真菌分类学中的分子生物学技术点评

真菌的分类繁乱复杂,主要是由于缺乏可靠的分类学指标。现对有希望的分子生物学技术,DNAG+C mol％测定、核酸杂交技术、基因组DNA限制性片段长度多态性分析、电泳核型分析、线粒体DNA的限制性片段长度多态性分析、核糖分型、随机扩增多态性DNA分析、rRNA序列分析及可溶性蛋白电泳、多位点酶电泳等作为真菌分类学指标的可行性与应用范围作一点评。     

线粒体DNA分析:一种新的真菌分类技术

线粒体DNA分析技术应用于真菌分类学,受到人们普遍重视,该文介绍其基本原理和实验方法,并重点复习近来应用这一技术在真菌分类方面所做的工作。     

皮肤癣菌的分子生物学研究进展

皮肤癣菌是浅部真菌病的致病菌 ,对其分子生物学研究主要集中于基因结构的分析、基因诊断、基因分类等方面。目前 ,已在红色毛癣菌等某些癣菌的线粒体DNA上发现了重要的呼吸链酶 ,如细胞色素氧化酶、NADH脱氢酶的结构基因 ,以及诸多氨基酸的tRNA基因簇 ;建立了用真菌特异性通用引物或癣菌特异性引物聚合酶链反应诊断皮肤癣菌病的方法 ;应用限制性酶切片段多态性研究、随机扩增多态DNA分析、聚合酶链反应等方法进行皮肤癣菌的基因分类 ,分析癣菌的种间差异 ,对一些重要的皮肤癣菌 (如红色毛癣菌、须癣毛癣菌 )还进行了种内的分型研究。     

用拓扑异构酶Ⅱ基因区巢式PCR法鉴别常见皮肤癣菌

皮肤癣菌病在人群中有较高的发病率,其临床表现、治疗效果等根据不同的病原真菌而有所不同,而且往往表现为一定的地域流行趋势^[1,2],因此临床上快速准确地鉴定病原菌种对皮肤癣菌病的治疗和流行病学研究都显得相当重要.目前用于真菌菌种鉴定的分子生物学方法很多,用于分类研究的真菌基因包括编码核糖体的rD NA、某些蛋白质的编码基因、全基因组等^[3,4].我们使用针对拓扑异构酶Ⅱ基因区的多重引物,以巢式PCR法对皮肤癣菌基因进行扩增,以探寻一种方法简便、结果稳定、特异性和敏感性均较高的适合临床鉴别常见皮肤癣菌的分子生物学方法.     

随机扩增多态性DNA在医学真菌鉴定与分子流行病学研究中的应用

随机扩增多态性DNA是新近建立的一种以单个随机寡核苷酸为引物、聚合酶链反应为基础的扩增技术,特别适用于分子生物学研究甚少、未知基因组DNA序列的靶细胞的扩增。文中介绍了随机扩增多态性DNA用于医学真菌分类鉴定的优点和实例、用于真菌病流行病学调查的研究概况,并对该技术在医学真菌领域中的应用前景作了初步介绍。     

新的分子生物学方法用于真菌基因型鉴定

传统的真菌分类依据其形态学特征、生理生化特性等,用于临床或研究时敏感性不高,费时费力,对操作者有较高的专业要求,而且由于真菌菌种种类繁多、分布广泛、形态特征复杂,常引起分类系统不稳定或意见分歧。分子生物学技术的兴起为真菌鉴别开辟了新的途径。近几年来,建立在分子生物学传统的方法如DNA系列分析、聚合酶链反应、核酸杂交、基因指纹等基础上,产生了多种在基因水平上对医学真菌进行分类鉴定的新技术,进一步提高了灵敏性和特异性,并且方法简单、快速。     

