ED-L2-LMP1-EGFP融合基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建及鉴定EB病毒LMP1基因和增强型绿色荧光蛋白基因融合慢病毒表达载体。方法应用DNA重组技术，将EB病毒ED-12启动子和LMP1基因克隆到带有EGFP基因的FUGW慢病毒表达载体上，筛选阳性克隆，经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组载体后，以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMVΔ8．9、包膜基因VSVG和带目的基因ED-12-LMP1-EGFP载体共同转染到293FF包装细胞内包装病毒，荧光显微镜下观察包装细胞报告基因表达情况，收集病毒上清、浓缩鉴定、测定重组病毒的滴度。PCR和免疫组化鉴定LMP1表达。结果融合慢病毒表达载体质粒限制性酶切分析证实有782bp的ED-12和1300bp的LMP1基因片段基因片段插入到慢病毒载体中。转染重组ED-12-LMP1-EGFP慢病毒融合载体的细胞于荧光显微镜下呈绿色荧光；对该细胞PCR可以扩增出404bp大小的LMP1基因片段和370bp的EGFP基因片断；免疫组化证明LMP1蛋白在转染细胞表达阳性。结论成功构建了ED-12-LMP1-EGFP基因的慢病毒表达载体，为进一步在体研究LMP1基因的功能奠定了基础。     

人NESG1基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

目的克隆人NESG1基因,构建与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体pGC-FU-NESG1-EGFP,包装慢病毒,感染293FT细胞并进行鉴定。方法以NESG1全长克隆为模板扩增其编码框序列,通过限制性内切酶AgeI酶切、T4 DNA连接酶连接,将NESG1插入慢病毒载体pGC-FU-EGFP,构建pGC-FU-NESG1-EGFP重组载体。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系293FT,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293FT细胞,荧光显微镜下观察感染效率,Western blot方法检测NESG1-EGFP融合蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体pGC-FU-NESG1-EGFP,三质粒共转染293FT细胞后可见大量绿色荧光;浓缩病毒后测定其滴度为2×107 TU/ml;以复感染系数MOI为1感染293FT细胞,感染效率在90%以上。Western blot证实细胞表达NESG1。结论成功构建NESG1慢病毒表达载体,包装得到高滴度慢病毒,为后续感染鼻咽癌细胞,探索其在鼻咽癌发生和发展中的作用奠定了基础。     

ED-L2-LMPl-EGFP融合基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鏊定EB病毒LMPl基因和增强型绿色荧光蛋白基因融合慢病毒表达载体.方法 应用DNA重组技术,将EB病毒ED-L2启动子和LMP1基因克隆到带有EGFP基因的FUGW慢病毒表达载体上,筛选阳性克隆,经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组载体后,以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV△8.9、包膜基因VSVG和带目的 基因ED-L2-LMP1-EGFP载体共同转染到293FT包装细胞内包装病毒,荧光显微镜下观察包装细胞报告基因表达情况,收集病毒上清、浓缩鉴定、测定重组病毒的滴度.PCR和免疫组化鉴定LMP1表达.结果 融合慢病毒表达载体质粒限制性酶切分析证实有782 bp的ED-L2和1 300 bp的LMP1基因片段基因片段插入到慢病毒栽体中.转染重组ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒融合载体的细胞于荧光显微镜下呈绿色荧光;对该细胞PCR可以扩增出404 bp大小的LMP1基因片段和370 bp的EGFP基因片断;免疫组化证明LMP1蛋白在转染细胞表达阳性.结论 成功构建了ED-L2-LMP1-EGFP基因的慢病毒表达载体,为进一步在体研究LMP1基因的功能奠定了基础.     

NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的 构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3(HCCLM3),观察其转染效率及表达情况.方法 采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(IRES)-EGFP中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLemi6.3-NK4-IRES-EGFP共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度.以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞,筛选最适MOI,以最适MOI重组慢病毒感染HCCLM3细胞,观察转染效率.Western blot法测定细胞中NK4蛋白表达水平.结果 成功构建共表达NK4基因和EGFP基因的慢病毒载体pLenti6.3 -NK4 -IRES-EGFP,并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108 TU/mL.重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI为7.转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达,而未转染细胞中无NK4蛋白的表达.结论 成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体,有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白.     

