结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化

目的: 获得结核分枝杆菌furA基因片段并高效表达、纯化. 方法: 用PCR技术从MTB毒株H37Rv-DNA中扩增出相应大小的DNA片段,将片段与pGEM-T-easy 载体连接后测序. 将测序正确的furA按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET-A,将连接产物转化入E.coli BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的(His)6融合蛋白. 对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化. 结果: PCR获得的furA序列与Genbank报道的一致(为453 bp). 重组载体在E.coli BL21中以可溶形式高效表达,融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,在Mr为23.0×103处有特异的蛋白条带,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的10%,重组蛋白经镍柱进行纯化后,得到了高纯度的FurA融合蛋白. 结论: 成功克隆结核分枝杆菌furA基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度FurA融合蛋白.     

结核分枝杆菌furB基因的克隆、表达和纯化

目的: 从H37Rv基因组中扩增furB并高效表达和纯化. 方法: 用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增furB序列,将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/furB,测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α,IPTG诱导目的蛋白表达. 经Western blot鉴定目的基因与(His)6融合表达,将已表达的蛋白质通过Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果: PCR得到结核分枝杆菌furB,测序结果与Genbank中报道的完全一致. SDS-PAGE显示,在Mr为15.0×103处有相应的蛋白质表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合表达蛋白. 经Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白. 结论: 成功克隆了铁调节蛋白基因furB序列,并在E.coli DH5α高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达纯化与鉴定

目的:表达和纯化RpfA融合蛋白.方法:将含有RpfA基因片段的质粒用NdeI与BamHⅠ双酶切,然后将目的基因片段克隆入pcDNA3.1 载体构建重组载体pcDNA3.1 -RpfA,测序正确后再将目的基因片段亚克隆入pET19b原核表达载体并转化E.coli DE3,IPTG诱导表达融合蛋白,Western blot鉴定融合蛋白.在变性条件下Ni2 -NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白.结果:目的基因片段测序与Genbank报道一致(切去了5'端99 bp).SDS-PAGE显示,在Mr约为80 ku处有表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合蛋白,并与小鼠抗Rv1884和抗Rv2389免疫血清有交叉反应.可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在.经Ni2 -NTA亲和色谱柱纯化得到了融合有6个组氨酸残基的RpfA融合蛋白.结论:成功构建了pET19b-RpfA表达载体,并在E.coli DE3中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:构建人CD81-LEL基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达. 方法:通过PCR扩增得到CD81-LEL基因编码区片段,与pMD18-T载体连接,经序列测定后,再将该扩增片段亚克隆入原核表达载体pET32a( )中.酶切鉴定正确的表达载体pET32a-CD81-LEL转化表达菌BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白. 结果:成功构建了原核表达载体pET32a-CD81-LEL;SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达且呈可溶性状态,Western-blot显示目的蛋白正确表达,并用镍离子亲和层析法获得纯化的重组蛋白. 结论:CD81-LEL可以在大肠杆菌中表达,为进一步研究CD81与丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白E2的结合提供了有用的研究资料.     

人前列腺干细胞抗原在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

目的:克隆并在大肠杆菌中表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)基因,制备其抗血清.方法:通过PCR方法扩增包含蛋白融合点的PSCA基因片段,经DNA测序证实后克隆至带有Trx.6His标签的原核表达载体pET32a,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果,经Ni-NTA树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠,ELISA检测抗血清的滴度,免疫组化鉴定其特异性.结果:PCR扩增得到241 bp的目的片段,序列测定证实与GenBank上登录的序列一致;成功构建了PSCA基因片段的原核表达载体pET32a-PSCA;在大肠杆菌中表达,于相对分子质量为20.4×103处有一蛋白新生带;PSCA融合蛋白免疫小鼠后,ELISA确认抗血清的滴度>1∶4 000.抗血清检测到前列腺癌组织中PSCA的表达. 结论:成功克隆、表达了人PSCA融合基因片段,并制备了相应的抗血清.     

