SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒基因方法的建立

目的建立SYBR Green I荧光PCR快速检测登革热病毒的方法。方法以通用引物对标准株提取物和血清样本进行RT—PCR扩增，同时以SYBR Green I标记进行实时PCR扩增，分析其灵敏性特异性和重复性。结果标准毒株的扩增结果与预期结果相同，测序结果显示实验结果序列与标准株序列一致。实验的灵敏性特异性和重复都较高。结论SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒的方法是一个快速、准确检测登革热的方法，但它更适用于早期传染病监测。     

比较多重荧光PCR方法与血清凝集方法对沙门菌分型鉴定的效果

目的 通过应用多重荧光PCR试剂盒对沙门菌进行分型,比较与传统血清凝集分型情况的差异,探讨多重荧光PCR试剂盒在沙门菌分型中的有效性。方法 选取2018-2021年门头沟区感染性腹泻病例中检出的82株沙门菌进行传统血清鉴定分型及多重荧光PCR分型,采用SPSS 20.0软件对数据资料统计分析。结果 82株沙门菌中用血清凝集方法可以区分81株,分为14个血清型;多重荧光PCR试剂盒成功鉴定74株,分为11个血清型,鉴定表中包含其中的78株沙门菌,符合率为94.87%。肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌等常见型别沙门菌检出率100%。结论 沙门菌血清型分子鉴定用多重荧光PCR试剂盒具有快速、简单、高效的特点,对常见型别沙门菌鉴定符合率高,但罕见血清型的鉴定还是要依靠传统方法进行判定,在实际工作中两者可互为补充以精准、快速确定感染来源。     

多重PCR法检测结核分枝杆菌耐药基因研究

目的:建立多重PCR法快速检测结核分枝杆菌耐药基因。方法:采用多重聚合酶链反应(PCR)同时扩增46株结核分枝杆菌临床分离株、48株北京标准菌株、40例耐药及40例非耐药的结核分枝杆菌临床分离菌株的inhA、katG、rpoB、IS1081等基因并采用测序的方法进行验证。结果:所有耐药样本基因(包括利福平、异烟肼耐药基因)及野生型菌株均被成功扩增。结论:应用多重PCR技术可同时快速检测结核分枝杆菌耐药基因。     

实时荧光PCR方法对乙肝病毒基因分型的检测及临床意义

[目的]了解乙肝患者的HBV基因分型特点及不同乙型肝炎病毒基因型对肝脏的损害程度,了解不同乙肝基因型的临床用药效果。[方法]随机选取乙型肝炎患者血清100例,已确诊的慢性乙肝血清50例,肝硬化患者的血清20例和追踪治疗的乙肝患者血清15例。用实时荧光PCR（RT-PCR）方法对其进行基因分型的检测。[结果]在100例乙肝患者中,B型20例,占20%;C型71例,占71%;BC混合型1例,占1%;非B非C型8例,占8%。肝硬化患者中,以C型为主。[结论]乙肝基因型主要以C型为主,B基因型与C基因型的临床治疗效果比其他基因型差,且C基因型感染的患者肝硬化发生率高。     

多重荧光定量PCR快速检测6种常见下呼吸道感染病原菌

目的:探讨多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)检测6种常见呼吸道病原菌的检测方法。方法:采用BeaconDesigner7.9设计引物和探针建立MRT-PCR法,通过构建质粒标准品分析该方法的最低检出限。对176例临床标本中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌进行回顾性检测,并用一代基因测序验证。结果:MRT-PCR法检测病原菌的最低检出限达103 copies/mL,大肠埃希菌19例,金黄色葡萄球菌30例,铜绿假单胞菌37例,肺炎克雷伯菌53例,阴沟肠杆菌15例,鲍曼不动杆菌22例,与传统鉴定方法报告病原菌一致,特异性达100%。通过一代基因测序结果完全符合。结论:使用多荧光通道PCR仪,采用多重PCR技术检测痰液标本中6种常见病原菌的基因检测方法,敏感性和特异性高,提高了检测效率。     