DLC-1基因重组慢病毒表达载体的构建及其在结直肠癌SW480细胞中的表达

目的：构建携带肝癌缺失基因-1（deleted in liver cancer-1,DLC-1）的重组慢病毒表达载体并实现DLC-1基因在结直肠癌（colorectal cancer,CRC）SW480细胞中的过表达。方法：将DLC-1基因的靶序列与载体质粒pcDNA3.1（+）-GFP连接成重组质粒。重组质粒经双酶切法及基因测序验证构建正确后包装成慢病毒颗粒并计算病毒滴度。重组慢病毒感染SW480细胞,同时设置阴性对照组和空白对照组流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测感染率;real-time PCR及Western blot检测SW480细胞中DLC-1基因表达水平。结果：重组质粒构建正确。重组慢病毒滴度为1×109 TU/ml;对SW480细胞的感染率为90%;DLC-1 mRNA在重组慢病毒组细胞中过表达;重组慢病毒组DLC-1 蛋白的表达水平显著高于阴性对照组（P=0.000）;阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.902）。结论：成功构建了高滴度的DLC-1基因重组慢病毒,其携带的DLC-1基因能够在CRC SW480细胞中过表达,为后续研究DLC-1基因的表达在CRC的发生、发展中的作用奠定了实验基础。     

SUMF2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因过表达慢病毒载体,以便进一步研究SUMF2功能。方法 针对人SUMF2 DNA序列设计带酶切位点的引物,PCR法获得目的基因片段;用AgeⅠ和NheⅠ酶双酶切SUMF2基因片段及PLJM1-EGFP载体。用T4连接酶对两种酶切产物进行连接、PCR鉴定、测序。将阳性克隆质粒与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293T细胞,并荧光显微镜观察EGFP的表达。结果 PCR和测序证实成功构建了SUMF2的慢病毒表达载体,病毒效价为1×10⁸ TU/ml。结论 成功构建SUMF2-PLJM1-EGFP慢病毒载体,并在293T细胞中得到表达。     

ASIC3-shRNA干扰慢病毒质粒的构建及其效率的鉴定

目的: 构建酸敏感离子通道3(acid sensing ion channels 3, ASIC3)干扰慢病毒质粒并进行效率鉴定。方法: 利用GenBank获取ASIC3基因序列并合成相应干扰序列,通过T4 DNA连接酶将ASIC3基因片段连接至环状Plko.1 Puro载体,将重组质粒转染293T细胞获取慢病毒,用实时荧光定量PCR(qRT PCR)检测病毒滴度;将包装之后的慢病毒感染PC12、BV2、N2a细胞,分别分为ASIC3 shRNA组和EGFP shRNA组(阴性对照),经慢病毒感染后用qRT PCR和免疫印迹技术分别检测ASIC3 mRNA和蛋白表达。结果： 合成的ASIC3干扰序列成功连接至Plko.1 Puro载体;qRT PCR及DNA测序鉴定结果证实,ASIC3 shRNA质粒构建成功;qRT PCR与免疫印迹结果表明,在PC12、BV2、N2a细胞中,与EGFP shRNA组相比,ASIC3 shRNA组ASIC3 mRNA和蛋白表达量均明显下调(P＜0.05)。病毒滴度约为1×109 IU/mL。 结论： ASIC3 shRNA干扰慢病毒质粒构建成功。     

人Runx3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Runx3基因重组慢病毒载体。方法 PCR扩增Runx3基因,应用In-Fusion技术将Runx3基因PCR扩增产物交换进入线性化慢病毒载体pGC-FU以构建重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。对长出的阳性克隆进行PCR鉴定,并进行测序和比对分析。将构建成功的重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3与包装质粒pHelper 1.0、包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞进行病毒包装。荧光显微镜下观察重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3转染293T细胞后细胞内绿色荧光表达情况。Western blot检测Runx3与EGFP融合蛋白表达情况。实时定量PCR测定病毒滴度。结果重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3经测序和比对分析证实目的基因序列正确。三质粒共转染293T细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光。Western blot证实Runx3与EGFP融合蛋白在293T细胞内稳定表达。浓缩病毒后测定滴度为2.0×108TU/ml。结论成功构建携带人Runx3基因的重组慢病毒载体pGC-FU-Runx3,为进一步研究Runx3过表达对慢性乙型肝炎患者外周血Th细胞分化的影响奠定基础。     