聚合酶链反应技术检测申克孢子丝菌的实验研究

目的研究申克孢子丝菌的种特异性引物聚合酶链反应鉴定方法,从而为临床孢子丝菌病的分子诊断奠定基础。方法采用根据申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列设计合成的一对寡核苷酸引物,分别对26株申克孢子丝菌(包括1株标准株,7株实验室保存株,18株临床分离株)及6种6株普通真菌(分属于3个菌属)的基因组DNA进行PCR扩增。结果扩增产物选择性的从26株申克孢子丝菌基因组DNA中获得,而对念珠菌属、毛癣菌属、小孢子菌属的6株普通真菌基因组DNA均为阴性。结论采用以申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌特异、简便、快捷,可用于临床诊断。     

有汗性外胚叶发育不良一家系致病基因突变筛查

目的:寻找有汗性外胚叶发育不良家系GJB6、GJB2和CTSC突变基因.方法:抽提外周血DNA,PCR扩增GJB6、GJB2和CTSC基因编码区的所有外显子,扩增产物纯化后直接双向测序,并与基因组序列进行比对分析,查找有无突变.结果:候选基因编码区所有外显子均未发现突变.结论:GJB6、GJB2和CTSC基因编码区序列与本研究中有汗性外胚叶发育不良家系发病无关,致病基因待进一步研究.     

SPRR2E基因编码区单核苷酸多态性与银屑病

目的通过测定32个中国汉族人寻常性银屑病家系共157人SPRR2E基因的外显子编码区序列,研究SPRR2E基因与银屑病发病的关系。方法提取基因组DNA,对32个银屑病家系DNA进行扩增,产物经377DNA测序电泳仪电泳,用自动测序的方法测定SPRR2E基因的外显子编码区序列,并以ETDT及GENEHUNTER软件进行统计处理。结果SPRR2E基因编码区第156核苷酸( 156bp)处存在A或G二态性,可表现为AA纯合、GG纯合和AG杂合三种基因型,虽然该SNP不改变蛋白质编码,但它与银屑病存在传递不平衡,等位基因A优先传递给患病子代(P<0.05)。结论SPRR2E基因的外显子编码区中的一个核苷酸多态性与中国汉族人寻常性银屑病的发病相关联。     

真菌分类学中的分子生物学技术点评

真菌的分类繁乱复杂，主要是由于缺乏可靠的分类学指标，现对有希望的分子生物学技术，ＤＮＡ Ｇ＋Ｃ ｍｏｌ％测定、核酸杂交技术，基因组ＤＮＡ限制性片段长度多态性分析，电泳核型分析，线粒体ＤＮＡ的限制性片段长度多态性分析，核糖分型，承机扩增多态性ＤＮＡ分析、ｒＲＮＡ序列分析及可溶性蛋白电泳、多位点酶电泳等作为真菌分类学指标的可行性与应用范围作一点评。     

甲真菌病400例致病真菌分析

目的:确定上海地区甲真菌病的致病菌种。方法:对本院皮肤科门诊就诊的直接镜检阳性的400例甲真菌病患者的甲标本做真菌分离培养和分析。结果:分离出致病真菌233株,其中皮肤癣菌120株(红色毛癣菌104株,须癣毛癣菌10株,犬小孢子菌3株,絮状表皮癣菌3株),酵母菌68株,非皮肤癣菌11株(曲霉6株,青霉5株),其余为丝状真菌。结论:上海地区甲真菌病的致病真菌以皮肤癣菌为主,酵母菌中非白念珠菌占有一定比例。     

南通和南京马拉色菌毛囊炎临床调查及致病菌种分析

目的 探讨南通和南京马拉色菌毛囊炎的易感因素及致病菌种在不同地区、不同部位马拉色菌毛囊炎中的菌种分布情况。方法 对符合病例收集纳入标准的患者进行问卷调查,取毛囊内容物进行真菌涂片、培养;并根据形态学和生理生化特征进行菌种鉴定。结果 241例临床诊断为马拉色菌毛囊炎的患者,真菌涂片204例阳性,涂片阳性率84.65%;收集标本259份,共得阳性株213株,其中马拉色菌209株,念珠菌4株（占1.54%）,真菌培养阳性率82.24%。菌种鉴定：209株马拉色菌活化菌种后,可供鉴定的马拉色菌菌株186株,共检测到6个菌种的马拉色菌,其中糠秕马拉色菌111株（59.68%）、斯洛菲马拉色菌43株（23.12%）、合轴马拉色菌17株（9.14%）、球形马拉色菌9株（4.84%）、厚皮马拉色菌4株（2.15%）、钝形马拉色菌2株（1.08%）。不同个体、不同部位的菌种分布：胸部、后背、腹部和面颈部以糠秕马拉色菌为主,上肢、肩部和头顶以斯洛菲马拉色菌为主,下肢均为球形马拉色菌。同一个体、不同发病部位存在不同的菌种,主要为糠秕马拉色菌合并合轴或斯洛菲马拉色菌。 结论 南通和南京马拉色菌毛囊炎存在6种马拉色菌致病菌种,糠秕和斯洛菲马拉色菌是主要的致病菌种。     

