呼吸道合胞病毒F蛋白基因片段原核表达和初步应用

目的:建立呼吸道合胞病毒快速、敏感、特异、廉价的早期血清学检测方法.方法:从北京儿童医院患者鼻咽分泌物分离的呼吸道合胞病毒中,用RT-PCR的方法扩增出RSVF蛋白的F1区部分基因片段F1-1(AA137～363),此区域包含F蛋白的主要中和抗原位点.将该基因片段克隆到pMD18-T载体,将连接质粒经PCR鉴定,证实插入目的片段.酶切后将该片段与pET-32a表达质粒连接,用限制性内切酶酶切及序列测定,证实插入片段的正确性.利用pET-32a表达质粒在大肠杆菌BL21表达正确的RSVF1-1蛋白.重组蛋白N端包含有6个连续的组氨酸标签,通过镍离子金属鏊合亲和层析纯化,获得了高纯度的目的重组蛋白RSVF1-1,然后将重组RSVF1-1包被建立间接ELISA法检测人血清中的RSVF蛋白IgG抗体.结果:RT-PCR产物的片段大小为678bp.经酶切和测序鉴定后,插入序列无误.Western Blot分析显示:重组蛋白具有较好的抗原性.用该蛋白建立的间接ELISA方法检测结果与进口Euroimmun和维润试剂盒检测结果比较,差异无显著性.结论:F蛋白基因片段的成功表达为进一步开发诊断试剂盒提供了实验依据.     

呼吸道合胞病毒SH蛋白免疫原性初步研究

目的研究SH蛋白表达质粒pJW4303/SH/His在小鼠体内的免疫原性,为呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗研制提供基础。方法纯化质粒pJW4303/SH/His体外转染293T细胞,Western blot法检测蛋白表达;同时免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测体内抗SH蛋白抗体;通过体外法研究小鼠免疫血清对RSV感染的影响。结果所构建质粒pJW4303/SH/His在体外能够正常表达,免疫机体后刺激血清产生相应抗体,该免疫血清对RSV的体外感染有一定抑制作用。结论核酸质粒pJW4303/SH/His通过免疫小鼠,表现出较强的免疫原性,所产生的针对SH蛋白的抗体能够影响RSV对293T细胞的感染。     

呼吸道合胞病毒非结构蛋白NS1调节Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的表达

目的:研究呼吸道合胞病毒(RSV)非结构蛋白NS1转染人上皮细胞后对Ⅰ/Ⅱ型细胞因子表达的调节效应。方法:在遗传信息不变的条件下,构建稳定的RSV-NS1表达质粒(富含GC),采用Western blotting技术检测质粒NS1在转染A549细胞不同时间段其蛋白的表达,并用ELISA法检测培养上清中干扰素(IFN)-β和白细胞介素(IL)-10的浓度。结果:NS1转染A549细胞1、2、4、8、24 h后,Western blotting法鉴定显示质粒NS1转染细胞1 h后即可检测到其蛋白表达。IFN-β在NS1转染细胞8 h后浓度逐渐降低(P<0.05),这一下降趋势持续至24 h仍有意义;IL-10在NS1转染细胞4 h后浓度开始上调,8 h增加到基础值7.8倍,并在8~24 h内持续上调(P<0.05)。结论:RSV NS1转染早期即在上皮细胞表达并差异性调节Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的表达。     

呼吸道合胞病毒蛋白G基因l核苷酸分析

目的:对河南省呼吸道合胞病毒(RSV)进行分离与鉴定.方法:选择2006年冬季至2007年春季河南省部分医院急性呼吸道感染患者,采集咽拭子,利用Hep-2细胞和Vero细胞进行病毒分离,对分离株用特异性RTPCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行蛋白G全基因序列测定,并进行同源性分析,构建基因进化树.结果:共分离到4株RSV毒株,各分离株之间核苷酸同源性92%～99%;与A型RSV标准参考株的核苷酸同源性为86%～92%,与B型RSV标准株的同源性为70%.结论:2006年河南省RSV流行株为A型.     

重组呼吸道合胞病毒G蛋白基因工程菌的发酵条件研究

目的研究呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）G蛋白基因工程菌的发酵工艺。方法通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件和表达条件，以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件，对发酵丁艺进行改良优化。结果确定了RSVG蛋白基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合：在LB＋葡萄糖的培养基中，搅拌速度为200r／min，培养温度为37℃，pH值为7．0，诱导时温度为25℃，IPTG浓度为0．01mmol／L，优化后T程菌菌体的产量可以达到39．20g／L，目的蛋白表达率平均为18．1％。结论建立了稳定高效的重组RSVGT程菌发酵工艺。     

