抗人IgG抗体与丝裂霉素联合应用治疗膀胱癌的实验研究

目的 探讨抗人IgG抗体和丝裂霉素(MMC)联合应用对人膀胱癌细胞株的抑制作用及机制.方法 抗人IgG抗体和MMC单独或联合作用于人膀胱癌T24细胞,噻唑盐(MTT)法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪检测T24细胞的凋亡率,蛋白质印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和PARP的表达.采用T24细胞裸鼠移植瘤模型进行抗人IgG抗体和MMC的体内抗瘤实验.结果 单独应用抗人IgG抗体和MMC对T24细胞生长抑制率分别为(25.02±6.71)%和(32.31±6.46)%,而二者联用的抑制率达(73.66±5.81)%.PBS、25mg/L羊IgG、25mg/L羊抗人IgG抗体、2mg/L MMC、2mg/L MMCIk 25mg/L羊IgG和2mg/L MMC加25mg/L羊抗人IgG抗体处理T24细胞72 h后细胞凋亡率分别为1.7%、2.3%、20.7%、22.4%、28.3%和53.8%.羊抗人IgG抗体、MMC、MMC加羊IgG和MMC加羊抗人IgG抗体处理T24细胞72 h后出现17 000的Caspase-3和85 000的PARP剪切片断.体内实验显示羊IgG组、羊抗人IgG抗体组、MMC组、MMC加羊抗人IgG抗体组抑瘤率分别为2.31%、12.73%,36.81%和50.51%.HE切片观察见生理盐水组和羊IgG组移植瘤细胞基本无凋亡和坏死,羊抗人IgG抗体组肿瘤细胞凋亡和坏死增多,MMC组和MMC加羊抗人IgG抗体组则见大量肿瘤细胞凋亡和坏死.结论 抗人IgG抗体和MMC联合应用对膀胱癌具有体内外双重抗瘤作用,其抗瘤机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关.     

吡柔比星与丝裂霉素C对膀胱癌T24细胞株抑制作用的实验研究

目的探讨吡柔比星（THP）与丝裂霉素C（MMC）对膀胱癌T24细胞株的抑制作用。方法将膀胱癌T24细胞株分为4组,分别给予THP、MMC、THP＋MMC和MMC＋THP。用MTT法测定T24细胞的增殖抑制率,用TuNEL法检测T24细胞的凋亡情况。结果THP、MMC、THP＋MMC和MMC＋THP四组的增殖抑制率（％）分别为54．3±6．4,48．9±7．2,62．3±5．9,69．1±6．2;凋亡指数（％）分别为6．2±2．5,4．4±2．7,6．7±3．0,7．4±3．2。联合用药组对T24细胞的抑制作用优于单药THP和MMC对肿瘤细胞的抑制作用（P〈0．05）。在联合用药组中,MMC＋THP组对T24细胞的抑制作用优于THP＋MMC组对肿瘤细胞的抑制作用（P〈O．05）。结论THP和MMC均可抑制膀胱癌T24细胞株的增殖并诱导凋亡,两药序贯联合用于膀胱灌注化疗可能具有合理性。     

VEGF-C对膀胱癌T24细胞增殖与丝裂霉素诱导T24细胞凋亡影响的研究

目的:探讨VEGF-C对膀胱癌T24细胞增殖及抑制丝裂霉素(MMC)诱导T24细胞凋亡的影响。方法:采用MTT及流式细胞术(FCM)等方法观察不同浓度(0、50、100、200μg/L)VEGF-C对T24细胞生长及MMC诱导的T24细胞凋亡的影响。所有实验重复3次。结果:随着预处理VEGF-C浓度的增加,T24细胞的增长率由27.3%上升到65.0%;MMC诱导的T24细胞凋亡率由29.5%下降至14.0%。结论:VEGF-C促进膀胱癌T24细胞的增殖和抑制MMC诱导的细胞凋亡;抑制VEGF-C作用通路可能防治膀胱癌复发。     

