人Ⅰ型补体受体重组腺病毒的构建和鉴定

目的 构建并鉴定CR1重组腺病毒，为有关基因转染研究作准备。方法 CR1目的基因经酶切插入pAxCAwt载体，构建成CR1—pAxCAwt重组粘粒。磷酸钙共沉淀法转染295细胞获取重组腺病毒。结果 GR1—pAxCAwt重组粘粒插入方向正确，所获腺病毒为复制缺陷型sCR，重组腺病毒。结论 采用的粘粒构建、转染方法可行，所获重组腺病毒可靠。     

传染性软疣病毒MC148基因腺病毒重组粘粒构建

目的 构建传染性软疣病毒（MCV）MC148基因腺病毒重组粘粒。方法 从软疣小体中提取病毒DNA，经PCR扩增后构建于pUC19克隆载体上。对克隆产物测序后，与粘粒pAxCAwt定向重组。结果 克隆出MC148基因并构建了pAxCAwt-MC148粘粒重组体。结论 本方法建立为研究MC148基因转染对趋化因子的拮抗作用奠定基础。     

FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的实验研究

目的 构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域(FnCBD64)基因重组人腺病毒载体(Ad.FnCBD64).方法 (1)FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建;(2)293细胞和Hela细胞的培养;(3)磷酸钙转染;(4)FnCBD64基因重组腺病毒筛选和扩增;(5)设计腺病毒粘粒载体pAxCAwt公共PCR引物;(6)鉴定Ad.FnCBD64重组腺病毒;(7)浓缩与纯化重组腺病毒;(8)体外安全性研究.结果 成功构建了纤维连接蛋白羧基端细胞结合域(FnCBD64)基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64,病毒滴度较高且安全性亦高.结论 本实验成功构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒,为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞黏附力提供了转染的载体,其使骨髓间质干细胞更快、更好地在体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能.     

aFGF重组腺病毒载体的构建、转染效率和使用安全性的初步研究

目的：旨在构建人酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibrolast growth factor,aFGF）重组腺病毒载体，为基因转染的研究作准备。方法：将用于转染的重组粘粒和DNA－TPC混合后，以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293细胞，获取重组腺病毒。结果：重组腺病毒DNA经酶切鉴定为正确，所得重组腺病毒为E1缺陷型并带有aFGF基因，同时证明重组腺病毒体外转染效率高且使用安全，结论：此重组缺陷型腺病毒载体可用于体内基因治疗研究。     

腺病毒介导的反义血管内皮生长因子基因转染治疗胰腺癌的实验研究

目的：构建并鉴定反向插入VEGF165cDNA的重组腺病毒,探讨腺病毒介导的VEGF165反义核酸治疗胰腺癌的可行性。方法：应用基因重组技术，将513bp的人VEGF165cDNA反向克隆入腺病毒粘粒载体pAxCAwt。重组粘粒与腺病毒DNA－TPC混合后以磷酸钙共沉淀法转染293细胞制备重组腺病毒。建立胰腺癌裸鼠皮下种植瘤模型，瘤体内直接注射重组腺病毒，观察肿瘤的生长及血管生长情况。结果：成功构建了反向插入VEGF165cDNA的腺病毒粘粒载体pAxCAwt-αVEGF并制备出高滴度的重组腺病毒。实验第5周时肿瘤生长速度Ad-αVEGF治疗组比PBS和Ad-LacZ对照组均明显减慢（P＜0．01）；肿瘤微血管密度Pd-αVEGF治疗组比两个对照组均明显减少（P＜0．01）。结论：腺病毒介导的VEGF165反义核酸可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤的生长，为抗血管生成的基因治疗提供了实验依据。     

内皮型一氧化氮合酶腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建重组内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达系统载体.方法eNOS的cDNA插入pcDNA3.1(-)中,进行DNA测序、酶切鉴定;插入片段用Xbal和AflⅡ双酶切后连接到pshuttle中,并予酶切鉴定;用P1-see I和I-ceu I双酶切下pshuttle中eNOS的cDNA插入腺病毒载体,通过PCR鉴定.结果正确构建重组eNOS腺病毒表达系统,并被目的基因的PCR鉴定证实.结论重组腺病毒表达载体构建正确,为其在预防经皮腔内动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定基础.     