CEA慢病毒载体的制备及其在树突状细胞中的表达鉴定

目的 构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定表达CEA的树突状细胞(DC).方法 以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.将pLentiGFP-CEA、包装质粒p△8.2和pVSV-G用LipofectamineTM2000共同转染293T细胞,包装成感染性病毒颗粒,感染树突状细胞,并进行RT-PCR和Western blot检验CEA在细胞中的表达.结果 DC细胞病毒感染48h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达,PCR扩增可得到人CEA的2009 bp基因片段,与预期大小一致,Western blot显示CEA在感染DC中表达.结论 成功构建了CEA慢病毒表达载体,重组慢病毒感染DC细胞后表达出有活性的CEA蛋白,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

人甘油激酶慢病毒干涉载体的构建和表达

目的构建人甘油激酶(GK)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,获得稳定下调GK表达的慢病毒。方法将具有干涉效果的siRNA序列克隆入慢病毒核心质粒pSicoR中,并转染293T细胞进行病毒包装,用慢病毒感染293T细胞并应用FACS测定病毒滴度。以GK干涉慢病毒感染人肝细胞系L02细胞后,应用Western blotting方法检测GK的表达。结果成功构建GK干涉慢病毒pSicoR-GK载体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达3×107pfu/ml,GK蛋白质表达水平下调至对照的约20%。结论成功构建人GK基因RNAi慢病毒,为后续GK生物学功能研究奠定基础。     

VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的构建VEGF基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组（MHCC97-200）、阴性对照组（MHCC97-NEGA）和空白对照组（MHCC97-空白）中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

RNAi抑制胰腺癌细胞survivin表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的构建RNAi表达载体,并分析其对胰腺癌细胞PANC-1 survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达,并把survivin基因克隆到T载体进行测序,构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1,RT-PCR、western-blot分析干扰载体对survivin表达的抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达,其基因序列与GenBank中公布的一致,干扰载体pTZU6＋1-svv2可以有效的抑制survivin的表达,抑制率约为74％,并诱导了肿瘤细胞的凋亡。结论用RNAi表达载体可以有效抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达并诱导胰腺癌细胞凋亡。     

小鼠FasL全长cDNA的克隆、真核表达载体构建及其在树突状细胞中的表达

目的 克隆小鼠FasL(mouse FasL,mFasL)全长cDNA,构建其真核表达载体,并验证其在小鼠骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells,DC)中的表达.方法 采用RT-PCR和TA克隆技术,从激活的小鼠脾脏T淋巴细胞中扩增mFasL全长cDNA,亚克隆到T载体中,再克隆到pIRES2EGFP载体中.转染小鼠DC后,用RT-PCR、免疫荧光及Western blot检测mFasL mRNA和蛋白表达.结果 测序证实所得的mFasL cDNA序列与其在GenBank中的序列完全一致.mFasL真核表达载体转染小鼠DC后,能表达mFasL mRNA和蛋白.结论 成功克隆了mFasL基因,构建其真核表达载体,并证明能有效表达于DC中.     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?     

ATM基因siRNA真核表达载体的构建及其对转染宫颈癌细胞株ATM表达的抑制作用

目的:研究特异性siRNA对宫颈癌ATM基因的阻抑效果以及用RNAi效应对宫颈癌做基因治疗的可行性. 方法:构建可表达人ATM基因siRNA的重组真核表达质粒pSuppressorNeo-ATM,电穿孔法转染Siha宫颈癌细胞株. 应用RT-PCR,Western blot,流式细胞术、免疫荧光法等方法检测转染的宫颈癌细胞中ATM基因的表达水平. 结果:RT-PCR, Western-blot均表明瞬时转染pSuppressorNeo-ATM的宫颈癌细胞中ATM 基因的表达受到明显抑制,流式细胞术、免疫荧光法检测表明ATM蛋白含量明显下降. 结论:pSuppressorNeo-ATM质粒构建成功,瞬时转染宫颈癌细胞后可以明显抑制ATM基因的表达.     

