结核杆菌Ag85B的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的通过结核杆菌Ag85B基因的克隆和在大肠杆菌表达的研究,探讨Ag85B蛋白作为候选疫苗用于结核免疫预防和治疗的可行性。方法用PCR技术,扩增人结核杆菌Edman株Ag85B基因序列,并将扩增的DNA片段插入克隆质粒载体pUC18,用质粒酶谱和DNA序列分析鉴定重组克隆。克隆的Ag85B基因插入原核表达质粒pBV220,构建重组Ag85B表达质粒,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠杆菌表达的重组蛋白。结果成功克隆了结核杆菌Ag85B基因,构建了Ag85B的原核表达载体,获得了高效表达菌株,目的蛋白的表达量达菌体总蛋白的25％～30％。结论获得了高效表达人结核杆菌Ag85B成熟蛋白的工程菌株,为Ag85B保护性抗原位点分析和新型结核疫苗的研制奠定了基础。     

结核杆菌Ag85B的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：通过结核杆菌Ag85B基因的克隆和在大肠杆菌表达的研究,探讨Ag85B蛋白作为候选疫苗用于结核免疫预防和治疗的可行性。方法：用PCR技术,扩增人结核杆菌Edman株Ag85B基因序列,并将扩增的DNA片段插入克隆质粒载体pUC18,用质粒酶谱和DNA充阢分析鉴定重组克隆。克隆的Ag85B基因插入原核表达质粒pBV220,构建重组Ag85B表达质粒,用SDS－PAGE和Western blot鉴定大肠杆菌表达的重组蛋白。结果：成功克隆了结核杆菌Ag85B基因,构建了Ag85B的原核表达载体,获得了高效表达菌株,目的蛋白的表达量达菌总蛋白的25％－30％。结论：获得了高效表达人结核杆菌Ag85B成熟蛋白的工程菌株,为Ag85B保护性抗原位点分析和新型结核疫苗的研制奠定了基础。     

TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体.方法:提取胃癌组织总RNA,用TIMP-1基因引物进行RT-PCR,将扩增产物克隆至pGEM-T载体,PCR鉴定及测序证实后,BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pGEM-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C3中,并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析.结果:构建的pEGFP-C3-TIMP-1表达载体分别作PCR及双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与TIMP-1序列设计完全一致,将其转染人胃癌BGC-823细胞后,TIMP-1的表达定位在细胞胞浆内.结论:成功构建了TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体,为TIMP-1的肿瘤靶向治疗研究奠定了基础.     

人HMGB1真核表达载体的构建及其在单核细胞的表达

目的构建人高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达载体,并探讨其免疫调节作用。方法从HMGB1克隆载体酶切分离HMGB1基因片段,插入增强型绿色荧光蛋白载体pCITE EGFP,菌落PCR和酶谱分析鉴定重组载体。重组表达质粒转染人单核细胞系（U937）,梯度G418筛选,荧光和Western blot检测HMGB1的表达。结果菌落PCR和酶谱分析显示目的基因被正确插入真核表达载体,获得重组质粒pCITE EGFP HMGB1,转染U937细胞随培养基中G418浓度的升高而增强,转染细胞中目的蛋白HMGB1表达量明显升高。结论成功构建重组载体pCITE EGFP HMGB1,并获得稳定表达人HMGB1的单核细胞系,为研究HMGB1对单核巨噬细胞的作用及其机制奠定基础。     

靶向克隆法构建NY-ESO-1基因的原核表达载体

目的:利用PCR产物靶向克隆法构建人癌-睾丸抗原NY-ESO-1的原核表达载体。方法:从人新鲜的食管癌组织中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增NY-ES0-1基因3′端的340bp片段,采用靶向克隆法将目的基因插入到原核表达载体pET-15b中,得到重组表达质粒pET-15b-NY-ESO-1,经过筛选,挑选出阳性克隆进行XhoⅠ和BamHⅠ双酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物核苷酸序列分析等,鉴定所构建的原核表达载体。结果:扩增得到NY-ESO-1基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR,酶切鉴定获得了一个大小为340bp的特征性片段,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因NY-ESO-1。结论:靶向克隆法可快速、高效地构建人NY-ESO-1基因的原核表达载体,为制备pET-15b-NY-ESO-1融合蛋白奠定了基础。     