内皮型一氧化氮合酶腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建重组内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达系统载体方法eNOS的cDNA插入pcDNA3．1(-)中，进行DNA测序、酶切鉴定；插入片段用XbaⅠ和AnⅡ双酶切后连接到pshuttle中，并予酶切鉴定；用PI—seeⅠ和I—ceuⅠ双酶切下pshuttle中eNOS的cDNA插入腺病毒载体，通过PCR鉴定，结果正确构建重组eNOS腺病毒表达系统，并被目的基因的PCR鉴定证实。结论 重组腺病毒表达载体构建正确，为其在预防经皮腔内动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定基础。     

新型Smad7 重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7).方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy 1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7.RT PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况.结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT PCR检测证实Smad7表达增强.结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础.     

携hVEGF165基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的　构建携带人血管内皮生长因子 16 5 (hVEGF165)基因的重组腺病毒载体。方法　将hVEGF165cDNA亚克隆到腺病毒中间载体pACCMV·pLpA ,再与pJM17共转染人胚肾 2 93细胞 ,获得载hVEGF165基因的复制缺陷型重组腺病毒 ,感染体外培养的兔主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC) ,通过RT PCR和Westernblot检测VEGF表达情况 ,并观察表达产物VEGF对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)增殖的影响。结果　重组腺病毒感染VSMC 4 8h后有VEGFmRNA转录及蛋白质的表达 ,并呈剂量依赖性地促进HUVEC增殖。结论　构建的重组腺病毒载体在VSMC中能够有效表达目的基因 ,且能有效促进HUVEC增殖 ,为hVEGF165基因的实际应用奠定了基础。     

GM-CSF基因腺病毒表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的构建人GM-CSF基因的重组腺病毒载体,探讨其在树突状细胞(DC)中的表达。方法设计一对GM-CSF基因上下游引物,以质粒pBlu-hGM-CSF为模板,经PCR扩增获得GM-CSF基因全部序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-GM-CSF。经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将2种重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,并感染人树突状细胞。结果完成构建含有人GM-CSF基因的重组腺病毒,病毒滴度Ad-GM-CSF 5.2×109pfu/mL。RT-PCR及ELISA检测证实GM-CSF在DC中表达。结论构建重组腺病毒载体,并在DC表达GM-CSF抗原蛋白。     

人血管生长素衍生物的重组腺病毒制备

目的：构建并鉴定血管生长素（ＡＮＧ）衍生物重组腺病毒,为心肌缺血区促血管生长因子基因转染研究作准备。方法：ＡＮＧ衍生物Ｄ１１６Ｈ－ＡＮＧ重组粘粒与腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染２９３人胚肾细胞株细胞。结果：酶切结果显示,重组粘粒中,Ｄ１１６Ｈ－ＡＮＧ插入方向正确,所获重组腺病毒带有ＡＮＧ衍生物基因。结论：所获重组腺病毒为Ｅ１,Ｅ３缺陷型,可进一步用于基因治疗研究。     

日本血吸虫14-3-3蛋白epsilon亚型基因扩增及表达载体的构建

目的　扩增日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建其表达载体 ,以研究其在血吸虫信号转导以及免疫预防和诊断方面的作用。方法　以日本血吸虫成虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链 ,设计合成引物 ,用PCR法扩增 1 4 3 3蛋白epsilon亚型基因编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体 ,双酶切和以质粒为模板的PCR鉴定后 ,将基因片段亚克隆入表达载体pBK CMV ,转染大肠杆菌BL2 1 ,经双酶切后鉴定。结果　RT PCR扩增出一条约 753bp的特异性条带 ,TA克隆重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT PCR扩增出大小相同条带 ,pBK Sj1 4 3 3表达载体经双酶切后也同样获得了一条约 753bp的特异性条带。 结论　在体外成功的扩增了日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建了 pBK Sj1 4 3 3表达载体 ,为进一步的免疫预防和免疫诊断研究提供了条件。     