短发夹RNA靶向抑制EGFR基因对人卵巢癌Skov-3细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对卵巢癌细胞表皮生长因子受体(EFR)基因表达的影响及其效应.方法 体外合成EFR的DNA模板序列和pSilencer 2.1-U6neo质粒构建编码shRNA的表达载体,应用脂质体Lipofectamine 2000将其转染到人卵巢癌Sov-3细胞,采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学技术检测转染前后Sov-3细胞EFR基因的变化;采用AnnexinV/PI双染色标记的流式细胞仪检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞.结果 成功构建pSilencer-EFR短发卡状siRNA真核表达载体;靶向EFR的序列特异性的siRNA可以有效抑制Sov-3细胞EFR基因的表达;流式细胞分析显示,Sov-3细胞凋亡率明显增加,细胞周期出现明显的0/1期阻滞.结论 RNAi沉默EFR表达可以诱导卵巢癌Sov-3细胞凋亡,并使卵巢癌Sov-3细胞停滞在0/1期,RNAi可作为研究卵巢癌发生发展机制和基因治疗的有效工具.     

SOCS3基因3’端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性鉴定

目的:研究细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,SOCS3)基因3’端非翻译区(3’-un-translated region,3’-UTR)微小RNA(microRNA,miRNA)的调控作用,构建重组SOCS3基因3’-UTR荧光素酶报告载体,并通过荧光素酶活性测定,初步分析可能调控SOCS3基因表达的miRNAs。方法:采用PCR方法从原代培养的小鼠星形胶质细胞基因组DNA中扩增SOCS3基因3’-UTR序列,插入荧光素酶报告载体pGL3-Promoter,获得重组载体pGL3-Promoter/SOCS3;通过Target Scan5.2、RNAhybrid和FINDTAR3软件预测可能与SOCS3基因3’-UTR结合的miR-NAs;将pGL3-Promoter/SOCS3重组质粒和miRNAs共转染HEK 293T细胞,测定SOCS3 3’-UTR荧光素酶的活性。结果:酶切及核酸测序证实,成功构建了SOCS3基因3’-UTR序列的荧光素酶报告重组子;miRNA靶位点预测显示,SOCS3基因可能是miR-203、miR-291a-5p、miR-9、miR-140和miR-130b的作用靶标;与对照组相比,miR-203、miR-291a-5p、miR-140能使SOCS3 3’-UTR荧光素酶的活性显著降低。结论:成功构建了SOCS3基因3’-UTR荧光素酶报告载体,且miR-203、miR-291a-5p、miR-140可显著降低其荧光素酶的活性。     

慢病毒介导shRNA沉默巢蛋白表达对人黑色素瘤细胞转移特性的影响

目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默黑色素瘤细胞株UACC903巢蛋白(nestin)的表达,研究其对黑色素瘤细胞转移能力的影响。方法以人nestin mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒基因PLL3.7作为质粒载体,构建靶向人nestin的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,分别感染UACC903细胞并流式分选获得高纯度的nestin干扰或对照组细胞。应用RT-PCR、免疫荧光及Western blotting检测不同组别nestin表达的变化。分别用Transwell侵袭试验检测跨膜细胞的数量评估各组黑色素瘤细胞的侵袭能力,划痕法检测迁移能力改变。光镜观察各组细胞形态变化,免疫荧光检测E-cadherin、N-cadherin和β-catenin在不同组别的表达变化。结果成功构建nestin shRNA慢病毒载体nestin-RNAi-LV。RT-PCR及免疫荧光结果显示干扰组UACC903细胞nestin mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低。nestin下调的UACC903细胞黏附、侵袭及迁移能力下降(P<0.05)。结论慢病毒介导的shRNA能有效地静默食管癌细胞nestin基因的表达,能抑制黑色素瘤细胞UACC903迁移。     

iASPP特异性RNAi表达载体的构建及其干扰效果鉴定

目的构建iASPP基因的RNA i真核表达载体PGCsilencerTMH1/Neo/GFP/RNA i,并观察其转染白血病细胞株Jurkat前后iASPP的表达变化以及其对细胞凋亡的影响。方法根据GenBank中iASPP的序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至PGCsilencerTMH1/Neo/GFP质粒中,测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至Jurkat细胞中,用RT-PCR方法检测iASPP的表达,用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果经测序,模板序列与设计序列完全正确,RT-PCR检测Jurkat细胞中iASPP表达在转染干扰质粒后有明显的下降,转染后Jurkat细胞凋亡由11.81%增加到33.15%。结论成功构建了iASPP基因的RNA i真核表达载体,且其对白血病细胞有一定的干扰效果,为下一步探讨iASPP对肿瘤细胞中p53的抑癌作用机制奠定了基础。