SP-B中间产物特异性抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定表面活性物质蛋白B(surfactant protein B,SP-B)加工处理过程中部分中间产物的特异性抗体。方法利用Lasergene 7.0和Macvector 11.0.4软件进行抗原表位分析,确定作为抗原的3条多肽序列,将人工合成的多肽与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,免疫兔制备抗血清,间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫前血清背景和免疫后血清效价,抗原亲和纯化抗血清,超滤浓缩抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹(Western blot)鉴定抗体特异性。结果免疫前兔血清背景均低,免疫后抗血清效价均达到要求,抗原亲和纯化后所得抗体纯度及效价高,特异性好。结论成功制备了3种SP-B中间产物特异性多克隆抗体,为深入研究SP-B的加工处理奠定了基础。     

大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价

目的:制备高效价、高纯度、特异性好、荧光强度高及稳定的抗大肠杆菌O157∶H7 异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体,初步探讨其在大肠杆菌荧光免疫检测试验中的应用。方法：复苏培养E.coli O157∶H7标准菌株,甲醛灭活制备疫苗免疫家兔。4次免疫后,颈动脉采血分离血清,经辛酸-饱和硫酸铵法粗提后应用蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行 gG纯化,借助SDS-PAGE电泳、BCA试剂盒法、间接ELISA法分别对蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价进行测定。应用不同FITC与蛋白量比值以及不同标记反应条件对多克隆抗体进行标记。比较荧光抗体F485/535,结合差异性显著分析对FITC与蛋白量比值及反应条件进行合
理选择,应用标记抗体与E.coli O157∶H7和金黄色葡萄球菌混合菌液反应验证标记效果。结果：HiTrap Protein G进行E.coli O157∶H7多克隆抗体纯化的最佳纯化方法为35%、100%二梯度洗脱,制备抗体效价为1∶25　600,与沙门氏菌、阴沟肠杆菌等8种肠杆菌无交叉反应,最佳FITC与蛋白量比值为1∶10,最佳标记反应条件为20℃、2 h。由最佳条件制得的荧光抗体与E.coliO157∶H7反应明显 ,强荧光连续照射15 min后仍显示高亮度荧光反应,且不与金黄色葡
萄球菌反应。结论：本实验首次制备出纯度高、荧光强度高、持续时间长的E.coli O157：H7 FITC标记多克隆抗体,为E.coli O157：H7荧光免疫检测方法的建立完成了关键步骤。
     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

电压门控型钾通道蛋白Kv1.5抗血清的制备及特性鉴定

目的 制备电压门控型钾通道蛋白Kv 1.5的多克隆抗体,对其特性进行鉴定.方法 利用生物信息学方法分析Kv 1.5蛋白的序列,根据亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构等指标选择一段8个氨基酸序列,据此合成Kv 1.5多肽片段,并将其与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联作为免疫抗原,免疫新西兰白兔制备抗Kv 1.5抗血清.辛酸-硫酸铵法纯化抗血清,对纯化后的抗血清进行 ELISA、Western blot鉴定.结果 成功获得抗Kv 1.5合成肽的抗血清,该抗血清效价为1∶ 64 000,可与Kv 1.5合成肽及天然Kv 1.5蛋白出现特异性反应,该抗血清识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为59 kD.同时,Western blot结果显示,所制备的抗血清能识别大鼠心脏天然Kv 1.5蛋白.结论 合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗血清,并且制备的抗血清经 ELISA、Western blot鉴定后特异性较好.     

