不同剂量中波紫外线照射对角质形成细胞增殖活力和自噬体表达影响的研究

【摘要】 目的 观察HaCaT细胞和原代角质形成细胞接受不同剂量中波紫外线（UVB）照射后细胞增殖活力和自噬体表达水平的变化,并初步评估增殖活力损伤程度和自噬体表达水平之间的相关性。 方法 两种细胞各分为5组,对照组、5、10、20、40 mJ/cm2 UVB照射组,照射结束后12 h进行MTT实验或单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色,全波长酶标仪下读取各孔A值,倒置荧光显微镜下随机选取视野,计数每视野下自噬体表达阴性细胞和阳性细胞数目。 结果 经不同剂量UVB照射后,HaCaT细胞的增殖活力（A值）较原代角质形成细胞下降更明显,其中HaCaT细胞10、20、40 mJ/cm2照射组（A值分别为1.367 ± 0.035、1.173 ± 0.034、0.873 ± 0.025）两两之间以及与对照组（1.519 ± 0.022）之间差异均有统计学意义（P < 0.01）;原代角质形成细胞仅10、20、40 mJ/cm2 UVB照射组（A值分别为0.782 ± 0.012、0.773 ± 0.021、0.725 ± 0.031）与对照组（0.887 ± 0.035）之间差异有统计学意义（P < 0.05）。5、10、20 mJ/cm2 UVB照射后两种细胞MDC染色,自噬体表达阳性的细胞比率均出现增加,但照射量至40 mJ/cm2时则出现下降,以原代角质形成细胞下降更明显,其中HaCaT细胞10 mJ/cm2和20 mJ/cm2 UVB照射组自噬体表达阳性率（分别为22.69% ± 2.15%、28.10% ± 2.92%）较对照组（10.18% ± 1.50%）有显著上升,而40 mJ/cm2组自噬体表达上升幅度出现下降（趋势卡方检验χ2 = 27.48,P < 0.01）;原代角质形成细胞对照组、5、10、20 mJ/cm2组间自噬体阳性率变化不大,但40 mJ/cm2组表达出现明显抑制（趋势卡方检验χ2 = 6.86,P < 0.01）。 结论 UVB对HaCaT细胞和原代角质形成细胞增殖活力的损伤均有剂量依赖性,原代角质形成细胞更耐受UVB损伤;5、10、20 mJ/cm2 UVB照射能促进HaCaT细胞自噬体表达增加,且有剂量依赖性,而对原代角质形成细胞自噬体表达水平未产生显著影响;40 mJ/cm2 UVB照射后HaCaT细胞自噬体表达有下降趋势,而显著抑制原代角质形成细胞自噬体水平的表达。 【关键词】 角质形成细胞; 自噬体; 紫外线     

角质形成细胞中的信号转导

角质形成细胞是使皮肤保持稳态和参与皮肤病理生理过程的主要细胞。其增殖和分化受许多生物因子控制 ,对胞外信号反应的主要机制———蛋白磷酸化理论也在不断发展。就角质形成细胞信号转导的特点作一概述。     

自噬在银屑病角质形成细胞中的水平及病理意义

自噬是真核细胞中普遍存在的现象,自噬水平的异常已被证明与诸多疾病存在关联.研究表明,自噬水平下降与细胞异常增殖、分化及炎症密切相关,而银屑病皮损中存在细胞增殖、分化与免疫调节异常,表明银屑病发病机制与角质形成细胞自噬水平异常可能存在一定的联系.近年来的研究提示,银屑病角质形成细胞中自噬的水平异常可能参与了银屑病病理机制的形成.概述自噬与细胞增殖、分化及炎症的关系、银屑病角质形成细胞的病理状态以及正常角质形成细胞与银屑病角质形成细胞中的自噬的相关研究.     