人工合成拟Smac融合多肽促低剂量丝裂霉素C诱导膀胱癌细胞凋亡的研究

目的:探讨人工合成拟Smac融合多肽(SmacN7)对低剂量丝裂霉素C(MMC)诱导的膀胱癌T24细胞凋亡的促进作用.方法:运用固相多肽合成技术人工合成SmacN7细胞可穿透性融合多肽,将0.05mg/mlMMC诱导的膀胱癌T24细胞与50～500 μg/L的SmacN7融合多肽共同孵育4～48 h,采用Annexin-V荧光染色技术检测肿瘤细胞凋亡情况;应用流式细胞术和MTT比色法检测诱导后T24细胞凋亡率、增殖抑制率与SmacN7的时间和浓度的效应关系.结果:50～500 μg/L SmacN7作用4～48 h,肿瘤细胞出现典型的凋亡形态学改变,随着SmacN7浓度的增加或药物作用时间的延长,肿瘤细胞凋亡率也增加,12 h为5.67%～56.12%,24 h为14.54%～65.24%,48 h为31.48%～87.23%,同时细胞增殖抑制率出现明显增加,药物作用12 h、24 h、48 h后,增殖抑制率分别为9.58%～63.42%、28.94%～72.3%、44.7%～87.12%.结论:SmacN7能够有效地促进低剂量MMC诱导的膀胱癌T24细胞凋亡,并具有时间和浓度依赖性,为膀胱肿瘤的生物治疗提供了新思路.     

肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体联合化疗药物治疗膀胱癌的研究

目的　探讨肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体 (TRAIL)治疗膀胱肿瘤的作用 ,以及与化疗药物的协同作用。方法　将T2 4及 5 63 7膀胱肿瘤细胞接种至 96孔培养板后分别加入浓度为1、10、10 0 μg/L的TRAIL ,0 .1、1.0、10 .0mg/L的阿霉素 (ADM )和丝裂霉素 (MMC) ,不同浓度的TRAIL、ADM、TRAIL和MMC ,噻唑蓝比色 (MTT)法分别检测肿瘤细胞的生存率。将膀胱肿瘤细胞接种至 12孔板 ,培育 2 4h后加入不同浓度的TRAIL、ADM、MMC、TRAIL联合ADM、MMC。用流式细胞术检测不同处理组肿瘤细胞的凋亡率和死亡率。结果　 10 0 μg/LTRAIL引起T2 4、5 63 7细胞的凋亡率分别为 2 0 .1%、45 .3 % ,与无药物组 1.1%、3 .5 %的凋亡率比较差异有非常显著性(P <0 .0 1)。单独运用 10mg/LMMC、ADM对T2 4、5 63 7的抑制率分别为 3 6.0 %、44 .1%、2 6.7%、3 0 .2 % ;而 10 0 μg/LTRAIL和 10mg/LMMC、ADM联合后对T2 4、5 63 7的抑制率分别达到 5 8.4%、73 .7%、90 .7%、88.2 % ,两者有明显的协同作用 (P <0 .0 5 )。结论　在体外实验中 ,TRAIL可通过诱导肿瘤细胞的凋亡而产生抗膀胱肿瘤的作用 ;TRAIL与化疗药物ADM、MMC有协同抗肿瘤作用     

