两种提取家蝇幼虫血淋巴方法的比较

目的:对剪头法和瞬时破壁法提取的家蝇幼虫血淋巴粗提液进行蛋白浓度和SDS-PAGE分析比较.方法:分别采用剪头法和瞬时破壁法提取家蝇幼虫血淋巴粗提液,同时设立未诱导组和热诱导组,测定各组的蛋白浓度进行比较分析,并对各组血淋巴粗提液进行SDS-PAGE的分析比较.结果:剪头法热诱导组的血淋巴粗提液蛋白浓度高于未诱导组,瞬时破壁法提取的血淋巴粗提液蛋白浓度高于剪头法;经SDS-PAGE分析,瞬时破壁法提取的血淋巴粗提液蛋白条带明显多于剪头法.结论:瞬时破壁法提取家蝇幼虫血淋巴简便易行,所提取的血淋巴蛋白成分多于剪头法.     

变异链球菌黏结素的提取及检测

目的:通过氯仿抽提法提取变异链球菌黏结素蛋白。方法:变异链球菌国际标准菌株经活化、液体培养,其表面的黏结素成分能分泌到液体培养基中,通过氯仿抽提法提取变异链球菌黏结素蛋白。对黏结素成分进行SDS-PAGE电泳分析、含量测定和抗原性检测。结果:在细菌培养液中提取到了变异链球菌表面分泌的黏结素成分。SDS-PAGE电泳分析显示是一组混合蛋白;蛋白含量测定黏结素蛋白浓度为0.7mg/ml;抗原性检测显示提取蛋白中含有变异链球菌抗原,具有抗原活性。结论:氯仿抽提法能快速提取变异链球菌黏结素蛋白。     

白花鬼针草花粉过敏原的分离鉴定与纯化

目的提取和分离纯化白花鬼针草花粉主要过敏原,并鉴定主要过敏原的致敏性。方法提取白花鬼针草花粉蛋白粗提液,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白组分并测定其分子质量,经离子交换层析法分离纯化几类主要的蛋白,Western blotting分别检测其与花粉过敏患者血清IgE结合情况及10位正常人阴性混合血清结合情况,对比鉴定每种主要蛋白质致敏原的致敏性。结果 SDS-PAGE结果示:在12.5~120ku之间广泛分布了20余条蛋白条带,其中主带7条,分子质量在35~70ku和10~15ku的区带蛋白含量最为丰富,余下的范围内还有约10余条次带。Westen-blotting检测示:白花鬼针草花粉变应原的致敏性强,与花粉过敏患者血清特异性IgE结合大。离子交换层析出6类主要变应原蛋白,其分子质量分别为70、65、54、49、39及33ku;阴性对照组Westen-blotting在70ku处有弱显色。结论白花鬼针草花粉的主要过敏原为70、65、54、49、39及33ku;70ku变应原致敏性最强。     

日本血吸虫成虫和虫卵可溶性抗原及其组分抗原的研究

目的:探讨日本血吸虫雄虫、雌虫、虫卵的可溶性抗原雄虫(AWA-m、雌虫AWA-f、虫卵SEA)及其组分抗原的特性.方法:用DE22纤维素层析柱对日本血吸虫AWA-m,AWA-f,SEA抗原进行纯化,得到相应组分抗原.分别以SDS-PAGE和Western blot对组分抗原进行全面分析,并与相应未经纯化的可溶性抗原作比较.结果:经DE22纤维素层析处理的AWA-m,AWA-f,SEA,均能获得含多种蛋白的组分抗原.SDS-PAGE结果表明,AWA-m见10条主带和9条次带,其中Mr 37 000,28 000,25 000为特异性条带,出现8条免疫反应阳性带;而AWA-m组分抗原为9条蛋白带和6条免疫反应阳性带.AWA-f见15条蛋白带,其中Mr 26 500为特异性条带,组分抗原为8条蛋白带.AWA-f粗抗原及其组分抗原均见9条反应带.SEA见8条主带和10条次带,13条为免疫反应阳性条带;SEA组分抗原见11条带,其中9条为免疫反应阳性带.结论:AWA-m,AWA-f,SEA经DE22纤维素层析纯化获得组分抗原,方法简单、可靠.该组分抗原含有粗抗原的主要免疫反应成分,去除了多种与日本血吸虫病免疫反应无关的蛋白.     