远缘链球菌细胞分裂蛋白的表达、纯化和抗体的制备

目的表达与纯化远缘链球菌克隆细胞分裂蛋白(ftsK),制备多克隆抗体并鉴定。方法利用IPTG诱导ftsK在大肠杆菌中表达,随后以再生Ni-NTA柱纯化蛋白。纯化后的蛋白多次注射于新西兰大白兔中,获取多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价,Westernblot法检测抗体特异性。结果获得了纯度较高的远缘链球菌ftsK蛋白及其抗体,多抗效价达到1∶10000,特异性较好。结论成功表达了远缘链球菌ftsK蛋白,获得了效价较高、特异性较强的多克隆抗体,为进一步研究ftsK蛋白功能获取了良好的工具。     

兔抗人TGF-β_1多克隆抗体的制备

目的以人重组TGF-β1蛋白作为抗原,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀,免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果成功获得兔抗人TGF-β1多克隆抗体,纯化后抗体效价达1∶110 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体具有良好的特异性,能满足进一步实验的需要。     

特异性RBBP10多克隆抗体的制备

目的：制备RBBP10多克隆抗体。方法：用纯化的RBBP10蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体，间接ELISA法检测抗体效价，Western印迹检测抗体特异性。结果：抗血清效价可达1：1000以上。结论：经Western印迹检测证明抗体效价高，特异性强．此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达。具有一定的应用价值。     

妇产科概论 免疫学

061067nm23-M2cDNA克隆、表达及抗体制备/李茂萍…∥生殖与避孕.—2006,26(2).—67～71,120为通过基因工程技术表达和纯化重组nm23-M2蛋白,进而制备高效价、高特异性的抗血清。构建在大肠杆菌中高效表达pQE30/nm23-M2表达质粒,Ni+-NTA亲和层析纯化;用纯化蛋白免疫兔,制备抗血清并纯化,琼脂双向扩散法测效价,免疫组织化学比较它与抗NM23-H2抗体的特异性。结果:nm23-M2cDNA序列完全正确,表达的17KD可溶性融合蛋白占菌体总蛋白45%,纯化后纯度97%以上,抗血清效价为1∶64～128,提纯后纯度在90%以上,特异性高于NM23-H2抗体。结论:成功构…     

gp120蛋白多肽抗体的设计、制备与鉴定

目的:设计多肽免疫原,制备针对中国流行株B’亚型人类免疫缺陷病毒一型(HIV-1)gp120蛋白的抗血清和相应单克隆抗体。方法:通过蛋白抗原设计,设计出免疫原多肽,将多肽欧联载体蛋白免疫小鼠,制备小鼠多克隆抗血清和单克隆抗体;用ELISA实验、蛋白免疫印迹鉴定其活性和表位。结果:成功制备了能结合gp120蛋白的小鼠多克隆抗血清,并且获得4株分泌特异性抗免疫原的IgG1亚型的单克隆细胞株。结论:蛋白抗原设计是成功的,该多肽能诱导结合蛋白的抗体,有可能成为针对艾滋病病毒中国流行株的多肽疫苗。     

人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体β基因(PILRβ)的克隆、表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体蛋白PILRβ,制备并鉴定其多克隆抗体.方法:应用RT-PCR从人的外周血细胞总RNA中反转录并扩增出PILRβ基因,将其克隆到表达载体pET-32a,在大肠杆菌中IPTG诱导表达,经Ni2 -NTA亲和层析柱纯化,纯化后的蛋白多次注射免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价,Western印迹检测抗体特异性.结果:获得了较高纯度的PILRβ蛋白(Mr约为42 000)及其抗体,多抗效价达到1:10 000,且特异性较好.结论:成功克隆了PILRβ基因并表达纯化了其蛋白,获得了效价较高、特异性较强的多克隆抗体,为进一步研究PILRβ蛋白的功能和潜在的药物开发打下了基础.     