粉防己碱对膀胱癌BIU-87/ADM细胞株的耐药逆转作用及其机制

目的 探讨粉防己碱(TET)对膀胱癌耐药株BIU-87/ADM多药耐药性(MDR)的逆转作用及其机制。方法 应用CCK法观察不同浓度TET( 1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)对BIU-87和BIU-87/ADM细胞生长的抑制作用,并测定1 mg/L TET逆转多药耐药的活性;Annexin-V与PI双染法流式细胞术分析1 mg/L TET对细胞凋亡的影响;免疫荧光法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测1 mg/L TET对P-gp蛋白和MDR1表达水平的影响;细胞免疫化学法和RT-PCR法检测1 mg/L TET对BIU-87/ADM细胞Caspase-3和Survivin表达水平的影响。结果 1.0 mg/L无毒剂量下的TET显著增加阿霉素(ADM)对耐药株BIU-87/ADM的细胞毒性作用(P＜0.01),逆转指数(RF)为5.33,而对敏感株BIU-87无明显作用(P＞0.05),RF为1.33;1.0 mg/L TET和1.5 mg/LADM共同作用48 h,能使BIU-87/ADM细胞凋亡率增加至(40.86±4.35)％,与单独应用ADM的(12.42 ±3.24)％比较差异有统计学意义(P＜0.01)。而BIU-87细胞凋亡率为(61.23 ±5.46)％,与单独应用ADM的(57.79±4.73)％比较差异无统计学意义(P＞0.05)。TET能明显抑制mdr1mRNA和P-gp蛋白在BIU-87/ADM的表达;与单用ADM比较,TET和ADM联用能使BIU-87/ADM细胞株中Caspase-3的表达水平明显升高(P＜0.01),Survivin的表达水平显著降低(P＜0.01)。结论 粉防己碱能逆转BIU-87/ADM细胞的多药耐药性,这一作用可能与粉防己碱抑制P-gp的表达和增强化疗药诱导细胞凋亡有关。     

赫赛汀联合丝裂霉素C对人膀胱癌T24细胞生长的抑制作用

目的 探讨赫赛汀(Herceptin,HER)联合丝裂霉素C(MMC)对HER-2/neu基因高表达人膀胱癌细胞株生长的抑制作用.方法 应用免疫细胞化学法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测膀胱癌T24细胞株HER-2/neu的表达;采用噻唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度HER(10、20、40、80、160μg/L)、MMC(4、8、16、32、64μg/L)及联合用药对人膀胱癌T24细胞株体外生长的抑制率并进行比较.结果 应用免疫细胞化学方法及RT-PCR法检测证实HER-2/neu在膀胱尿路上皮癌T24细胞株高表达;单用HER于72 h出现细胞抑制(72 h时各浓度组分别与48 h时比较,均P<0.05);HER和MMC联用在24、48、72 h基本上均表现为协同作用(q值1.264～3.473),在96 h呈相加作用(q值0.913～1.138).结论 HER-2/neu在膀胱尿路上皮癌T24细胞株高表达;HER单药对T24细胞有轻度抑制作用,且起效慢(72 h);与MMC联合应用能协同抑制T24细胞生长.     

丝裂霉素对膀胱癌EJ细胞作用机制的研究

目的　从诱导坏死和凋亡角度探讨丝裂霉素 (MMC)对膀胱癌EJ细胞的作用机制。　方法　将不同浓度的MMC作用于膀胱癌EJ细胞 ,在不同时间内采用流式细胞术 (FCM )和 3’末端脱氧核苷酸转移介导生物素 (TUNEL)及伊红排斥实验检测EJ细胞的凋亡情况和对其的杀伤作用。　结果　不同浓度的MMC在 2 4h内可以持续诱导EJ细胞凋亡 ,MMC 0 .1mg/ml组 2 4h时凋亡率为 71% ,对EJ细胞的杀伤作用与剂量呈正比。　结论　MMC对膀胱癌EJ细胞的抑制作用是通过促凋亡机制和促坏死机制完成的     

半胱氨酸蛋白酶32在丝裂霉素C诱导膀胱癌细胞凋亡中的作用

目的　探讨半胱氨酸蛋白酶 32 (caspase 3)在丝裂霉素C(MMC)诱导膀胱癌EJ细胞凋亡中的作用。　方法　采用末端脱氧核苷酸转移酶介导生物素标记法 (TUNEL)和流式细胞术 (FCM)研究EJ细胞凋亡及细胞周期变化 ,分析caspase 3抗体对低剂量MMC诱导EJ细胞凋亡的影响。　结果　TUNEL法显示MMC组EJ细胞出现细胞凋亡特有的形态学特征 ,凋亡指数 (6 2 .9± 2 .2 ) % ,较cas pase 3抗体加MMC组 (4.9± 0 .3) %和空白组 (2 .7± 0 .7) %显著增高 (P <0 .0 0 1)。FCM检测结果明 ,MMC主要诱导G0 /G1期细胞凋亡而出现凋亡峰 ,凋亡率 2 6 .0 6 % ;caspase 3抗体能特异性抑制MMC诱导EJ细胞凋亡 ,凋亡率仅为 4.6 5 %。　结论　低剂量MMC对caspase 3的活化在诱导膀胱癌细胞凋亡中有重要作用。     