自噬在皮肤氧化应激和色素代谢中的作用

自噬是真核细胞特有的生命现象,在机体的氧化应激反应中发挥重要的作用。研究证实,自噬可以调节黑素细胞和角质形成细胞的氧化应激反应,在皮肤色素代谢中具有重要的作用。自噬和氧化应激在皮肤色素代谢中的作用表现为:影响黑素小体的合成和成熟,影响角质形成细胞中黑素小体的降解,参与角质形成细胞的分化过程,但在黑素小体转运中的作用尚不清楚。另外,自噬可以调节毛发和表皮的角化,但不影响皮肤的屏障功能。本文综述了自噬在皮肤氧化应激和色素代谢中的作用,可能为临床上难治性色素障碍性皮肤病如白癜风、黄褐斑以及黑素瘤的发病机制和靶向治疗提供方向。     

角质形成细胞生长因子与银屑病的关系

角质形成细胞生长因子是近年来发现的有着重要生物功能的生长因子,它属于成纤维细胞生长因子家族,由成纤维细胞产生。角质形成细胞生长因子可刺激角质形成细胞的增生、分化、移行,促进上皮细胞的再生、增厚,对银屑病的发病机制及其治疗可能有一定的启示。本文就角质形成细胞生长长因子和的生物学功能及其与角质形成细胞及银屑病的关系做一定综述。     

角质形成细胞生长因子与银屑病的关系

角质形成细胞生长因子是近年来发现的有着重要生物学功能的生长因子 ,它属于成纤维细胞生长因子家族 ,由成纤维细胞产生。角质形成细胞生长因子可刺激角质形成细胞的增生、分化、移行 ,促进上皮细胞的再生、增厚 ,对银屑病的发病机制及其治疗可能有一定的启示。本文就角质形成细胞生长因子的生物学功能及其与角质形成细胞及银屑病的关系做一综述。     

喜树碱对人原代角质形成细胞自噬的影响

目的 探讨喜树碱对人原代角质形成细胞（HPK）自噬的影响。方法 取健康男性包皮组织,采用两步消化法分离提取HPK,取第3代细胞用于实验。将HPK分为实验组和对照组,实验组用200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜树碱处理,对照组用0.1%二甲基亚砜（DMSO）处理。处理24、48 h后,采用CCK8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测药物作用24 h后细胞凋亡;免疫印迹法检测微管相关蛋白1轻链3（LC3）、p62变化。选取2 μmol/L喜树碱作用HPK 24 h,间接免疫荧光法检测LC3蛋白变化,透射电镜观察自噬体超微结构,进一步确认喜树碱对自噬的诱导效应。结果 随着喜树碱浓度的增加,对HPK的增殖抑制作用逐渐增强,各组24 h增殖抑制率总体差异有统计学意义（F = 152.9,P < 0.01）,其中2、6 μmol/L组高于对照组,差异有统计学意义（t = 12.09、18.76,均P < 0.01）,200 nmol/L组与对照组差异无统计学意义（t = 2.24,P > 0.05）。48 h时各组增殖抑制率总体差异有统计学意义（F = 123.8,P < 0.01）,实验组均高于对照组（均P < 0.01）。对照组和200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜树碱组24 h细胞凋亡率分别为（2.30 ± 1.68）%、（15.90 ± 2.14）%、（29.33 ± 3.51）%、（35.28 ± 3.05）%,差异有统计学意义（F = 89.57,P < 0.01）,各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（均P < 0.01）。2、6 μmol/L喜树碱处理细胞24 h后,LC3Ⅱ蛋白显著上调,p62蛋白表达下调。间接免疫荧光检测显示,2 μmol/L喜树碱组与对照组自噬体阳性细胞比例分别为（60.16 ± 8.78）%、（38.96 ± 13.12）%,差异有统计学意义（t = 3.003,P < 0.05）。透射电镜观察到2 μmol/L喜树碱作用细胞24 h后细胞内形成自噬体和自噬溶酶体。结论 2、6 μmol/L喜树碱可诱导HPK自噬水平升高,同时抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。     

一氧化氮、角质形成细胞和银屑病

一氧化氮是一种多效性生物气体分子，在皮肤组织的生理和病理过程中均具有重要作用。银屑病皮损区释放的一氧化氮量和诱导型一氧化氮合酶的表达均高于非皮损区和正常皮肤，其在银屑病中的作用机理不清楚。现综述一氧化氮在角质形成细胞凋亡、增生分化和基因表达调控的研究进展及其在银屑病中的可能作用机制。     