Fungal melanonychia

Fungal melanonychia is a relatively rare nail disorder caused by nail infection that produces brown-to-black pigmentation of the nail unit. The number of organisms implicated as etiologic agents of fungal melanonychia is increasing, and the list currently tops 21 species of dematiaceous fungi and at least 8 species of nondematiaceous fungi. These superficial infections may clinically mimic subungual melanoma and are often not responsive to traditional antifungal therapy. This article reviews the literature on fungal melanonychia and the role of fungal melanin in infection.     

皮肤真菌感染中的免疫应答

由于各种众所周知的原因,导致免疫功能低下的患者不断增多,真菌感染率逐年攀升,而大多数关于真菌病的免疫学研究多局限于深部真菌感染。针对不同的皮肤真菌感染,对侵犯皮肤的真菌抗原性和机体对病原体的免疫应答加以介绍,并解释了脂溢性皮炎和特应性皮炎与真菌感染的关系。     

儿童头癣致病真菌调查及分子流行病学研究

目的调查分析儿童头癣患者生活环境中致病真菌存在情况,探索其流行病学规律,为儿童头癣的防治提供依据。方法收集儿童头癣患者临床资料,并进行病发真菌镜检和培养,收集每例儿童头癣患者生活环境中密切接触物品及亲属头发进行真菌培养,培养结果与相应患者真菌培养结果对比分析。鉴定为相同菌株者采用真菌通用引物ITS1和ITS4对rDNA的ITS区进行扩增,并采用（GACA）4单引物进行分子鉴定,用随机引物扩增DNA多态性（RAPD）方法对相同菌株者进行株间差异性分析。结果调查91例儿童头癣患者,年龄从1岁至12岁,病程1周至3月;患者病发的真菌培养结果：犬小孢子菌44株（48．35％）,铁锈色小孢子菌41株（45．05％）,须癣毛癣菌4株（4．40％）,红色毛癣菌1株（1．10％）,石膏样小孢子菌1株（1．10％）;患者亲属头发及枕巾等接触物品真菌培养结果均未分离到致病真菌：2例儿童的伙伴病发中分离到与对应惠儿相同的致病菌;有宠物接触者28例（30．77％）中有7例（7．69％）分离到与头癣患者病发相同的致病菌种。RAPD分析发现从患者分别与其对应环境中分离的犬小孢子菌的基因组DNA随机引物扩增后产生的产物片断长度多态性一致,显示无株间差异性。结论儿童头癣患者生活环境中有致病真菌存在．致病真菌主要来源于宠物及密切接触伙伴。     

常见侵袭性真菌疫苗的研究现状

临床上存在抗肿瘤药物及抗生素滥用现象,使得条件致病性真菌感染疾病发病率升高,研究针对条件致病性真菌敏感的制剂-抗真菌药物及疫苗就显得十分重要。而临床应用抗真菌药物治疗的疗效不佳。出现较多耐药菌株,同时药物本身的毒副反应使患者无法耐受。因此,抗真菌治疗依然面临着严峻挑战。这无疑给研发真菌疫苗进行早期预防开辟了一条新的挑战途径。本文对真菌菌体疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、树突状细胞与真菌疫苗以及含有失活基因的真菌疫苗进行综述。     