UROC28基因的原核表达及抗UROC28多抗制备和初步应用

目的: 在原核细胞大肠杆菌中融合表达UROC28基因产物,分离、纯化后制备其特异性多克隆抗体,并初步应用于肿瘤标本的检测,为进一步研究该分子的功能和组织分布等提供条件. 方法: 利用DNA重组技术将UROC28基因克隆入融合表达载体pRSET-c质粒,并在大肠杆菌BL-21中融合表达目的蛋白,回收后制备兔抗血清,Western blot鉴定抗体后,应用该抗体对前列腺癌石蜡切片进行免疫组化染色. 结果: His-UROC28融合蛋白的Mr约为22 000,与预期相符;融合蛋白占菌体总蛋白的20%. 目的蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,Western blot结果显示制备的抗UROC28多克隆抗体具有较高的特异性,无明显交叉反应,并成功在前列腺癌组织标本中检测UROC28的表达. 结论: 本研究成功构建了UROC28融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达. 制备了该分子的多克隆抗体,经初步验证其效价高、特异性好,为深入研究UROC28的功能及其与疾病的关系创造了条件.     

人肝脏微粒体蛋白凝胶免疫多克隆抗体的制备

目的制备人肝微粒体蛋白多克隆抗体,为进一步研究微粒体蛋白的功能及制备单克隆抗体打下基础.方法用含人肝微粒体高丰度蛋白的蛋白凝胶免疫家兔,再用ELISA和Western blot方法检测血清效价和抗体特异性.结果 2只家兔均产生了高效价的抗血清,Western blot结果显示,抗血清可以与相应蛋白结合.结论用含人肝微粒体高丰度蛋白的蛋白凝胶免疫的2只家兔均获得了高效价的抗血清,为深入研究该蛋白的定性、定量及定位奠定了基础,并为将来进行单克隆抗体的制备做前期技术支持.     

抗炭疽PA15单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立

目的:制备抗炭疽保护性抗原15(protective antigen,PA15)单克隆抗体,初步建立双抗体夹心ELISA检测炭疽感染者血清中的保护性抗原?方法:以纯化的PA63蛋白为免疫原免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体纯度,间接ELISA?Western blot?免疫沉淀(IP)和蛋白质谱分析单抗特异性,并建立双抗体夹心ELISA检测方法?结果:制备了2株抗PA15单克隆抗体,命名为3D7和8E9?SDS-PAGE电泳可见抗体的重链和轻链,间接ELISA?Western blot发现单抗3D7和8E9可与PA15?PA63特异性结合,IP和蛋白质谱分析发现单抗3D7可与PA83特异性结合,双抗体夹心ELISA方法检测炭疽感染血清中保护性抗原的最低检出浓度为16 ng/ml?结论:成功制备了抗PA15单克隆抗体,并建立了双抗体夹心ELISA方法检测炭疽感染血清中的保护性抗原?     

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌影生物学活性的初步研究

目的制备肠出血性大肠埃希菌O157∶H7细菌菌影,在细胞及动物水平对其生物学活性进行初步评价。方法将包含噬菌体phiX174裂解基因E的重组质粒pLSE转化肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 EDL933及大肠埃希菌DH5α,42℃诱导制备菌影。利用间接免疫荧光实验观察菌影主要抗原结构,并利用电镜观察菌影对Hep-2细胞的黏附。将菌影免疫小鼠后,采用间接ELISA法检测小鼠特异性抗体,并通过小鼠攻毒实验考察菌影的保护效果。结果成功构建了重组质粒pLSE,制备出O157∶H7及DH5α菌影。O157∶H7菌影保留了病原菌的主要外膜抗原,能紧密黏附细胞Hep-2但并不侵入细胞。O157∶H7菌影免疫雄性BALB/c小鼠诱导特异性IgG抗体的产生。攻击试验结果显示小鼠对致死剂量O157∶H7 EDL933强毒株的保护率达到80%。结论 O157∶H7菌影的成功制备及生物学活性的初步析为研制O157∶H7菌影疫苗奠定了基础。     