日本血吸虫成虫分泌抗原的鉴定

目的制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原,对其免疫原性以及免疫反应性进行初步鉴定。方法日本血吸虫尾蚴感染家兔,42 d后剖杀获取成虫,将虫体置无血清DMEM培养基中,5%CO2孵箱37℃培养4 h,得到成虫分泌代谢抗原;用该抗原免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体反应;用该抗原包板,ELISA法检测血吸虫感染人血清抗体效价;采用十二烷基硫酸钠聚丙酰烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其组分进行分析,然后用Western blot分析其对抗成虫分泌代谢抗原单抗发生反应的蛋白条带。结果成功制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原;免疫小鼠可产生较高滴度(1∶16 000)抗体反应;急性血吸虫病患者、慢性血吸虫病患者、晚期血吸虫病患者和钩虫病患者血清抗该抗原的抗体效价分别为1∶800、1∶400、1∶800和1∶100,华支睾吸虫患者和正常人血清均为阴性;SDS-PAGE显示其具有4条蛋白条带,分子量分别是13、40、60和180 ku左右;Westernblot结果表明该抗原能够被抗成虫分泌代谢抗原单抗在5ku左右处识别。结论制备的日本血吸虫成虫分泌代谢抗原具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

Identification of excreted and metabolic antigens from adult worms of Schistosoma japonicum

目的 制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原,对其免疫原性以及免疫反应性进行初步鉴定.方法 日本血吸虫尾蚴感染家兔,42 d后剖杀获取成虫,将虫体置无血清DMEM培养基中,5% CO2孵箱37℃培养4 h,得到成虫分泌代谢抗原;用该抗原免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体反应;用该抗原包板,ELISA法检测血吸虫感染人血清抗体效价;采用十二烷基硫酸钠聚丙酰烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其组分进行分析,然后用Western blot分析其对抗成虫分泌代谢抗原单抗发生反应的蛋白条带.结果 成功制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原;免疫小鼠可产生较高滴度(1:16 000)抗体反应;急性血吸虫病患者、慢性血吸虫病患者、晚期血吸虫病患者和钩虫病患者血清抗该抗原的抗体效价分别为1:800、1:400、1:800和1:100,华支睾吸虫患者和正常人血清均为阴性;SDS-PAGE显示其具有4条蛋白条带,分子量分别是13、40、60和180 ku左右;Western blot结果 表明该抗原能够被抗成虫分泌代谢抗原单抗在5 ku左右处识别.结论 制备的日本血吸虫成虫分泌代谢抗原具有较强的免疫原性和免疫反应性.     

藜草花粉变应原免疫活性分析

目的:分析藜草花粉变应原成分及其变应原性、免疫原性.方法:用Sephacryl S-200HR葡聚糖凝胶层析法分离、纯化藜草花粉变应原,通过十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉法(SDS-PAGE)测定变应原各组分的分子质量;应用免疫印迹法检测各组分蛋白质与藜草花粉过敏性哮喘患者血清中sIgG和sIgE的反应率.结果:藜草花粉经电泳后得到12条蛋白质区带,分子质量依次为92,63.1,61,52,45,43,39.7,38.9,34,31.6,28.4和18.5～12 ku;免疫印迹可见4条sIgE反应带,蛋白分子质量依次为92,34,31.6和18.5～12 ku;与患者血清反应率分别是70%,50%,80%和90%;与血清sIgG结合的反应带有8条,蛋白分子质量为92,61,52,45,43,39.7,31.6和18.5～12 ku;与患者血清反应率分别是80%,40%,10%,20%,80%,10%,10%和100%.结论:藜草花粉变应原主要含12种蛋白质成分,其中分子质量为18.5～12 ku和92 ku的蛋白质变应原活性及免疫原活性均很强,是主要变应原成分;分子质量在34和31.6 ku的蛋白质有较强的变应原性而无或仅有较弱的免疫原性;而分子质量为43,61,45,52和39.7 ku的蛋白质具有一定的免疫原性而无变应原性.     