两种分泌型人谷氨酸脱羧酶65片段DNA疫苗的构建与鉴定

目的:构建和鉴定分泌型人谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)65片段DNA疫苗.方法:从人GAD65质粒中扩增出GAD190-315和GAD490-570两个片段的cDNA,分别与hIL-2信号肽cDNA基因拼接,将拼接后的片段克隆入pBudCE4.1真核表达载体,测序鉴定,并用Western印迹检测融合基因的表达.结果:核酸序列测定表明克隆的融合基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western印迹检测显示这两种人GAD65片段分泌表达.结论:两种分泌型人GAD65片段DNA疫苗均成功构建,为1型糖尿病的预防提供了实验基础.     

PTD-SH2融合蛋白的原核表达和纯化

目的:构建含SH2与蛋白转导结构域(PTD)融合基因片段的重组表达载体,在大肠杆菌中进行表达并纯化蛋白. 方法: 通过PCR方法扩增出SH2基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD 的下游构建重组质粒pET-16b-PTD-SH2,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,将已表达的蛋白质通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果:构建了重组融合表达质粒pET-16b-PTD-SH2, 表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr为15×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的16%, 可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后得到了目的蛋白. 结论: 成功构建了PTD-SH2的重组表达载体,使融合蛋白在E. coli DE3中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为后续的SH2结构域的功能研究奠定了基础.     

小鼠CD36基因片段合成、表达及GST融合蛋白的表达和纯化

目的获取小鼠CD36基因片段,并高效表达和纯化GST-CD36融合蛋白。方法设计合成CD36的基因功能片段,测序后,通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2,构建重组表达载体,并导入E.coli BL21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果获得小鼠CD36基因片段,测序结果与GenBank的基因序列一致,重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量28.5kDa处,出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论合成小鼠CD36基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST-CD36融合蛋白。     

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究

目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的：构建热休克蛋白65（HSP65）与沙眼衣原体（C.trachomatis,Ct）主要外膜蛋白（MOMP）T细胞表位（简称ctm1）融合蛋白（简称H-ctm1）的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法：用PCR技术获得HSP65基因和ctm1基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctm1基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctm1的基因重组。用IPTG诱导转化H-ctm1表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果：构建了HSP65与ctm1的表达载体pET28a-H-ctm1,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98%的融合蛋白质。结论：用分子克隆技术正确构建HSP65与Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

目的克隆肝素结合血凝素（HBHA）基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pQE80L并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果克隆了HBHA基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析法得到28 kD纯化蛋白,与文献报道相符。     

大鼠Nogo基因片段的克隆及与GST融合蛋白的表达和纯化

目的: 获取大鼠Nogo基因片段并高效表达纯化. 方法: 用RT-PCR技术,从成年SD大鼠脊髓的总RNA中,获得编码Nogo基因功能片段的DNA. 测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体,并导入E. coli DH5α中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白. 对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化. 结果: 获得成年SD大鼠Nogo(570～691和1028～1089氨基酸残基)的基因,测序结果与已发表的基因序列相一致. 重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr) 39 000和32 000处,有特异的蛋白条带. 重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白. 结论: 成功克隆成年大鼠Nogo基因片段,并在E. coli DH5α中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白.     

人谷胱甘肽硫转移酶Pi基因的克隆、原核表达和蛋白纯化

目的:克隆人谷胱甘肽硫转移酶Pi(GSTPi)基因并在大肠杆菌中实现高效表达及蛋白纯化.方法:用RT-PCR技术从人胎盘组织获取人GSTPi基因的cDNA序列,将其扩增产物GSTPi基因插入到原核克隆载体pMD18-T中,用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒pMD18-T-GSTPi进行鉴定,将测序正确的GSTPi基因连接到表达载体pMAL-c2x多克隆位点中,构建重组表达质粒pMAL-c2x-GSTPi,鉴定后,用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷进行诱导表达,表达产物用麦芽糖亲和层析法纯化.结果:人GSTPi克隆到原核表达载体pMAL-c2x中,测序结果同GenBank序列比较,同源性为100%.通过诱导,在85 000的表达量约达到35%,麦芽糖亲和层析法纯化蛋白,纯度达到85%.结论:实现了解毒酶基因GSTPi的克隆和高效表达菌株的构建,并获取了高纯度的GSTPi蛋白.     