登革2型病毒E抗原基因的RT—PCR扩增及表达载体的构建

扩增并克隆登革２型病毒Ｅ抗原基因，构建Ｅ抗原基因表达载体。方法应用ＲＴ－ＯＰＣＲ法，基因克隆和限制性内切除酶酶切分析。结果增殖病毒标准株并提取病毒总ＲＮＡ。在登革２型病毒Ｅ抗原基因两侧疏水区设计一对ＰＣＲ引物。     

含绿色荧光蛋白和HyTK基因双顺反子腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建一种带有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）和潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ＴＫ的融合基因（ＨｙＴＫ基因）的新型腺病毒载体，用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤中的转染效率和提高疗效。方法利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ），将ＧＦＰ的ｃＤＮＡ与ＨｙＴＫ真核表达载体重组，构建获得含ＧＦＰ和ＨｙＴＫ基因真核表达载体，在Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导下转染ＣＯＳ－７细胞，检测其表达后进一步克隆获得含ＧＦＰ和ＨｙＴＫ基因双顺反子腺病毒载体。结果构建含绿色荧光蛋白和ＨｙＴＫ基因双顺反子腺病毒载体，显示该载体可获得ＨｙＴＫ基因及ＧＦＰ的良好表达。结论含绿色荧光蛋白和ＨｙＴＫ基因双顺反子腺病毒载体的构建为ＨｙＴＫ基因治疗恶性肿瘤用于临床提供了新的治疗工具及随访检测手段。     

人骨形成蛋白-2基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的：克隆人骨形成蛋白-2（BMP-2）基因cDNA，构建含BMP-2基因的重组腺病毒载体。方法：采用RT-PCR方法克隆BMP-2基因cDNA，并插入克隆载体pGEM-T中进行全序列分析。将BMP-2基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中，构建pShuttle-BMP2重组质粒，再将其中的表达盒克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA-pAd-BMP。 结果：成功地克隆长约1 200 bp的BMP-2 cDNA，并成功地构建其腺病毒载体，经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞，包装、扩增后得到人骨形成蛋白-2重组腺病毒，其滴度约为1×10¹¹nfu•L^-1，该滴度可满足进一步的BMP-2成骨作用的研究。结论:成功地构建BMP-2腺病毒载体。     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.     

反义Smad3腺病毒表达载体的构建及体外表达

目的 构建在体外细胞中高效表达的反义Smad3腺病毒载体，探讨应用于基因治疗病理性瘢痕的可行性。方法 用DNA直接克隆连接的方法，构建反义Smad3腺病毒重组质粒，再用293细胞包装。重组腺病毒经扩增、纯化后，感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞，RT-PCR检测细胞中反义Smad3 mRNA的转录。结果 经酶切和PCR鉴定证实反义Smad3重组腺病毒质粒构建成功，RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的反义Smad3 mRNA的表达。结论 所构建的反义Smad3腺病毒表达载体可在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达，可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗的研究。     

小鼠耳蜗组织NT3基因的克隆及其原核表达鉴定

目的：克隆小鼠耳蜗组织中重要神经营养因子NT3的基因,并对其进行原核表达鉴定,为进一步研究该基因对内耳听觉功能的影响以及对耳聋的基因治疗提供基础。方法：根据所设计的引物用RT－PCR方法扩增目的基因,克隆人pUC19载体,行酶切鉴定和测序;然后进一步克隆人原核表达载体pDH,温度诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物。结果：RT－PCR得到长度为777bp的基因片段,克隆后酶切鉴定正确,测序结果经BLAST对比,与GenBank中小鼠NT－3序列完全一致。成功构建了原核表达载体,经温度诱导表达出NT3蛋白。结论：从耳蜗组织中能获得正确的NT3基因克隆以及稳定的原核表达,为后续实验提供了保证。