丝裂霉素联合雷帕霉素对人膀胱癌T24细胞抑制作用的比较研究

目的:观察丝裂霉素(MMC)联合雷帕霉素(RAPA)对体外培养的人膀胱癌T24细胞抑制作用是否比单药大。方法:体外培养人膀胱癌T24细胞,通过MTT实验及相关公式计算,得出MMC和RAPA的IC50值,以此值及相关药量应用于膀胱癌T24细胞,经24、48h,比较两种药物单用及联合用药(全量及半量)对癌细胞的抑制率,得出抑制率最高的药物(两种单药或联合用药)。采用方差分析、SNK-q检验分析得出结果。结果:MMC、RAPA的IC50值分别为12μg/ml、125μg/L(最后实验所用)。两种药物单用及联合用药的24h抑制率最高的是MMC联合RAPA,全量及半量联合的抑制率差异无统计学意义,两者抑制率分别为63.64%及73.68%;MMC联合RAPA比单药的抑制率高,差异有统计学意义;与单药48h抑制率比较,MMC联合RAPA的抑制率差异无统计学意义(其中MMC联合RAPA全量联合的抑制率最大,为98.53%),但是高于RAPA的抑制率,差异有统计学意义。结论:MMC联合RAPA对体外培养的人膀胱癌T24细胞抑制作用比单药大。     

羟基喜树碱与吡柔比星联合应用对膀胱癌5637细胞株影响的体外研究

目的：研究羟基喜树碱与吡柔比星联合应用对膀胱癌5637细胞生长的抑制作用。方法：将所培养的5637细胞分为五组．未加药5637细胞组、羟基喜树碱（HCPT）单药组、吡柔比星（THP）单药组、先羟基喜树碱后吡柔比星联合用药组、先吡柔比星后羟基喜树碱联合用药组。用RT-PCR检测残存细胞所表达的耐药基因（mrp-4，mrp-1，mdr-1），用MTT方法测定各组细胞的抑制情况。结果：联合使用对5637细胞增殖抑制作用优于单药THP和HCPT对肿瘤细胞的抑制作用。单用HCPT，残存的细胞中表达mrp-1和mdr-1。单用THP、残存的细胞中表达mrp-4和mdr-l。联合使用HCPT和THP后，残存细胞中仅表达mdr-1，两者联合应用起到了降低肿瘤细胞耐药性的目的。结论：HCPT和THP联合用于膀胱内灌注化疗具有联合化疗用药的合理性。     

槐耳清膏体外逆转人肝癌细胞HepG2/ADM多药耐药性

目的探讨槐耳清膏体外逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用及可能的机制。方法MTT法检测槐耳清膏的细胞毒作用和处理前后耐药细胞对化疗药物的敏感性;流式细胞仪检测细胞内阿霉素浓度;RT-RCR检测MDR1基因的表达。结果槐耳清膏在0.01g/L以下剂量时对HepG2和HepG2/ADM耐药细胞株的抑制率均<10%,半数抑制率(IC_(50))分别为0.917 g/L和1.66 g/L,无细胞毒剂量即0.008 g/L的槐耳清膏能部分逆转HepG2/ADM细胞的耐药性,与之合用使耐药肝癌细胞对阿霉素、顺铂、丝裂霉素、氟尿嘧啶的相对逆转效率分别为79%、73.5%、97.4%和86.7%,HepG2/ADM细胞内阿霉素浓度明显增加,MDR1表达下降了33.7%。结论槐耳清膏具有体外逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用,可能与下调MDR1表达、增加细胞内化疗药物积累有关。     