姜黄油对角质形成细胞体外增殖分化影响的研究

目的：探讨姜黄油对角质形成细胞体外增殖分化的影响。方法：以人角质形成细胞株COLO-16细胞为模型，噻唑盐比色法(MTT)检测细胞活性和生长情况；免疫组化SABC法检测姜黄油对增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响；电镜观察姜黄油对细胞超微结构的影响。结果：姜黄油抑制角质形成细胞增殖，随药物浓度增加，其抑制增殖能力增加，PCNA表达逐渐减弱，且对角质形成细胞超微结构有直接损伤作用。结论：姜黄油具有抑制体外角质形成细胞增殖分化的作用，有望成为一种治疗增殖性皮肤病的外用药物。     

西罗莫司对UVB照射HaCaT细胞自噬的影响

目的 探讨西罗莫司能否增加中波紫外线(UVB)照射下HaCaT细胞的自噬水平.方法 0、25、50 mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞,单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法检测自噬.设置空白组、DMSO组、25 mJ/cm2UVB组、25 mJ/cm2 UVB+西罗莫司组、50 mJ/cm2UVB组、50 mJ/cm2 UVB+西罗莫司组共6组,MDC染色法检测自噬,并比较各组自噬水平.结果 结果UVB照射HaCaT细胞后出现了自噬,0、25、50 mJ/cm2照射组自噬体阳性细胞分别为1.07％±1.85％、9.37％±1.14％、16.29％±3.03％,3个剂量间差异有统计学意义;6组自噬体阳性细胞百分率分别为:0.56％±0.79％、1.61％±2.27％、10.00％±0.47％、21.18％±3.03％、15.82％±4.13％、29.45％±1.24％,各组两两比较差异均有统计学意义,且25 mJ/cm2UVB+西罗莫司组、50 mJ/cm2 UVB+西罗莫司组的自噬水平均高于相应UVB组.结论 UVB辐照HaCaT细胞后出现MDC染色自噬体阳性细胞,西罗莫司可能增加UVB照射下HaCaT细胞后的自噬水平.     

人角质形成细胞的体外改良培养及生物学特征

目的：探讨体外人角质形成细胞的改良培养方法并观察其生物学特征。方法：取健康人包皮环切术包皮,采用EDTA预处理和冷消化法分离表皮,制成细胞悬液,通过倒置相差显微镜、电镜观察其形态学特征,绘制细胞生长曲线;免疫组化（ABC法）测定抗角蛋白单克隆抗体鉴定细胞。结果：体外培养的人皮肤角质形成细胞经过1～2天的潜伏期,即进入指数增生期,持续约5天,然后进入平台期。第7天左右细胞完全融合连成片状,形态呈扁平不规则多边形,免疫组化显示胞浆被染成棕黄色,为角蛋白阳性。透射电镜下见角质形成细胞胞浆内有大量束状张力纤维呈典型角质形成细胞特征。结论：采用改良体外培养方法获得的人角质形成细胞保持正常的生物学特征,从而建立一种简单易行的人角质形成细胞优化培养技术。     

Growth and differentiation stimuli induce different and distinct increases in intracellular free calcium in human keratinocytes

The effect of growth and differentiation stimuli on intracellular free calcium ([Ca²⁺]_i) in cultured human keratinocytes was investigated using micro-spectrofluori-metric techniques and the calcium-sensitive dye FURA-2. The mean [Ca²⁺]_i of keratinocytes in 70 M calcium medium was 104 ± 3 nM (mean ± SEM), significantly lower than the transformed keratinocyte line SVK₁₄ (128 ± 2 nM). When cultured in 2.0 mM calcium medium the [Ca²⁺]_i increased in both normal and transformed keratinocytes to 135 ± 4 nM and 180 ± 4 nM, respectively. Keratinocytes grew more slowly in the absence of EGF, but [Ca²⁺]_i was unaltered. Stimulation with EGF (10 ng/ml) induced, over 4 min, a large transient rise in [Ca²⁺]_i up to 230 nm, due to an influx of extracellular calcium. Heterogeneity of keratinocytes was observed with 46% (n=13) responding, but confluent or differentiated keratinocytes did not respond. TGF- (1 ng/ml) reduced cell growth without inducing differentiation and was not associated with any change in [Ca²⁺]_i. The phorbol ester TPA (50 nM) induced irreversible growth arrest and terminal differentiation and increased the [Ca²⁺]_i from 102 ± 2 nM to 126 ± 3 nM at 2 h, an effect similar to that of 2 mM extracellular calcium. Addition of 500 nM TPA was associated with a rise in [Ca²⁺]_i, over several minutes to a plateau of 200–300 nM, due to release from internal stores and an influx of extracellular calcium. In normal human keratinocytes an increase in [Ca²⁺]_i appears to be an early event in differentiation, whether induced by calcium or TPA, but not during growth inhibition without differentiation.     