实验犬布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定

目的建立实验犬及相关生物制品布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定方法。方法选择布氏杆菌Omp2基因同源性较高的区域设计引物对布氏杆菌进行多重PCR扩增,扩增结果一致的样本进行酶切以区分不同型,同时进行序列测定,以确定该方法的准确性;然后验证该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增得到目的条带,并通过酶切区分五种布氏杆菌;PCR产物与布氏杆菌DNA序列同源性达到99%,并验证了该方法的检测结果。实验结果证明该方法特异性较好,灵敏性为1.8×10-7μg/mL。结论成功建立布氏杆菌多重PCR检测与分型鉴定方法,所建立的方法特异性好,灵敏度高。本研究对保证实验犬群的质量,保护饲养人员、实验人员的身体健康具有重要意义。     

RT—PCR检测HCV—RNA及基因分型的研究

目的研究HCV基因分型的临床意义。方法应用RT－PCR方法检测HCV－RNA。结果150例献血员中抗-HCV6例阳性占40％，应用RT－PCR方法检测HCV－RNA10例阳性占6．6％，对其进行基因分型，其中HCV－Ⅱ型占89％，HCV-Ⅲ型占11％。结论说明我国人群HCV感染以Ⅱ型为主。12例抗-HCV阳性母亲及新生儿的HCV基因分型同属Ⅱ型，证明HCV母婴垂直传播存在。基因分型诊断为选择药物治疗提供科学依据。     

荧光多重PCR对α地中海贫血的基因诊断

目的：建立一种快速、灵敏的α地中海贫血诊断方法。方法：应用荧光引物对正常人和患者进行多重PCR，同时扩增α1和α2珠蛋白基因和内对照β肌动蛋白(α—actin)，用Perkin E1mer ABI PBISM^TM 377 DNA Sequencer自动分析结果，并对所得救据进行统计。用连锁分析的方法PCR扩增同一批模板α2珠蛋白基因上游的(CA)n，跑变性胶并将结果与前一种方法对照。结果：荧光多重PCR自动分析和扩增(CA)n连锁分析得出的结论与实际情况完全相符，结果判断容易。结论：荧光多重PCR法灵敏、简便，单管内就能完成，适合运用于α地中海贫血的快速诊断，并有可能运用于移植前诊断和母体外周血分离胎儿有核红细胞产前诊断。     

锁核酸探针多重荧光定量PCR检测HBV基因变异

[摘要] 目的 描述并评价锁核酸（locked nucleic acid,LNA）探针实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR）检测乙型肝炎病毒（HBV）204位基因突变的方法及特点。方法 分别用直接测序法、锁核酸（LNA）探针实时荧光定量PCR检测109例接受拉米夫定（LAM）治疗6个月以上的慢性乙型肝炎患者的血清样本。结果 LNA探针实时荧光定量PCR能检测HBV野生型YMDD和其突变型YVDD,YIDD。而且,这种方法还可以检测HBV野生型和变异型的混合。LNA探针相比普通探针在检测野生型和突变型混合样本方面,更敏感,区分度更好。结论 LNA探针实时荧光定量PCR检测YMDD变异具有快速,灵敏,等特点,可以用于大量临床样本的快速筛查,在监测拉米夫定治疗疗效及发现新耐药突变型等方面具有广泛的应用前景。     

多重荧光定量PCR测定登革热I~IV型方法的建立与初步评价

目的 探讨多重荧光定量PCR 测定登革热Ⅰ～Ⅳ型方法的建立与初步评价。方法 针对登革热Ⅰ～Ⅳ型使用自建的引物探针对反应条件及温度进行调整,且对阳性样本进行不同浓度的稀释,检测自建多重荧光定量PCR 在登革热Ⅰ～Ⅳ型测定中的重复性、灵敏性及特异性。结果 6 份登革热阳性样本通过自建的检测方法来进行检测,全部能够显示明显的S 曲线扩增,且与原有确证方法相比,不同型别的结果一致。其他10 份病毒阳性样本及阴性样本全部没有显示扩增曲线,提示自建的检测方法特异性良好。分别检测登革热Ⅰ～Ⅳ型,变异系数（CV%）值水平范围：0.51～5.51,提示重复性较好。使用自建的多重荧光定量PCR 对登革热不同型别进行检测的平均用时与ELISA 法相比无显著差异（t=1.561,P＞0.05）。通过自建的多重荧光定量PCR 测定通过仪器来完成核酸的自动提取,在仪器当中加样、上机之后不需要另外的操作,充分降低了发生污染的风险。结论 本次研究设计建立的登革热Ⅰ～Ⅳ型多重荧光定量PCR 检测方法,在重复性、灵敏性及特异性方面均较为理想;且相比ELISA 法在加样后无需另外手动操作,更加简易方便。     