人血管内皮生长因子A(VEGFA)的原核载体构建、蛋白表达及鉴定

目的 克隆人VEGFA基因,与原核载体融合表达、纯化及其鉴定,并将其应用于肿瘤血管生长研究过程中.方法 采用PCR方法扩增人VEGFA序列,将其克隆入pGEX-KG原核载体,获得pGEX-KG-hVEGFA重组质粒.将该质粒转化入E.coli菌株BL21 (DE3),经IPTG诱导其表达,以GSTrap亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定融合蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hVEGFA基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒载体经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了hVEGFA基因片段.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hVEGFA.结论 融合蛋白在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、25℃条件下诱导表达,并获得纯化融合蛋白.采用Western Blot的方法可检测到目的融合蛋白GST-hVEGFA的表达.     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

人神经生长因子的A-T克隆及在Pichia Pastoris酵母中的表达

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定.方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肰的β-NGF基因序列;用A-r克隆法,与pGEM-T载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入CS115中,甲醇诱导分泌蛋白.结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SIS-PAGE电泳在14.OKD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性.结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性.     

Epstein-Barr病毒LMP1蛋白羧基端的克隆与原核表达

目的　构建PGEX 6P 3 CCT原核表达载体 ,获得大量纯化的LMP1羧基端蛋白。方法　通过RT PCR技术从B95 8细胞中扩增EBVLMP1CCTcDNA ,克隆至PGEM Teasy载体上并测序。利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将CCT基因插入PGEX 6P 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达 ,用SDS PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定 ,并用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化 ,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离。结果　扩增的LMP1CCT长度为 5 97bp ,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定 ,获得PGEX 6P 3 CCT原核表达菌株 ,Westernblot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合。获得约5 1kDa的PGEX 6P 3 CCT融合蛋白 ,分离纯化出约 2 1kDa的LMP1CCT蛋白。结论　成功获得EBVLM1CCT蛋白 ,为研究LMP1致瘤机制 ,研制生物抗癌药物奠定基础     

虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础?方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体?首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接?转化?提取质粒等方法克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci?表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒?经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性?结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性?结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础?     

单顺反子表达人GM-CSF和B7.1融合基因真核表达载体的构建和鉴定

目的　构建单顺反子表达人 GM- CSF和 B7.1融合基因真核表达载体。　方法　应用巨引物 PCR技术对 h GM- CSF基因 c DNA进行定点突变 ;应用 PCR重叠延伸法 ,将 h GM- CSF和 h B7.1基因的 c DNA编码序列通过一 linker序列拼接 ,构建 h GM- CSF与 h B7.1融合基因 h GM- B7.1,将其插入 pc DNA3真核表达载体 ,测定核苷酸序列。　结果　序列分析表明 :(1) h GM- CSF突变体基因 c DNA编码序列的 178位核苷酸由 C变为 A,其余核苷酸序列均未发生变化 ;(2 ) h GM- CSF、linker、h B7.1的连接顺序、方向及序列完全正确。　结论　构建 pc DNA3- h GM- B7.1融合基因真核表达载体成功     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

乙型肝炎病毒前S2/S与重组人GM-CSF融合基因的分子克隆及鉴定

目的为探讨乙型肝炎病毒前S2(preS2)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)对乙型肝炎疫苗的免疫增强作用,构建S2／S(preS2 HBsAg)与GM—CSF融合基因真核表达载体。方法采用PCR技术分别扩增出S2／S大小约846bp的编码基因片段和带有15个甘氨酸接头序列的GM—CSF约450bp编码基因片段,经T-A克隆后分布克隆至载体PcDNA3．1中,获得PcDNA3．1-S2／S-GM-CSF融合基因表达载体,利用酶切、PCR和DNA序列测定进行鉴定插入片段的大小和方向。结果经过鉴定该融合基因全长约1300bp,证实为S2／S-GM-CSF融合基因。结论乙型肝炎病毒(HBV)S2／S和GM—CSF融合基因真核表达载体构建成功,为进一步研究其表达和生物学活性奠定了一定基础。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