黑色素瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24促进阿霉素杀伤肝癌细胞MHCC-97L机制的研究

目的 探讨黑色紊瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24(MDA-7/IL-24)基因促进阿霉素(ADM)杀伤肝癌细胞,逆转肝癌细胞多药耐药(MDR)的机制.方法 以人肝癌细胞株MHCC-97L为实验对象,使用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪比较Ad. MDA-7联合ADM处理组与ADM组、Ad. MDA-7组对肝癌细胞MHCC-97L和正常肝细胞L02的作用差异.观察MDA-7/IL-24对多药耐药的逆转作用.荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测MDR-1、STAT-3、bcl-2、bax mRNA的变化.Western blot检测gp-170、STAT-3、bcl-2、bax蛋白的表达的变化.结果 MTT表明Ad. MDA-7对正常肝细胞LO2无生长抑制作用(P>0.05).LO2细胞Ad. MDA-7联合ADM组与ADM组细胞生存率差异无统计学意义(P>0.05).低浓度(100 VP/cell)的Ad. MDA-7联合正常肝细胞的IC50浓度的ADM(1.5 mg/L)使得细胞抑制率从ADM组的17.46%上升到79.50%,生长抑制逆转4.55倍(P<0.05).MDR-1mRNA相对表达量从(16.49±0.11)下降至(5.48±0.05).STAT-3 mRNA相对表达量从(13.17±0.08)上升至(21.57±0.11).bcl-2及BAX表达与其他实验组比较差异均有统计学意义(P<0.05).联合实验组P-170蛋白的表达量较其他组明显降低,而磷酸化STAT-3蛋白的表达量亦增加.结论 Ad. MDA-7具有逆转肝癌细胞MHCC-97L多药耐药的作用,其下调MDR-1 mRNA的表达的同时,并通过活化STAT-3信号通路的表达促进肝癌细胞凋亡.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合阿霉素治疗骨肉瘤

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）与阿霉素（ADM）联用对骨肉瘤细胞株HOS是否具有协同杀伤作用，并对其机制进行初步研究。方法 MTT法检测细胞的抑制率和存活率，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测TRAIL受体（receptor，R）的表达水平。结果 单用0．5mg／LTRAIL及1．0、10．0、100．0mg／LADM对HOS8603的抑制率分别为13．18％、5．56％、23．02％和76．72％，联合用药的抑制率分别为42．98％、53．12％、81．91％。0．5mg／LTRAIL和1．0mg／LADM有协同作用．TRAIL和ADM联用时TRAIL R2 mRNA表达较TRAIL单用时明显增强。结论 TRAIL与ADM联用对骨肉瘤细胞有明显的协同作用，其机制可能与ADM上调TRAILR2的表达有关。     

异丙酚对内毒素诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞P2X7受活化和IL-1β蛋白合成的影响

目的 探讨异丙酚对内毒素诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞P2X7受体活化和IL-1β蛋白合成的影响.方法 RAW264.7巨噬细胞经1 μmol/L亮蓝G(BBG)或1～100 μmol/L异丙酚孵育20 min,随后经1 μg/ml LPS孵育4 h,采用ELISA法测定IL-1β的释放量,采用Western blot法测定胞内IL-1β前体蛋白和成熟体蛋白含量,并计算异丙酚抑制IL-1β释放的半数有效浓度(IC_(50)).采用全细胞膜片钳记录模式,RAW264.7巨噬细胞经1 mmol/L ATP孵育5s,以诱发P2X7受体门控离子通道电流,分别经1～1 000μmol/L异丙酚孵育4 min后记录电流峰值,计算异丙酚抑制P2X7受体门控离子通道电流峰值的IC_(50).结果 异丙酚可抑制LPS诱导的IL-1β的释放,其IC_(50)为(24±3)μmol/L.异丙酚可抑制P2X7受体门控离子通道电流峰值,其IC_(50)为(33±5)μmol/L.LPS可上调胞内IL-1β前体蛋白表达(P<0.01),而3～100μmol/L异丙酚可抑制LPS介导的胞内IL-1β前体蛋白表达上调.结论 异丙酚抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞IL-1β的释放可能与抑制P2X7受体的活化和胞内IL-1β前体蛋白的合成有关.     