204例登革热患者病原学特征分析

目的 分析204例登革病毒感染者的病毒血清型别分布及抗体产生特征,为研究登革热流行动态特征及临床诊治策略提供实验依据.方法 采集登革热患者急性期血清,应用实时荧光PCR检测登革病毒核酸及分型,ELISA法检测登革病毒特异性抗体IgG和IgM.结果 共检测204例标本,其中179例登革病毒核酸阳性,DENV-1型、DENV-2型及DENV-3型分别占97.2％ (174/179)、1.1％(2/174)及0.6％(1/174);DENV-1合并DENV-2型感染和DENV-1合并DENV-3型感染各1例.ELISA法结果显示IgM、IgG抗体阳性者分别为193例和47例,且IgG抗体阳性者的IgM抗体同为阳性,表明初次感染和二次感染分别为146例(75.6％,146/193)和47例(24.4％,47/193).结论 广州存在多种血清型流行及二次感染患者,提示今后广东省重症登革热的发生几率可能会有所增加,应引起重视.     

登革病毒Taqman双重荧光PCR分型研究

目的建立鉴定登革病毒型别的双重实时Taqman PCR反应体系,以准确快速鉴定登革病毒型别。方法根据GenBank上已发表的登革病毒四个型别的全基因序列,进行对比分析,分别设计登革病毒的四个型别引物和探针,登革I、III型探针用FAM-TAMARA标记,登革II、IV型探针用JOE-TAMARA标记。经过条件优化后,建立检测登革病毒I/II型和III/IV型的两套双重实时荧光RT-PCR方法,扩增四型登革病毒RNA、登革病毒阴性样本和登革病毒RNA稀释样本,检测方法的特异性、重复性和检测限性。结果通过设计筛选序列和优化反应条件,建立登革病毒I、II型和登革病毒III、IV型的双重荧光PCR反应体系,通过试验证明,所建立的方法具有良好的特异性、重复性和检测限性,能准确快速地对登革病毒进行分型。结论建立了一种快速双重荧光PCR方法能同时对登革病毒进行分型和鉴定。     

荧光定量PCR法分析乙肝病毒基因型及载量

目的:了解重庆地区乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)基因型的分布情况并进行精确定量分析。方法:采用荧光分型定量聚合酶链反应法(Real-time genotyping and quantitative PCR,GQ-PCR)对收集的血清标本进行HBV基因分型并定量。结果:152株血清标本成功分型148株(97.37%),其中B基因型109例(男88例、女21例)[定量值范围4~12 log10copies/ml、均值和标准差(7.94±1.44)log10copies/ml]、C基因型10例(男6例、女4例)[定量值范围5~10 log10copies/ml、均值和标准差(8.12±1.64)log10copies/ml]、基因B+C混合型29例(男24例、女5例)[定量值范围4~10 log10copies/ml、均值和标准差(7.45±1.59)log10copies/ml]。检出率分别为73.65%(男74.58%、女70.00%)、6.76%(男5.08%、女13.30%)、19.59%(男20.34%、女16.70%)。结论:重庆地区HBV优势基因型以B型和B+C混合型为主,...     

3种HBV DNA荧光定量PCR试剂检测结果比较

目的 比较及评价3种HBV-DNA荧光定量PCR试剂检测结果的差异.方法 同时用3种HBV-DNA荧光定量PCR试剂对已知结果的质控血清、标准品及本院79份HBsAg阳性的临床标本进行检测,并对检测结果进行比较分析.结果 试剂A、B、C检测阳性率分别为41.77%(33例)、45.57%(36例)和41.77%(33例).3种方法结果一致者66例,总符合率83.54%.试剂A、B与试剂C检测结果相比差异有统计学意义(P<0.05),试剂A与B检测结果相比差异无统计学意义(P>0.05).试剂A与C的灵敏度、特异性均为77.78%、88.37%;试剂B灵敏度为89.66%、特异性80.00%.结论 试剂A与B总体性能优于试剂C,适于临床检测与筛查.实验室必须选择质量好且符合自己实验室要求、与本实验室仪器相匹配的试剂以保证检验质量.     