人乳头瘤病毒18型E2蛋白抗体制备及鉴定

[摘要] 目的 研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)18型E2蛋白的生物学活性,制备人乳头瘤病毒18型E2 蛋白特异性抗体。方法 使用原核表达载体pET28a (+)中表达,镍螯合亲和层析胶体纯化的全长HPV18E2蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）,Western Blot法和免疫组织化学法检测抗体特异性。结果 ELISA法检测显示：抗E2抗血清稀释滴度可达1:10000以上,并能通过Western Blot法和免疫组织化学法检测到真核细胞表达的HPV18E2蛋白,提示具有较高抗体滴度和较强特异性。结论 以原核表达系统表达并纯化的全长HPV18E2蛋白免疫日本大耳白兔,制备得到多克隆抗体能够检测真核细胞表达的E2蛋白,为进一步研究HPV18E2提供了有用的工具。     

E1A激活基因阻遏子在不同表型血管平滑肌细胞中的表达

目的 探讨血管平滑肌细胞表型转换、分化过程中E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)的表达变化及其相关机制。方法 将PCR扩增的CREG片段插入pGEX-4T-1原核表达载体,纯化的CREG融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体。以人胸廓内动脉平滑肌细胞(human internal thoracic artery smooth muscle cells,HITASY)为模型,[^3H]标记脱氧胸苷掺入法测定去血清培养HITASY细胞DNA合成变化。以Western印迹观察HITASY细胞在去血清培养过程中SM α-肌动蛋白、肌钙结合蛋白(calponin)的表达,RT-PCR和Western印迹分析去血清培养诱导CREG mRNA和蛋白表达变化;免疫组化法观察CREG在细胞内的表达及定位。结果 构建载体并成功得到抗CREG多克隆抗体。去血清培养可使HITASY细胞DNA合成明显降低。随去血清培养时间延长,除SM α-肌动蛋白和肌钙结合蛋白表达逐渐上调之外,CREG mRNA转录活性和蛋白翻译合成亦上调。免疫组化显示去血清培养后,CREG蛋白在细胞内表达并主要位于细胞核周。结论 去血清能促使HITASY细胞由合成表型向收缩表型转换,同时伴CREG mRNA和蛋白表达上调。     

登革2型病毒粘附人血小板的体外研究初探

目的:了解登革2型病毒(DEN-2)是否能在体外粘附人血小板并制备抗人血小板抗体.方法:密度梯度离心法分离血小板,DEN-2与血小板体外共孵育2 h,间接免疫荧光法分析DEN-2粘附人血小板情况.采用TritonX-100裂解法制备血小板蛋白并经皮下注射免疫BALB/C小鼠获取抗血小板血清,经Western blot、...     

河南省肠出血性大肠杆菌(EHEC O157:H7)感染之流行与基因特征研究

目的 :了解河南省肠出血性大肠杆菌 (enterohemorrhagicescherichiacoli,EHEC)的流行状况与流行菌株的志贺毒素基因型。方法 :采集河南省 14个监测点上腹泻病人、家畜家禽粪便和肉食品等标本分离E HEC菌株。应用分子生物学技术检测EHEC菌株的rfbO157、rfbO111、hlyA、eaeA、stx2 和stx1等毒力基因和志贺毒素基因亚型 ,应用细胞培养技术检测菌株Vero细胞毒性。结果 :从腹泻病人、家畜家禽、肉食品、苍蝇、蜣螂中均分离出EHECO15 7:H7菌株 ,波尔山羊的带菌率最高达到 2 9.8%。 13 8株携带志贺毒素基因的菌株中 ,EHECO15 7:H7计 95株 ,占产毒菌株的 68.8% ;EHEC非O15 7菌株 43株 ,占 3 1.2 %。菌株可分为 5种毒素基因型 ,EHECO15 7:H 7仅含stx2 基因 ,以stx2 vha亚型为主 ,不含有stx1基因。EHEC非O15 7血清型毒素基因型较复杂。携带stx1和 /或stx2 的菌株均具有Vero细胞毒性。结论 :河南省腹泻病人和家畜家禽中存在EHEC感染。EHECO15 7:H7血清型是优势菌型 ,羊是主要宿主动物。目前河南省EHECO15 7:H7菌株毒素基因型为stx2 并以stx2 vha亚型为主。