鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定

目的建立一种高效提取、分离、纯化鼠尾胶原蛋白的方法。方法通过对鼠尾进行剥离获得鼠尾腱,用Tris-HCl缓冲液、胃蛋白酶处理获得鼠尾胶原蛋白原液、反复使用氯化钠溶液进行分级盐析、醋酸溶液复溶进行鼠尾胶原蛋白的纯化。超纯水透析除去无机盐类获得纯化的鼠尾胶原蛋白。通过SDS-PAGE蛋白质电泳、氨基酸含量分析等技术手段鉴定。结果本研究建立的方法可以获得高纯度的鼠尾胶原蛋白,纯度达到电泳纯。与国外进口的商业化鼠尾胶原蛋白产品相比无差异。研究了提取、分离、纯化参数对得率、纯度的影响,建立了最优的鼠尾胶原蛋白提取条件,胃蛋白酶用量:1∶500,酶解时间:72 h,盐析浓度:2 mol/L,提取所用酸溶液:0.05mol/L醋酸溶液。结论为鼠尾胶原蛋白的扩大化生产提供了合适的工艺参数,为大量获得鼠尾胶原蛋白并进行更深层次的功效方面研究提供了理论支持和实践基础。     

鼠肺表面活性物质结合蛋白D提取方法的改良及鉴定

目的：提取及纯化SD大鼠肺灌洗液中表面活性物质结合蛋白D（SP-D）。方法：取SD大鼠肺泡灌洗液,经Tris-HCl-EDTA法提取和maltose-agarose亲和层析法纯化SP-D,用SDS-PAGE电泳及SP-D与幽门螺杆菌的玻片凝集试验鉴定。结果：从SD大鼠肺灌洗液中提取出较高浓度的蛋白,经SDS-PAGE电泳检测,分子量约43 kD,提取的蛋白可与幽门螺杆菌发生明显凝集。结论：采用maltose-agarose亲和层析法可以从SD大鼠肺灌洗液中获得较高纯度的SP-D。     

羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定

目的 从羊肋软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行鉴定.方法 选择羊肋软骨为原料经脱脂、脱钙后,用盐酸胍去除蛋白多糖,经胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤,提取纯化蛋白,然后进行鉴定.结果 4mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖,用胃蛋白酶的限制性酶解结果满意;氯化钠盐析浓度为3mol/L时最佳.SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的蛋白与sigma公司的Ⅱ型胶原蛋白一致.Ⅱ型胶原蛋白最大吸收峰为212 nm.结论 从羊肋软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高,且符合Ⅱ型胶原蛋白的特征.     

两种方法测定猪血小板衍生生长因子相对分子质量的对比分析

血小板衍生生长因子(PDGF)是对机体组织器官具有广泛调节作用的多肽[1],对提取、纯化的PDGF的相对分子质量和纯度进行分析,是了解其理化性质和生物学特性的基础.在生物化学领域中,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效液相色谱(HPLC)技术已广泛用于氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等产物的分离和鉴定.本实验在已提取和纯化猪PDGF(pPDGF)[2]的基础上,应用SDS-PAGE和HPLC法[3]对其进行相对分子质量(Mr)和纯度的测定,并将两种方法的结果进行比较.     

中国鲎鲎抗脂多糖因子的提取、纯化及其活性的初步鉴定

目的 从中国鲎血细胞中提取鲎抗脂多糖因子并初步鉴定其活性。方法 采用超滤、浓缩、离子交换层析等方法提取、纯化中国鲎鲎抗脂多糖因子，应用鲎变形细胞溶解物抑制试验测定其活性。结果 初步纯化得到的鲎抗脂多糖因子经SDS—PAGE鉴定其纯度达90％以上，分子量为15．68kD，在体外可中和脂多糖(LPS)凝固鲎溶解物的活性，其中和比例约为500：1。结论 初步纯化的中国鲎鲎抗脂多糖因子具有中和LPS的活性。     

红芸豆红细胞凝集素单体的分离纯化和性质研究

目的 研究一种从红芸豆中提取红细胞凝集素单体(PHA-E)的新方法.方法 红芸豆经过浸提,离子交换树脂分离,分子筛层析纯化后得到PHA-E样品.采用电泳法测定其纯度、分子量和等电点.用2%人细胞悬液测定样品凝集红细胞的能力和影响凝血的因素,使用硫酸苯酚法测定其糖含量.结果 经PAGE分析PHA-E样品为单带电泳纯,SDS-PAGE上显示亚基分子量为32 kD,等电点为6.5.样品使人红细胞50%凝集的蛋白质最低浓度为4μg/ml左右.单糖不影响PHA-E凝血活力,EDTA抑制其凝血活力,Zn2+促进其凝血.糖含量为8.1%.     