蠕形螨全蛋白提取及相对分子量鉴定

目的探讨蠕形螨全蛋白提取方法,初步分析蠕形螨蛋白组分。方法采用自制裂解液和RIPA裂解液分别提取蠕形螨全蛋白,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离比较蛋白提取效果,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定部分蛋白质条带,Mascot检索软件查询NCBInr数据库,对蠕形螨蛋白组分进行初步分析。结果自制裂解液提取蠕形螨蛋白的效果优于RIPA裂解液。经数据库检索比对出21种可信蛋白,其中170 kD条带比对出的蛋白为肌动蛋白和胞质肌动蛋白,130 kD条带比对出的蛋白为谷氨酰胺连接酶和腺苷酰转移酶;15 kD以下条带比对出的蛋白大部分为组蛋白。结论自制裂解液液氮研磨法可提取到较高质量的蠕形螨全蛋白,实验提取并分析了蠕形螨的蛋白质组成,为蠕形螨蛋白组学研究奠定基础。     

广州管圆线虫成虫尿素溶解性抗原分析及其诊断价值的探讨

目的分析广州管圆线虫成虫尿素溶解性抗原,探讨其诊断价值。方法广州管圆线虫成虫匀浆后沉渣经尿素溶解,与成虫水溶解性抗原同时进行SDS-PAGE和Western-blot,分析蛋白谱与抗原谱;用ELISA检测不同样本中相应抗体。结果SDS-PAGE结果显示尿素抗原蛋白条带少于水溶解性抗原;尿素抗原与感染大鼠血清、免疫兔血清和广州管圆线虫病患者血清在32000Mr处均出现强反应带,尿素抗原的反应带条数较水溶性抗原少。两种抗原包被ELISA检测广州管圆线虫病疑似病人血清和感染大鼠血清的阳性率相同;尿素抗原用于检测血吸虫感染小鼠血清的交叉阳性率明显低于水溶性抗原,检测正常大鼠血清、献血员血清及其他非广州管圆线虫感染血清时,假阳性数较水溶性抗原少。结论广州管圆线虫成虫尿素抗原含有32000Mr抗原;广州管圆线虫尿素抗原用于诊断时,与水溶性抗原有同样的敏感性,而特异性高于水溶解性抗原。     

猪囊尾蚴抗原制备物可溶性蛋白SDS-PAGE分子量测定及免疫电泳分析

应用SDS-PAGE技术对猪囊尾蚴三种抗原制备物(囊液、囊体及囊液纯化抗原Y_1)的可溶性蛋白进行分析及分子量测定;并以囊尾蚴孵育液抗原为对照,比较了囊液及其纯化抗原的免疫电泳沉淀弧。结果显示,囊液及囊体粗抗原均为多种分子量大小不同的蛋白质组成的抗原混合物,(囊液囊体分别显示17及24条蛋白区带),纯化抗原Y_1的SDS-PAGE图谱出现5条与囊液相同的蛋白区带,分子量范围92,400～38,100,其免疫电泳沉淀弧与囊液粗抗原主弧及孵育液沉淀弧相似,提示囊液及其纯化抗原含有虫体代谢或分泌产物,为纯化抗原在ESALI诊断中特异性的增高提供了依据。     

基因工程血管抑素3A蛋白的分离纯化

在8mol／mL尿素溶液中，以二硫苏糖醇(DTT)为还原剂，对基因工程血管抑素3A包涵体进行溶解实验。结果发现：1．5h后溶解的上清液蛋白浓度达26．2mg／mL。SDS-PAGE电泳扫描结果显示，3A蛋白经过Sephadex G75分离后PAGE电泳纯达到100％，该步收率达85．82％，相对分子质量为10ku。采用分步稀释法对其进行复性，所获复性3A蛋白经MTT法检测表明：3A蛋白浓度为0．1μg／mL时，对内皮细胞的生长抑制率为93．4％。     