人呼吸道合胞病毒非结构蛋白研究进展

病毒的非结构蛋白是一类由病毒基因组编码、存在于病毒培养液上清但不存在于病毒颗粒中的蛋白。有的病毒的非结构蛋白可直接参与病毒基因组的复制和表达调控,也有的可通过与宿主细胞组分相互作用,间接协助病毒复制和感染。人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,hRSV）是世界各地儿童严重呼吸道感染中最重要的病原,且能重复感染患者。hRSV是单股负链病毒目副黏液病毒科肺病毒属的成员之一,包括A和B两个抗原亚型。其基因变异快,目前A亚型含有11个基因型,B亚型含有22个基因型[1]。     

呼吸道合胞病毒地方株SH蛋白基因序列分析

目的：分析我国呼吸道合胸病毒（RSV)地方株SH蛋白基因的遗传特点、变异特征。方法：从本室保存的不同年份、不同地区、不同流行特征的呼吸道合胞病毒地方株中抽取7株,分别用RT－PCR扩增其SH蛋白基因并克隆到PTZ18R载体中进行了序列测定和分析。结果：我国RSV地方株间SH蛋白基因相比较变异的部位及形式很相似,地方株间核苷酸全序列的同源性为97．0％－100％。结论：RSV在我国不同地区的不同流行特征与SH蛋白基因的变异无明显关系。     

呼吸道合胞病毒地方株SH蛋白基因序列分析

目的 :分析我国呼吸道合胞病毒 (RSV)地方株SH蛋白基因的遗传特点、变异特征。方法 :从本室保存的不同年份、不同地区、不同流行特征的呼吸道合胞病毒地方株中抽取 7株 ,分别用RT PCR扩增其SH蛋白基因并克隆到PTZ18R载体中进行了序列测定和分析。结果 :我国RSV地方株间SH蛋白基因相比较变异的部位及形式很相似 ,地方株间核苷酸全序列的同源性为 97.0 %～ 10 0 %。结论 :RSV在我国不同地区的不同流行特征与SH蛋白基因的变异无明显关系     

特异性脱氧核酶对小鼠呼吸道合胞病毒感染的抑制作用

目的 研究特异性抑制呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)N基因的脱氧核酶DZ1133在小鼠体内对病毒复制和气道炎症的影响.方法 RSV感染BALB/c小鼠滴鼻给予DZ1133及其变异体、反义寡核苷酸AS1133,空斑形成实验检测肺组织病毒滴度,RT-PCR检测病毒mRNA表达,支气管肺泡灌洗液白细胞计数,ELISA检测TNF-α、IL-12、IFN-γ和IL-10水平,肺组织病理学分析炎症情况.结果 0.2、0.4 mg和0.8 mg DZ1133治疗组小鼠肺组织病毒滴度分别为(2.75±0.21)×105、(1.86±0.20)×105PFU/g和(1.02±0.22)×103PFU/g,与感染对照组小鼠(7.94±0.42)×105PFU/g比较明显下降(P<0.01),上述各剂量治疗组小鼠肺组织病毒mRNA表达与感染对照组比较分别下降30.51%、47.38%(P<0.05)和53.97%(P<0.01).0.4 mg DZ1133治疗降低RSV感染小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞总数,改善肺组织病理学损伤(P<0.05),对TNF-α、IL-12、IFN-γ和IL-10水平无显著性影响(P>0.05).结论 特异性脱氧核酶DZ1133在小鼠体内有效抑制RSV复制、减轻气道炎症,是有效的抗RSV途径.     

广州地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因序列分析

目的：探讨广州地区呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因变异的生物学意义，为研究广州地区BSV感染特点及RSV疫苗提供依据。方法：用PT—PCR的方法从广州地区呼吸道合胞病毒分离株98159株的细胞培养物中扩增出编码其表面蛋白G的基因片段，克隆至pGEM—T载体中并进行序列测定。结果：序列测定结果与A亚型原型株A2抹、1990年中国北京地区分离株B79G蛋白的核苷酸序列比较核苷酸同源率分别为92．7％及98．4％；由核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源率分别为88.3％及97．0％。一些重要的免疫反应位点发生了变异。结论：RSVG蛋白抗原结构变异大，在研制疫苗时应注意选用株的地区性。     

龙胆水提液体外抑制呼吸道合胞病毒作用研究

目的了解龙胆水提液体外抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的作用.方法采用细胞病变抑制实验观察龙胆水提液在HeLa细胞中对呼吸道合胞病毒的抑制作用.结果龙胆水提液的半数中毒浓度(TC50)为15.25mg/ml;抑制RSV的半数有效浓度(EC50)为1.07mg/ml,治疗指数(TI)为14.25;且对RSV的抑制作用存在明显的量效反应关系(P<0.01).结论龙胆水提液在HeLa细胞中对呼吸道合胞病毒有明显的抑制作用.     