人胎儿血红蛋白的纯化及免疫活性鉴定

目的研究胎儿血红蛋白纯化的最佳方法,并对其进行免疫活性鉴定。方法采用生理盐水洗涤、四氯化碳萃取得到粗提胎儿血红蛋白,再经sephadexG50凝胶层析柱纯化。纯化后的胎儿血红蛋白利用SDS—PAGE电泳、蛋白质印迹鉴定其性质。结果获得了具有生物活性的胎儿血红蛋白．经SDS-PAGE电泳鉴定纯化蛋白杂带消失,蛋白单体相对分子质量为16000Mr,纯度为95％,蛋白质印迹结果显示纯化后的蛋白具有良好的抗原性。结论该方法成功获得了纯度较高的胎儿血红蛋白,且操作简便,纯化效果好。     

猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定

目的：从猪关节软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行鉴定。方法：选择猪关节软骨为提取原料,用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠盐析、DE22纤维树脂处理等步骤,提取纯化Ⅱ型胶原蛋白。采用SDS-PAGE、吸收光谱分析、氨基酸成分分析等方法对Ⅱ型胶原蛋白进行鉴定。结果：4mol／L盐酸胍能有效去除蛋白多糖;分步加入胃蛋白酶的限制性酶解结果满意;氯化钠盐析浓度为2．4mol／L时最佳。SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的Ⅱ型胶原蛋白与Sigma公司的产品一致。Ⅱ型胶原最大吸收峰为230nm,氨基酸成分分析显示甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量最高。结论：实验结果提示从猪关节软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高,符合Ⅱ型胶原的特征。提取材料广泛、实验条件简便。结果可靠。     

幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白与麦芽糖结合蛋白融合表达产物rMBP-NAP的分离纯化

目的：从E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)细菌中分离纯化与麦芽糖结合蛋白融合表达的重组幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白rMBP-NAP,筛选幽门螺杆菌口服疫苗抗原组分。方法：0．3mmol／L IPTG在37℃,230r／min条件下诱导基因丁程菌E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)3h。4℃ 4000g离心20min收获细胞。过柱缓冲液重悬细胞,一20℃冻仔过夜,在冰水浴中超卢破碎工程菌,4℃,9000g离心30min,十二烷基磺酸钠-聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析工程菌中rMBP-NAP可溶性;低相对分子质量蛋白Marker做标准对照,GeneTool测定诱导蛋白相对分子质量。FPLC分子排阻层析法分离rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描法测纯化蛋白质的纯度,Bradford法检测蛋白质含量。结果：E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)诱导表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,占上清中蛋白总量的39．35％,相对分子质量约为57000,与预期结果一致;分子大小排阻层析一步法纯化rMBP-NAP纯度可达91％,含量可达0.121g/L。结论：FPLC分子排阻层析可从大肠丁程菌超声菌液巾快速纯化rMBP-NAP。     

改良裂解法提取微量组织DNA的研究

为了探讨微量组织核酸的冷静 效的提取方法,采用改良裂解法提取２５例微量胃粘膜组织村本的核酸,同时与经典的饱和酚抽提法和简便的消化煮沸法进行比较,用１％琼脂糖电泳观察结果,并用分光光度法检测提取核酸的量。结果显示该法的提取纯度接近酚抽提法,所获核酸的量较多,而所需的时间最短;     

抗幽门螺杆菌蛋黄免疫球蛋白IgY的制备及生物活性的研究

目的:从免疫了幽门螺杆菌(Hp)抗原的母鸡蛋黄中提取抗Hp-IgY。方法:用超声破碎的Hp抗原免疫21周龄罗曼产蛋母鸡,取免疫后所产鸡蛋卵黄,利用水稀释法加硫酸铵盐析方法,提纯IgY,ELISA间接法检测抗体效价,Bradford法检测抗体蛋白含量,SDS-PAGE法检测其相对分子质量及纯度。结果:母鸡初次免疫后第7天,抗体效价即渐渐升高,约第45天达到高峰;蛋黄抗体经纯化后,抗Hp-IgY蛋白纯度可达90%以上,含量为6.25 g/L。结论:用超声破碎的Hp抗原免疫母鸡,盐析法提纯免疫母鸡产蛋黄中的抗Hp-IgY,可获得高纯度及高效价的抗Hp的特异性蛋黄抗体。     