红内期间日疟原虫浓集纯化及免疫反应性研究

目的：建立白细胞滤器（Plasmodipur）联合Percoll密度梯度离心浓集纯化红内期间日疟原虫（P.v）的方法。分析和比较皂素与冻融两种处理方法制备的P.v抗原与P.v感染者混合血清免疫反应性的差别。方法：P.v感染者血样,用Plasmodipur滤器分离去除白细胞,经60%Percoll浓集其中的感染红细胞（iRBC）。采用皂素法和冻融法从iRBC中释放疟原虫,经超声粉碎,所获P.v可溶性抗原和同样处理的正常红细胞（nRBC）成分经SDS-PAGE电泳分析其组分差别,并应用P.v感染者、正常对照混合血清与相应的抗原进行免疫印迹分析,确定具有免疫原性的抗原组分。结果：115例P.v感染者血样,用Plasmodipur滤器分离去除白细胞,每10个油镜视野中WBC残留≤5个99例（86.1%）,经60%Percoll浓集的35例样本中,共有30例（85.7%）能提高iRBC比例至60%以上。SDS-PAGE电泳分析,皂素处理与冻融处理的P.v抗原分别显示出6条和2条P.v特异性蛋白条带。免疫印迹分析表明,P.v感染者混合血清能特异性地识别22、24.5、29、35、36 kDa皂素处理的P.v抗原,26、49、59、63、115、120 kDa冻融处理的P.v抗原。结论：血样中疟原虫皂素与冻融两种处理方法制备的P.v抗原与P.v感染者混合血清免疫反应性存在明显差异,其中皂素处理的22 kDa抗原组分具有较强的免疫原性,其作为P.v特异性诊断抗原的价值有待进一步研究。     

兔骨折愈合过程蛋白质变化的初步研究

目的：观察骨痂中蛋白质含量、种类与正常骨质相比的变化,寻找表达差异的蛋白质条带,为后续研究奠定基础。方法：建立兔桡骨骨折模型,以对侧相应部位健康骨组织为对照,分别于骨折后4周、6周、8周、12周提取骨痂及对侧骨组织的蛋白,检测各组蛋白浓度,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳,寻找差异蛋白条带并粗略估计分子量。结果：每一实验组蛋白浓度均较相应对照组增高,实验4周组蛋白浓度比其他实验组高（P〈0．05）,而其他组间相比差异无统计学意义（P〉0．05）。SDS-PAGE电泳图谱分子量为29．0～66．4ku区间范围内实验组蛋白条带比相应对照组多,分子量约为30ku附近有一明显条带在对照组中缺失。结论：骨折愈合过程中,骨痂的蛋白质含量、种类均比正常骨质增加,以骨折早期含量增加最为明显,分子量约为30ku附近的明显差异条带可选择作为后续研究中鉴定的对象。     

使用不同组织裂解液提取人心房组织膜蛋白的研究

目的:寻找一种适用于Western boltting实验的提取人心房组织膜蛋白的组织裂解液的配制方法。方法:配制两种不同的组织裂解液A、B。应用组织裂解液A、B及Bio-Rad公司提取膜蛋白的试剂盒,分别对人右心耳组织进行膜蛋白提取,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行分离,免疫印迹法检测SK2膜蛋白的表达,比较三种裂解方法的裂解效果。结果:三种不同的裂解方法提取的膜蛋白,其中用组织裂解液A和组织裂解液B提取的膜蛋白能满足Western blotting的实验要求,比用试剂盒提取的方法实验效果好。结论:组织裂解液A和组织裂解液B可作为人心房组织提取SK2膜蛋白的组织裂解液。     

单克隆抗体SZ—39识别的人脑胶质瘤细胞SHG—44膜蛋白的提取

目的：提取ＭｃＡｂ ＳＺ－３９识别的人脑胶质瘤细胞ＳＨＧ－４４膜抗原蛋白,为其进一步研究作准备。方法：分别以两组去污剂（１）２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４;（２）１％ＳＤＳ、１％去氧胆酸钠、１％ＮＰ－４０、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ裂解ＳＨＧ－４４细胞,提取细胞蛋白,再以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法分离蛋白,并以Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ法分析鉴定。结果：ＭｃＡｂ ＳＺ－３９识别的蛋白呈一条区带,分子量为６０ｋＤ     

