猴空泡病毒40大T抗原基因诱导人骨髓间充质干细胞的永生化

背景:细胞永生化是细胞获得持续增殖能力的一种特性,大T抗原基因可使细胞永生化效率提升,并广泛应用于实验中,越来越受到研究者的关注。目的:建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株,为人骨髓间充质干细胞的临床应用奠定基础。方法:使用含有猴空泡病毒40大T抗原基因的重组质粒载体转染人骨髓间充质干细胞,连续传代培养,通过形态学、细胞增殖能力、细胞表面标记、多向分化潜能等方法进行鉴定。结果与结论:(1)该方法构建的永生化细胞株为贴壁生长的梭形细胞,具有人骨髓间充质干细胞特异性表面标志;(2)转染后第50代人骨髓间充质干细胞仍然可表达猴空泡病毒40大T抗原基因;(3)永生化细胞株的增殖能力优于未转染人骨髓间充质干细胞;(4)永生化细胞株具有向成骨、成脂肪、成软骨细胞分化的潜能;(5)由此可见,转染猴空泡病毒40大T抗原基因不影响人骨髓间充质干细胞的生物学特性和分化能力,该方法可以用于建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株。     

潜伏期膜蛋白1与疾病关系的研究进展

EB病毒(EBV)是一种普遍存在的致癌病毒,是高度相关的淋巴和上皮肿瘤的来源和发展,包括伯基特淋巴瘤和鼻咽癌(NPC)等,EBV基因几乎可以在所有细胞中。EBV感染通常与少数潜伏病毒功能的蛋白质表达,包括潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A等和巴尔核抗原1(EBNA1)。LMP1是肿瘤坏死因子受体超家族的成员,被认为是EBV的主要致瘤蛋白。在EB病毒中通过2个C末端结构域编码基因蛋白LMP1信号来驱动细胞生长,存活和转化。LMP1蛋白目前是惟一已被证实的EB病毒的癌基因,LMP1的表达参与了肿瘤的发生与发展,是目前癌症方面研究的重点。     

EBV编码的BART microRNA在鼻咽癌中的表达及对患者免疫功能的影响

目的探究EB病毒(EBV)编码的BART微小RNA(miRNA)在鼻咽癌中的表达及对患者免疫功能的影响。方法选择我院2015年6月至2018年3月耳鼻咽喉头颈外科收治的鼻咽癌患者57例作为研究组,另选择同期来院治疗的慢性鼻窦炎鼻息肉患者42例作为对照组。分别采用RT-PCR法与Western blot法检测鼻咽癌组织与鼻息肉组织中EBV BART miRNA表达水平与Fas、CD44s与CD44变异体6(CD44v6)蛋白表达水平;采用酶联免疫吸附法与细胞分析仪分别检测研究组放疗前后及对照组血清中EB病毒衣壳抗原免疫球蛋白-A(VCA-IgA)、早期抗原免疫球蛋白-A(EA-IgA)、CD8~+、CD4~+T细胞水平;分析鼻咽癌组织中EBV BART miRNA表达水平与Fas、CD44s与CD44v6蛋白表达水平的相关性。结果鼻咽癌组织中EBV BART miRNA表达水平较鼻息肉组织明显提高(P0.05);研究组患者VCA-IgA与EA-IgA、CD8~+T细胞、CD8~+/CD4~+水平较对照组受试者明显提高,CD4~+T细胞水平较对照组受试者明显降低(P0.05);鼻咽癌患者放疗前VCA-IgA与EA-IgA、CD8~+T细胞、CD8~+/CD4~+水平均明显大于放疗后,CD4~+T细胞水平明显小于化疗后(P0.05);鼻咽癌组织中Fas蛋白相对表达水平明显低于鼻息肉组织(P0.05);且鼻咽癌组织中CD44s与CD44v6蛋白相对表达水平明显高于鼻息肉组织(P0.05);鼻咽癌组织中EBV BART miRNA表达水平与Fas蛋白相对表达水平、CD4~+T细胞水平呈明显负相关(P0.05);鼻咽癌组织中EBV BART miRNA表达水平与CD44s和CD44v蛋白相对表达水平、CD8~+T细胞水平呈明显正相关(P0.05)。结论 EBV BART miRNA在鼻咽癌组织中呈高表达;EBV相关抗体在鼻咽癌患者血清中呈高表达;EBV BART miRNA可能通过影响免疫来介导鼻咽癌的发生发展。     