Retinoic acid alters the keratinization of cultured rat sublingual keratinocytes in vitro

Summary A multilayered, continuously proliferating keratinocyte cell culture has been produced from rat sublingual epithelium. The rate of growth of the cultures was stable throughout long-term culture. Retinoic acid (3.3 M) inhibited the keratinization of these cultures. Morphological changes included total loss of tonofilaments within 7 days, decrease in desmosomes, an increase in intercellular spaces, absence of thickened plasma membranes, and elongated and more numerous cytoplasmic projections. Exposure to retinoic acid (3.3 M) for 33 days did not affect the growth rates of the cultures, as estimated from the protein and DNA content per flask. Retinoic acid (3.3 M) reduced the polyacrylamide gel electrophoresis protein profile within 3 days of treatment and produced reductions in the incorporation of amino acids into keratins of molecular weights 62,000 and 60,000 within 24 h. All five keratin polypeptides showed a reduced incorporation rate after treatment for 3 days. This inhibition was reversible. Protein synthesis of nonkeratins was not detectably affected by retinoid treatment.     

In vitro cytotoxicity of antimicrobial agents to human keratinocytes

Backround The degree of bacterial contamination in the wound bed plays a key role in determining the level of “take” of keratinoeyte grafts in burn patients. This study was done to evaluate the best suited antimicrobial agent for topical application in relation to antimicrobial activity and cytotoxic effect on graft cells. Objective The cytotoxicity of 7 antibacterial agents (gentamicin sulphate, ciprofloxacin hydrochioride, bacitracin, polymyxin B sulphate, diethanolamin salt of fusidic acid, teicoplanin, vancomycin hydrochtoride), one anlifungal substance (amphotcricin B sodium deoxycholate) and one antiseptic agent (povidone iodine) on cultured human keratinocytes, HaCaT keratinocytes and fibroblasts was investigated. Material and methods The effects of these agents were tested using two separate assays - the neutral red assay and the Bradford protein assay. In order to assess toxicity of the agent, the obtained midpoint cytotoxicity (MC50) was compared to the respective minimal inhibitory concentration (MIC) for receiving the cytotoxic potential in microbiologically effective doses. Results Antibiotics effective against Staphylococcus aureus with a small potential of toxicity are Bacitracin, Fusidic acid, Vancomycin and Tcicoplanin. Gentamicin and Ciprofloxacin are effective against both Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa with a low potential of toxicity. Conclusion The use of antimicrobial agents with a midpoint cytotoxicity (MC50) higher than the minimal inhibitory concentration (MIC) by at least a factor of 100 might reduce the risk of toxic injury to graft cells.     

角质形成细胞抗原提呈功能的研究进展

角质形成细胞不仅形成机体的物理屏障,同时具有重要的免疫功能.角质形成细胞在一些疾病状态下或者直接受到干扰素γ等细胞因子的刺激后,可以表达抗原提呈相关分子,如主要组织相容性复合体Ⅱ、细胞间黏附分子1等,同时主要组织相容性复合体Ⅰ也会发生改变.有研究表明,活化后的角质形成细胞可以加工并提呈内源性或外源性抗原,进一步活化抗原特异性T淋巴细胞.角质形成细胞的这一功能对阐明相关皮肤病的发病机制及作出针对性的靶向治疗具有重要意义.但同经典的抗原提呈细胞相比,角质形成细胞发挥抗原提呈功能可能还存在着一定的局限性.     

人角质形成细胞在皮肤光老化中的研究进展

光老化是长期紫外线照射导致的慢性炎性损伤,其中长波紫外线和中波紫外线红外线可诱导皮肤损伤引起光老化,但其发病机制尚未完全明确.人角质形成细胞是表皮中重要的细胞,也是紫外线敏感的靶细胞.近年来研究表明,人角质形成细胞在光老化的发生和发展中起重要作用.其中衰老自由基学说最为热门,抗老化的机制和药物、植物等方面的研究也多从此方面入手.