重组人胶原绑定骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的表达、纯化与复性

目的: 利用大肠杆菌表达体系制备带有胶原结合结构域(CBD)的骨形态发生蛋白2(BMP2),研究CBD-BMP2表达、纯化及复性的条件和方法。方法: 将具有胶原结合能力的CBD基因序列克隆入BMP2基因序列的N端,构建重组蛋白表达质粒pet21b/CBD-BMP2,转化入工程性大肠杆菌BL21菌株内;37℃条件下添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)持续诱导表达;采用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化;运用超纯水稀释复性法对纯化后的CBD-BMP2进行复性;0.22 μm微孔滤膜对复性后蛋白除菌,通过除菌前后蛋白浓度比值计算回收率;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达、纯化以及复性;BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。结果: 重组质粒pet21b/CBD-BMP2在工程性大肠杆菌中得到充分表达;CBD-BMP2以包涵体形式表达;SDS-PAGE分析,8 mol·L^-1尿素存在条件下目的蛋白溶解于裂解液上清中,经纯化后目的蛋白单体存在于洗脱液B中,单体相对分子质量约为14000;稀释复性后SDS-PAGE分析,相对分子质量14000及28000处可见2条清晰条带,重组蛋白单链成功复性为二聚体结构,相对分子质量约为28000;过滤除菌前后目的蛋白浓度分别为110和80 mg·L^-1,回收率约为73%。结论: 重组CBD-BMP2载体成功转化至大肠杆菌内,CBD-BMP2蛋白得到了高效的表达和复性。建立了利用原核表达体系制备重组CBD-BMP2蛋白的实验方法。     

重组日本血吸虫26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶的表达、纯化及其免疫特性分析用于急性血吸虫病免疫诊断

目的将日本血吸虫(中国大陆株)26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶(26 ku SjGST)基因克隆入pET28a(+)并诱导表达26 ku rSjGST蛋白,纯化并用于急性血吸虫病免疫诊断.方法构建重组质粒pET28a-SjGST,转化到E.coli BL21,经IPTG诱导表达并进行SDS变性蛋白质电泳,以小鼠抗GST单克隆抗体为一抗,进行Western-blot分析.用His·BandPurification Kit亲和层析纯化重组蛋白,以此重组蛋白作为抗原,用ELISA法检测急性血吸虫患者血清和非流行区正常人血清. 结果成功地构建了重组质粒pET28a-SjGST,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blot分析表明,该重组蛋白能被小鼠抗GST单克隆抗体识别.ELISA结果表明,rSj GST用于急性血吸虫患者血清中抗体检测的阳性率为92.3%.结论 rSj GST得到表达和纯化,该重组蛋白用于急性血吸虫患者血清中抗体的检测具有良好的免疫反应性,为进一步探讨其在血吸虫病诊断中的应用奠定了基础.     

PURIFICATION AND IDENTIFICATION OF THE ANTIGEN ASSOCIATED WITH MONOCLONAL ANTIBODY 3H11 AGAINST GASTRIC CANCER CELL

The object of this study is to investigate the properties of gastric cancer assoiciated antigen by McAb3H11 against gastric cancer cell line. Antigen purified by affinity chromatography and further characterized by biochemical and immunological techiques. Results showed that assoiciated antigen of McAb 3H11 was mainly located on the membrane of target calls. It was sensitive to heat and digestion of proteases,but resistant to treatment with sodium perioclate. Schiff‘s reagent staining was negative. SDS-PAGE and IEF-analysis showed that the antigen was a 210 kD molecular weight with pl of 8.5 protein. The molecular weight of antigen extracted from target cell with tunicamycin was not changed. We concluded that the corresponding antigen of MeAb 3H11 might be an alkaline protein.     

人精子蛋白17抗原肽的合成及其在抗精子抗体检测中的应用研究

目的：合成人精子蛋白17的线性B细胞表位肽（118—127aa）,并以此为抗原建立抗精子抗体（AsAb）检测的ELISA方法。方法：用PS3全自动多肽合成仪合成人精子蛋白17抗原肽,并经反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定。该合成肽作为ELISA法的包被抗原来检测血清中的AsAb（IgG）。结果：合成了实验所需要的抗原性肽段,高效液相色谱法（HPLC）结果显示其纯度为95．5％。以该合成肽为抗原建立的检测AsAb（IgG）的问接ELISA方法,与商品化试剂盒相比符合率为93．3％。结论：所合成的人SP17抗原肽具有较好的抗原活性,可作为间接ELISA法的包被抗原用于抗精子抗体的榆测。