094 EBV转化的B淋巴母细胞系的建立及应用

EBV转化B淋巴细胞后,形成永生化的B淋巴母细胞系(B-LCL).B-LCL在体外能无限增殖,广泛应用于医学生物学研究领域.本文就EBV对B淋巴细胞的转化机制、建立B-LCL应注意的问题以及B-LCL在细胞与分子遗传学、免疫学、EBV相关肿瘤的免疫治疗等方面的进展作一简要综述.     

永生化后细胞的生物学特性

近年来,永生化细胞技术快速发展,对细胞生物学特性的研究及其临床应用具有深远的意义.目前通过导入永生化基因SV40抗原和hTERT基因成为细胞永生化的常用方法,但存在安全性隐患.利用可逆性永生化技术,使细胞在获得永生化能力的同时去除永生化基因,使细胞恢复到原始状态.文章综述了永生化后细胞生物学特性的变化,并讨论了临床应用可能面临的问题.     

CpG基序联合EB病毒建立永生化B淋巴母细胞系

目的 体外建立慢性乙型肝炎患者永生化的B淋巴母细胞系(LCLs).方法 用EB病毒感染自慢性乙型肝炎患者外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CpG DNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性.光学显微镜下观察LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19和CD23的表达水平.结果 46例患者PBMC经EBV感染4周后,42例转化成永生化B淋巴母细胞系,成功率为91.3%.转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养.结论 CpG免疫调节基序联合EBV感染人PBMC,提高转化效率,转化后的LCL保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性,可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞.     

EB病毒蛋白诱导IgG和IgM产生的作用

目的:检测热灭活或紫外线(UV)灭活的EB病毒(EBV)刺激培养的人脐带血B细胞产生IgG和IgM的效应。方法:常规分离人脐带血单个核细胞(UBMC),以L-亮氨酸甲酯去除法,去除单核细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞,以2-氨乙基硫脲溴化物(AET)处理绵羊红细胞(SRBC)的花环形成分离法,去除T细胞以获得纯化的B细胞。分别用UV和热灭活的EBV刺激培养的B细胞后,用夹心ELISA法检测培养上清中IgG 和IgM的产生。结果:以UV灭活的EBV刺激培养B细胞后18 d起,IgG和IgM的产生具有意义(P<0.05);而热灭活的EBV刺激后,各时间点均无显著差异(P>0.05)。结论:UV灭活EBV具有诱导IgG和IgM产生的作用,但有明显的时效性,提示EBV诱导IgG和IgM产生,可能是通过病毒的蛋白成分实现的,为进一步验证EBV功能蛋白诱导天然自身抗体(NAA)产生中的作用奠定了基础。     

EB病毒蛋白对免疫球蛋白产生的调节作用

目的检验EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)蛋白对培养的人B细胞产生免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)的影响.方法用UV灭活和热处理的EBV刺激培养的人脐带血B细胞,流式细胞仪检测UV灭活EBV组细胞CD5、CD3、CD4和CD8的表达,ELISA法检测培养上清中IgG和IgM,同时与EBV转化B细胞产生的IgG和IgM 作对比.结果第14天未检测到T细胞,CD5+B 细胞占43%;28天时CD5+B细胞占47%.UV灭活EBV组第10、18、22和26天IgG A值与对照组相比有显著差异(P＜0.05),第10天以后各时间点IgM A值与对照组相比有显著差异(P＜0.05).EBV转化培养B细胞40天,IgG和IgM A值与同期其它各组有显著差异(P＜0.05).结论EBV蛋白有诱导Ig产生的作用.