实时定量PCR检测BK病毒时尿样本的优化处理

目的建立简便有效的样本处理方法,提高实时荧光定量PCR法检测尿液中BK病毒载量的敏感性和准确性。方法任意选择24例BK病毒阳性样本,每一样本进行4种不同的处理:原尿、原尿病毒DNA提纯、1:10稀释尿液、1:100稀释尿液,实时荧光定量PCR法检测各组样本BK病毒载量,所测数据用SPSS11.0进行统计学分析。结果4种不同的处理方法对实时荧光定量PCR法检测尿液中BK病毒载量有明显的影响:原尿阴性3例,病毒载量在4组中的最低值占66.7%;1:100稀释尿阴性2例,病毒载量在4组中的最高值占79.2%,但中位值和1:10稀释组差异无统计学意义;DNA纯化组与1:10稀释尿液病毒检出率相当,均为100%,但DNA纯化组目标基因的流失量较明显。结论在临床尿液中BK病毒载量检测时,1:10稀释尿在实时荧光定量PCR检测BK病毒时DNA损失小,效率高,且处理过程简便、成本低,是一种较好的尿样本处理方法。     

热带假丝酵母菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用初步评价

目的建立、优化快速检测临床标本中热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法 ,并对其临床应用进行初步评价。方法用自行设计的高效引物、探针检测5种临床标本中的热带假丝酵母菌,对该方法的敏感性、特异性进行评价,并与真菌培养法进行比较。结果检测临床标本中热带假丝酵母菌的灵敏度可达10 copies/ml,与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。与真菌培养法的检测一致性好(Kappa值为0.916,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR检测热带假丝酵母菌灵敏度高、特异性强,可直接用于各种临床标本中热带假丝酵母菌的检测,而且可大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据。     

实时荧光PCR和RT—PCR方法检测登革病毒的比较研究

目的通过2种检测登革病毒方法的比较，以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法利用Taqman MGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT—PCR及荧光PCR扩增。结果RT—PCR检测10份临床血清标本，2份阳性，阳性率为20％。实时荧光PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应，检测10份临床血清标本，5份阳性，阳性率为50％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。     

Real-time PCR与常规PCR在Q热立克体检测中的比较

目的比较与评价Real-time PCR与常规PCR,寻求适合于Q热患者早期诊断的方法。方法应用Taq Man探针定量PCR、SYBR Green染料定量PCR、巢式PCR和普通PCR四种方法分别对T-A克隆的Q热立克次体基因htp AB片断进行灵敏性、特异性和重复性检测及评价。结果 Taq Man PCR方法的灵敏度分别为SYBR Green PCR、巢式PCR和普通PCR的10倍、10倍和100倍。重复性测试Taq Man法Ct变异系数CV:0.2%~3.0%,SYBR Green法的CV:0.3%~6.0%。Taq Man和SYBR Green PCR均耗时约1h,巢式PCR耗时约2.5h,普通PCR耗时约1.5h。四种方法检测25种相关病原菌结果均为阴性。结论 Taq Man探针定量PCR方法具有很好的特异性、灵敏性、重复性和可操作性,可用于Q热患者临床早期诊断。     

多重实时荧光定量PCR检测急性肝炎患者HBV和HCV方法的建立与意义分析

目的建立一种新的可以快速筛查急性肝炎患者HBV和HCV感染的多重实时荧光定量PCR方法。方法收集596例急性肝炎患者血清或血浆样本,应用自主构建的多重实时荧光定量PCR方法同时检测HBV和HCV,同时应用HBV和HCV单管检测试剂进行检测分析。结果新建立的多重实时荧光定量PCR体系,可以有效地检测HBV和HCV的阳性质控品及阳性样本。多重实时荧光定量PCR体系特异性较好,检测HBV和HCV时,两者之间无交叉反应,且以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性;多重实时荧光定量PCR体系检测HBV、HCV的灵敏度分别为20 IU/ml、50 IU/ml;多重实时荧光定量PCR体系精密度好,检测HBV、HCV的CV值分别为0.11%、0.096%。在检测临床样本时,多重复合体系检测血清或血浆中HBV和HCV的检出率与单独检测HBV和HCV具有很好的一致性,且HBV和HCV的一致率分别达到97.7%(k=0.952)、98.8%(k=0.976);同时有6例样本出现HBV和HCV共感染。结论新型多重实时荧光定量PCR方法对快速检测及筛查HBV和HCV较快捷,而且特异性好、灵敏度高、精密度好。因此多重实时荧光定量PCR方法对2种肝炎病毒的检测具有重要意义。