经尿道膀胱肿瘤电切术中羟基喜树碱单次大剂量灌注与术后多次常规剂量灌注化疗预防膀胱癌复发的比较

目的：比较TURBT术中羟基喜树碱单次大剂量灌注与术后多次常规剂量灌注化疗预防膀胱癌复发的疗效与不良反应.方法：浅表性膀胱癌101例均行TURBT术.随机分为两组,第1组（49例）,手术结束时立即单次膀胱灌注羟基喜树碱30 mg;第2组（52例）,术后1周开始灌注,剂量20 mg,第周1次,8次后改为每月1次,至术后24个月.比较它们的疗效与不良反应.结果：随访36个月,第1组和第2组总复发率分别为18.4%和15.4%,两组间比较差异无统计学意义（P=0.67）;第1组和第2组总不良反应率分别为12.2%和30.8%,两组间比较差异有统计学意义（P=0.02）.结论：羟基喜树碱术中单次大剂量灌注预防浅表性膀胱癌术后复发疗效与术后多次常规剂量灌注化疗效果相当,而不良反应发生率低,费用少.     

槐耳清膏联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肝癌细胞生长的影响

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）联合中药槐耳清膏对肝癌细胞株HepG2及肝癌耐阿霉素（ADM）细胞株（HepG,．ADM）的作用。方法通过培养液中ADM的浓度梯度递增法筛选培养,建立肝癌细胞HepG2-ADM耐药细胞株;TRAIL,TRAIL＋ADM,TRAIL＋槐耳清膏分别处理肝癌细胞株HepG2、HepG,-ADM及正常肝细胞株L02,噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果联合用TRAIL（100ng／L）和槐耳清膏（1．0g／L）处理肝癌细胞株HepG2-ADM及肝细胞株L02,MTT显示对前者增殖有明显抑制作用,而对后者无明显作用;流式细胞仪检测TRAIL联合槐耳清膏处理HepG2、HepG2-ADM,可诱导细胞凋亡,与其他组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论槐耳清膏可显著增强TRAIL对HepG2及HepG2-ADM的杀伤作用,而对正常胎肝细胞株L02杀伤作用轻微,TRAIL和槐耳清膏联合应用可望克服肿瘤细胞中存在的化学治疗药物耐药和TRAIL耐受问题。     

羟基喜树碱对高危浅表性膀胱癌模型5637细胞的凋亡作用研究

目的：观察羟基喜树碱（HCPT）对高危浅表性膀胱癌模型5637细胞的凋亡作用,研究HCPT不同作用时间和不同浓度对5637细胞的影响,进一步讨论HcPT在膀胱灌注化疗中的作用。方法：采用四甲基偶氮唑盐（MIT）检测不同浓度、不同作用时间下HCPT对5637细胞增殖的影响;采用流式细胞术测定低浓度（5μmol／L）、不同作用时间（12、24h）HCPT诱导5637细胞的凋亡率;用Hochest33258染色观察细胞凋亡情况;采用荧光定量PCR检测5μmol／L HCPT作用5637细胞12h相较未加药5637细胞中凋亡相关基因的变化。结果：5μmol／L HCPT作用5637细胞12h后,早期凋亡细胞占23.5％。HCPT随着作用时间的延长,凋亡率并不会随之增加,HCPT诱导凋亡的作用在肿瘤细胞与药物作用后的某一时间点达到高峰。Hochest33258染色和荧光定量PCR检测凋亡相关基因也证明HCPT这一浓度在这一时间点有诱导癌细胞凋亡的作用。结论：羟基喜树碱具有诱导高危浅表性膀胱癌细胞凋亡的作用。适当延长药物作用时间,可以促进其药效的发挥。