A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达

目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒（HRSV）G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定。方法自行设计引物,利用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,酶切鉴定后,脂质体法转染COS-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定基因转录和蛋白表达。结果真核表达载体pcDNA3．1（＋）G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,RT-PCR检测到G基因有转录,Western blotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带。结论成功克隆A亚型HRSVG基因,并在真核细胞中获得表达。     

RSV与HRV在ALRTI住院儿童中的流行状况和临床特征比较

目的:了解RSV和HRV在ALRTI住院儿童中流行病学和临床特征的异同。方法:收集2007年9月~2008年8月ALRTI住院患儿NPA样本,进行病毒核酸检测,统计分析RSV和HRV检出病例的流行状况、临床特点。结果:1165名患儿检出RSV 315例(27.0%),HRV 202例(17.3%);性别之间检出率无统计学差异;RSV检出患儿平均年龄13.1±14.3月,1岁以下检出率最高,且明显高于同年龄段HRV检出率;HRV检出患儿平均年龄15.8±17.8月,1岁检出率最高,并高于同年龄段RSV检出率;RSV检出以11月份到次年2月份为高峰;HRV检出以4月份、9~12月份为高峰;与RSV比较,HRV检出病例临床特点除末梢血白细胞计数升高较多见外,其它均无差异;与单一RSV检出病例比较,RSV混合其它病毒检出病例并发症较多,且末梢血白细胞计数升高较多见;单一HRV检出病例未见发绀,其余临床特点与混合其它病毒检出病例无差异。结论:RSV和HRV是长沙地区ALRTI住院儿童的重要病原体,两者在年龄、季节分布上有不同,临床特点无明显差别。     

基于RNA测序的A亚型呼吸道合胞病毒毛细支气管炎转录组学特征分析及关键基因预测

目的：基于RNA测序数据的分析,寻找A亚型呼吸道合胞病毒（RSV）毛细支气管炎有关的关键基因（Hub基因）和通路,为RSV毛细支气管炎的干预和治疗提供依据。方法：招募23例RSV毛细支气管炎住院患儿为病例组,以10例健康儿童为对照组。收集外周血白细胞并提取RNA用于高通量测序。利用三种R软件包（DESeq2、edgeR、limma）获取病例组和对照组之间的差异表达基因（DEGs）。利用R包clusterProfiler和Metascape在线工具对所有的DEGs进行GO和KEGG富集分析。利用STRING数据库进行DEGs的蛋白互作分析,用Cytoscape软件筛选Hub基因。结果：共筛选出286 个DEGs,包括166 个表达上调的基因和120 个表达调的基因。GO功能富集分析发现DEGs主要参与过氧化氢代谢过程、细胞对生物刺激的应激反应、维生素D受体信号通路等生物学过程。KEGG通路分析显示DEGs主要涉及免疫系统中的细胞因子信号、适应性免疫系统、中性粒细胞脱颗粒等信号通路。从蛋白互作网络中筛选出4个核心模块,主要与RAF/MAP激酶级联反应、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体互作等通路有关。最后筛选出RRM2、BUB1B、BUB1、MCM10、CDC45、MKI67、ASPM、NCAPG、NUSAP1、ESPL1、CDT1 共11个与A亚型RSV毛细支气管炎相关的Hub基因。结论：本研究鉴定出的免疫相关通路和Hub基因可能与RSV毛细支气管炎发病有关,其具体机制值得进一步研究。     

呼吸道合胞病毒感染对肺组织GRK2的影响及其与哮喘的关系

目的 :探讨呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染鼠肺组织后,G蛋白偶联受体激酶2(G protein coupled receptor kinase 2,GRK2)的变化规律及其与哮喘的关系。方法:Balb/c雌性小鼠100只,随机分为5组,每组20只。正常对照组,于第1、14天予生理盐水0.2 ml腹腔注射,第21~25天用37℃生理盐水20 ml雾化吸入30 min;RSV感染组,于第19、20、21天,以RSV按浓度1×106PFU、100μl/次鼻腔滴入;哮喘组,第1、14天予以鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)100μg、AL(OH)32 mg腹腔注射,第21天开始激发,以2%OVA生理盐水20 ml雾化吸入30 min,持续激发5 d;双重感染组,模型制备同哮喘组,第19、20、21天,以RSV按浓度1×106 PFU、100μl/次鼻腔滴入;地塞米松干预组,RSV感染同RSV组,第21~25天予腹腔注入地塞米松0.2 mg/(kg·d)。末次激发后24 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 ml/kg),处死小鼠,取左肺上叶和右肺中叶,4%甲醛固定,分别用于免疫荧光检测GRK2的表达和组织病理改变检测;取右肺下叶用于Western blot检测各组GRK2的表达;无菌条件下取左肺下叶,用于肺组织病毒分离及免疫荧光鉴定。结果:RSV组GRK2表达较正常组显著增加,与哮喘组相比差异有统计学意义;双重感染组GRK2表达较RSV组显著增加;地塞米松干预组GRK2表达较RSV组显著减少。结论:RSV感染小鼠肺组织后GRK2表达增加,合并哮喘时表达显著增加,地塞米松干预对GRK2的表达有一定的抑制作用。