南京地区305例甲真菌病临床及致病菌分析

目的了解南京地区甲真菌病的临床分类、致病菌种分布等情况。方法对305例镜检阳性的甲真菌病患者进行真菌培养、菌种鉴定及临床分析。结果共培养出致病菌株165株,培养阳性率为54.1%。皮肤癣菌占91%,其中红色毛癣菌占95%,其次是须癣毛癣菌占5%;酵母菌占4.2%,白念珠菌占57%;非皮肤癣菌霉菌占4.8%,以枝顶孢霉为主(占75%),混合感染1例。临床类型以远端侧位甲下型最为常见(占48.2%),其次分别为浅表白色型(24.9%)和全甲破坏型(23.3%)。结论南京地区甲真菌病致病菌以皮肤癣菌为主,其次是非皮肤癣菌霉菌和酵母菌,红色毛癣菌为甲真菌病的优势致病菌。临床类型以远端侧位甲下型居多,其他依次为浅表白色型、全甲破坏型、近端甲下型。就诊人群以20~50岁居多,女性多于男性。     

多点平皿培养法和常规试管培养法分离206例甲真菌病病原菌比较

目的比较多点平皿培养法和常规试管培养法在甲真菌病病原菌分离中的差异。方法同时采用多点平皿培养法和常规试管培养法对206例甲真菌病患者的253份靶甲标本进行病原菌分离及鉴定。结果多点平皿培养法和常规试管培养法甲真菌病病原菌的阳性率分别为72.73%和52.96%(P0.05),污染率分别为8.70%和4.74%(P0.01)。多点平皿培养法和常规试管培养法致病菌分离鉴定结果显示,皮肤癣菌分别为92.00%和93.15%、酵母菌分别为6.50%和6.85%、霉菌分别为1.50%和0%。多点平皿培养法和常规试管培养法分别检出混合感染16例和12例。结论多点平皿培养法分离甲真菌病病原菌优于常规试管培养法,该方法可提高甲真菌病病原菌的检出率。     

1229例甲真菌病致病菌分离培养结果分析

目的了解近5年来我科就诊患者甲真菌病病原菌的构成分布情况。方法对2006年5月-2010年12月来我科门诊就诊的有典型,临床表现且真菌镜检阳性的患者进行了致病菌的分离培养。结果1229例中,591例培养阳性,阳性率48．09％。其中皮肤癣茵311株（52．62％）,以红色毛癣菌为主,占50．08％,须癣毛癣菌与紫色毛癣菌合计占2．54％;酵母茵188株（31-81％）,克柔念珠茵为主,占16．92％,其次为光滑念珠菌5．58％,热带念珠菌和白念珠菌分别为3．89％和2．37％;霉菌92株（15．57％）,以曲霉为主,占10．15％,其次为青霉,占5．08％。结论在我科就诊患者的甲真菌病病原茵中,主要致病菌以皮肤癣茵为主,其次为酵母菌。本研究结果与该地区1980-1994年期间甲真菌病病原菌的构成存在差异,皮肤癣菌的比例有所下降,酵母菌和霉茵所占比例上升。     

Detection and differentiation of causative fungi of onychomycosis using PCR amplification and restriction enzyme analysis

Background Onychomycosis, a fungal nail infection, has become one of the most important dermatophytoses. Unfortunately, a predictably successful diagnostic approach to onychomycosis does not yet exist. Objective The purpose of this study was to develop a deoxyribonucleic acid (DNA)-based diagnostic method to improve the sensitivity and specificity of the detection and differentiation of the pathogenic fungi of onychomycosis. Methods We attempted to detect fungi in the nail using polymerase chain reaction (PCR) primer systems that were designed in conserved sequences of the small ribosomal subunit 18S-rRNA genes shared by most fungi, and differentiated between species by restriction enzyme analysis of the amplified product. Results Fragments of the gene coding for 18S-rRNA were amplified successfully from medically important fungi species, but not from normal nails. Restriction fragment length polymorphism patterns using HaeIII endonuclease were sufficiently different to allow the recognition of individual species. Conclusions The PCR–restriction enzyme analysis method appears to be a more sensitive detection and identification technique for onychomycosis than conventional methods, and has considerable diagnostic value.