链霉亲和素-人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的制备与活性鉴定

目的:制备链霉亲和素(SA)连接的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白(SA-hGM-CSF),并对其生物学活性进行鉴定。方法:在NCBI数据库中查找SA和hGM-CSF序列，将序列合成后连接入Pet28表达载体中，构建SA-hGM-CSF-Pet28重组表达载体，在BL21(DE3)表达感受态中利用IPTG诱导剂诱导表达，经His镍柱纯化，尿素梯度复性，聚丙烯酰胺凝胶电泳法和蛋白质印迹法(WB)鉴定融合蛋白，通过TF-1细胞检测融合蛋白的生物学活性。结果:SA-hGM-CSF融合蛋白可在BL21(DE3)中高效诱导表达，经His镍柱纯化后该融合蛋白纯度较高。经尿素梯度复性后，细胞学实验验证该融合蛋白具有生物学活性。结论:成功表达具有生物活性的融合蛋白SA-hGM-CSF,该结果为SA-hGM-CSF表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研究提供了实验基础。     

藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定

目的:克隆藤黄微球菌Rpf基因,序列测定正确后进行融合表达纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法,从藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化.结果:获得藤黄微球菌Rpf基因,得到融合6个组氨酸残基的藤黄微球菌Rpf蛋白,可溶性分析发现融合蛋白主要在包涵体中存在,最后在变性条件下,用Ni2 -NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白,纯化获得的融合蛋白纯度大于90%,Western-Blot证实获得的蛋白为所需要的目的蛋白.结论:构建了藤黄微球菌Rpf基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达

目的:本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法:用PCR法扩增SRp55基因,将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠,亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果:SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达,随诱导时间的增加蛋白表达量增高,4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白,经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并获得GST-SRp55融合蛋白,为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。     

人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究

目的：在大肠杆菌中克隆和表达人源胸腺肽（thymosinβ4,TB4）基因并进行分离纯化及促血管生成生物活性鉴定。方法：人工设计TB4基因片段,其密码子为大肠杆菌所偏爱,将合成的寡核苷酸片段经分子克隆拼接成TB4基因片段,与pET28a（＋）载体连接成重组表达质粒pET28a-TB4,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达带His6-Tag的融合蛋白His6-TB4,通过镍柱亲和层析纯化,采用SDS-PAGE分析鉴定,由CAM试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果：经DNA序列分析鉴定,重组质粒pET28a-TB4构建成功,IPTG诱导后的融合蛋白His6-TB4在大肠杆菌中得到高效表达,并经一步镍柱亲和层析即获得纯化。CAM试验证明其有促进毛细血管生成的活性。结论：获得高效表达的、高纯度的His6-TB4融合蛋白,为TB4的进一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了基础。     

190CT3-myc融合多肽的制备及鉴定

目的通过基因重组的方法构建带有myc标签的190CT3功能多肽（190CT3-myc）。方法采用PCR技术对编码190CT3-myc融合多肽的cDNA序列进行扩增,克隆于T载体上,酶切及测序鉴定正确后构建带有myc标签的190CT3真核表达载体,通过脂质体转染入中国仓鼠卵巢癌（CHO）细胞中;经G418筛选,获得稳定表达目的基因的CHO细胞株,免疫荧光化学法鉴定。应用抗原抗体亲和层析柱纯化190CT3-myc融合多肽,SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色和Westernblotting分析鉴定。结果 PCR扩增得到编码为190CT3-myc的cDNA片段,经酶切和测序鉴定正确。免疫荧光化学法鉴定显示,转染重组质粒的CHO细胞稳定表达190CT3-myc。考马斯亮蓝染色显示,融合多肽190CT3-myc表达量占细胞总蛋白的10%左右,纯度≥90%;Western blotting分析表明,纯化融合多肽的相对分子量约为17000,与目的蛋白大小相符。结论成功制备190CT3-myc重组多肽,为抗白血病分子医药研究提供了新的思路。     

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV 16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件.方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp 的DNA片段.将所得片段与pGEX-KG 载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆.其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功.提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG 诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定.结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV 16L1抗体发生特异性反应.结论:HPV 16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础.