人细小病毒B19 NS1片段全长的克隆及表达

目的 :克隆人细小病毒B1 9非结构蛋白 1 (NS1 )全长基因 ,构建重组表达载体并诱导表达。　方法 :利用聚合酶链反应 (PCR)和分子克隆技术 ,从我科保存的B1 9阳性标本XA2 0中扩增NS1片段全长 ,构建NS1 pGEM T easy克隆载体并测序分析 ,测序证实序列正确后亚克隆于pQE30表达载体中 ,并转化至M1 5感受态菌中 ,经IPTG诱导可表达 770 0 0的融合蛋白。　结果 :成功克隆了人细小病毒B1 9NS1全长基因 ,构建了融合蛋白NS1 pQE30的重组表达质粒 ,表达的融合蛋白经 1 2 %SDS PAGE电泳证实为 770 0 0。　结论 :获得人细小病毒B1 9NS1全长基因及原核表达产物 ,对进一步研究NS1的生物学活性及其单克隆抗体的制备有重要意义。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达

目的 构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体，并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术．将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中，构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38，经EcoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定。脂质体法将其转入原代软骨细胞，通过荧光免疫细胞化学法鉴定其瞬时表达。结果 经EfoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因成功克隆入真核表达载体PsecTag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在软骨细胞膜及细胞浆中表达。结论 证实了IL-18-PE38融合基因可在软骨细胞中表达，为进一步研究其对类风湿关节炎的治疗奠定了基础。     

幽门螺杆菌双价亚单位分子内佐剂疫苗的构建表达与纯化

目的 克隆表达幽门螺杆菌外膜蛋白烷基过氧化氢还原酶ahpC、ureB414功能片段基因,与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建融合基因ahpC-ureB414-ltB(aul).方法 采用重叠延伸PCR的方法,以AhpC做为融合蛋白前端,与UreB414功能片段及黏膜佐剂ltB依次串联,在片段间引入5个氨基酸的柔性Linker GGGGS进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-22b( )中,经酶切及测序鉴定后转化宿主菌E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白ahpC-UreB414.ltB(AUL).融合蛋白经AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白.结果 PCR扩增出1 350 bp的目的 基因片段aul,工程菌pET22b-aul/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为50×103,与预期值一致,目的 蛋白约占菌体总蛋白的28.7%,重组蛋白用Ni2 -NTA树脂提纯.纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图像软件分析表明纯度可达85%以上.Western blot显示重组蛋白质具有良好的免疫反应性.结论 成功构建、表达融合蛋白rAUL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性.     

HBx-siRNA快速筛选体系的建立和应用

目的:建立针对HBx的小干扰RNA(siRNA)快速筛选体系.方法:①构建HBx与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)N端融合表达质粒;②用一步PCR法,制备针对HBx mRNA的RNA多聚酶启动子-siRNA表达框(SEC);③将SEC转染HBx-EGFP瞬时表达的AD293细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察分析SEC对HBx-EGFP荧光表达的抑制效果,从而确定有效siRNA.结果:①成功构建HBx-EGFP融合表达质粒pHBx-EGFP,在瞬时表达细胞中,HBx-EGFP绿色荧光主要呈颗粒状,聚集在核膜与核膜外周或细胞浆;②共转染SEC能有效抑制HBx-EGFP的瞬时表达.与siHBx271相比,siHBx388是一高效siRNA位点,并且该位点与tRNAVal和H1启动子搭配更有效.结论:成功建立表达HBx的荧光蛋白报告体系,结合快速制备SEC的方法,可用于进行HBx有效siRNA及其最适搭配启动子的快速筛选.     

人微小病毒B19 VP1基因原核表达克隆的构建

①目的　构建人微小病毒B19VP1基因的原核高效表达系统。②方法　通过PCR扩增B19病毒主要抗原决定簇VP1区段基因 ,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX 4T 2上 ,IPTG诱导表达融合蛋白 ,产物经亲和层析初步纯化 ,以Western Blot进行鉴定 ,并包被ELISA板 ,对临床血清进行检测。③结果　pGEX 4T 2 VP1可在大肠杆菌中高效表达 ,表达产物经纯化后可得单一目的蛋白条带。ELISA结果表明 ,其灵敏度、特异度等指标与德国Virion试剂盒有较好的符合率。④结论　该重组蛋白具有良好的抗原性 ,为研制和开发具有我国独立知识产权的B19病毒基因工程抗原ELISA诊断试剂盒提供了有价值的资料