五株钩体膜蛋白和脂多糖的SDS—PAGE,ZD—PAGE图谱的比较研究

We applied SDS-PAGE, 2D-PAGE and Western blot to analyse the outer envelopes protein and LPS of five strains of leptospires. The work would lay foundations for taxonomy, the development of vaccination regimens and the elucidation of pathogenic mechanisms. The outer envelope proteins of leptospires were analyzed by SDS-PAGE and silver staining. We found that the protein profiles of the pathogenic leptospires were basically identical. A comparison of the protein profiles of the pathogenic L. with those exhibited by two nonpathogenic L. indicated that there was no obvious relationship between these organisms and any of the L. interrogans strains examined. The quantity of 21.5 kd protein of strain 017 was greater than that of strain 601 and 156. Approximately 200, 225, 238 distinct polypeptides were detected in the strain 017, 601 and 156 in 2D-PAGE by silver staining respectively. The profiles of 2D-PAGe showed obvious differences in pI. The pI of strain 017, 601 and 156 were mainly 6.68-7.4, 6.55-6.9, 5.85-7.1 respectively. The 21.5 kd protein of strain 017 was made up of six polypeptides. Our immunoblots revealed that McAb (LB1) reacted with a 41 kd antigen, which was common to the three virulent leptospires tested. SDS-PAGE profiles of silver stained outer envelope LPS of pathogenic L. differed greatly from those of the nonpathogenic L. There was a distinct differences between strain Patoc I and 3055. Our studies showed that each of the five strains of leptospires possessed characteristic outer envelope LPS, which may be used to identify the genus, species and serovars of a strain of L.     

肝螺杆菌MCSTP的基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆肝螺杆菌(H.hepatieus)基基团接受趋化信号转导蛋白(MCSTP)全基因,并应用生物信息学方法对其进行分析.方法 以肝螺杆菌全基因组作为模板,设计肝螺杆菌MCSTP c1977特异性引物,利用PCR方法扩增目的 基因片段,连接至原核表达载体pET22b(+).从而构建原核表达质料pET22b+/MCSTP并测序鉴定.廊用牛物信息学方法分析MCSTP基囚的序列同源性及其结构特征.结果 克隆的MCSTP基因经测序可知与GenBank公布的肝螺杆菌标准株ATCC51449序列一致性达99%,仅第1 160 bp处由A变为T.利用生物信息学方法进行分析可发现此基因与空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌具有非常低的相似性,表明其在微生物界巾具有一定的特异性.结论 成功构建pET22b+/MCSTP重组质粒,并通过生物信息学技术进行序列及结构分析,为进一步研究其生物学功能及致病机制提供了线索和依据.     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白包涵体的纯化及活性鉴定

目的：建立一种有效的纯化幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位-尿素酶B亚单位(HspA-UreB)融合蛋白包涵体的方法。 方法：基因工程重组大肠杆菌BL21(pET-HU27)诱导表达的HspA-UreB融合蛋白包涵体经洗涤、变性、复性,在A¨KTA FPLC上运用HiTrap Chelating HP分离纯化,用SDS-PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量,用Western blotting对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。 结果：纯化后HspA-UreB融合蛋白的纯度＞90%,含量达0.25 g•L^-1,并可以被HspA-UreB融合蛋白免疫小鼠血清识别。 结论：成功地建立了从包涵体中纯化高纯度HspA-UreB融合蛋白的方法。     

两种果子狸血清IgG纯化方法的比较

目的探讨一种具有简便快捷、高纯度、活性好的果子狸血清IgG纯化方法。方法比较Hitrap Protein A亲和层析和PAGE电泳两种纯化法对果子狸血清IgG的纯化,用PAGE还原电泳和Western-Blot法对IgG作纯度鉴定。结果对Hitrap Protein A纯化的果子狸血清IgG,其活性虽好,但纯度不高;而非还原PAGE电泳所纯化的果子狸血清IgG不但纯度高(>95%)、并具有较强的免疫活性。结论非还原PAGE电泳法纯化果子狸血清IgG,是一种具有高纯度、免疫活性强的纯化方法。     

抗内毒素IgY的制备及稳定性研究

目的 用大肠杆菌J5制备特异抗内毒素IgY，探索防治内毒素血症的新途径。方法 用大肠杆菌J5作抗原免疫25周龄Roman鸡，水溶法提取抗体，进行SDS-PAGE及Western blot分析，通过酶联染色反应检测其免疫学活性，ELISA检测其时酸、碱和酶的稳定性。结果 抗体含量为11．4mg／ml蛋黄液，纯度为92．3％，分子量为180KD，初步鉴定其时内毒素具有特异性结合作用，并且对酸、碱、酶有很好的稳定性。结论 用大肠杆菌J5株免疫鸡可刺备出特异性抗内毒素的IgY，且具有良好的稳定性，作为口服制剂为预防和治疗内毒素血症奠定了基础。     

蟾蜍灵对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响

目的:探讨蟾蜍灵(bufalin)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)凋亡的影响.方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞.分为对照组、LPS刺激组和蟾蜍灵干预组,应用台盼蓝拒染法检测蟾蜍灵对GMC的细胞毒性作用,应用透射电镜观察系膜细胞超微结构的变化,采用逆转录PCR检测Bax和Bcl-2基因mRNA的表达.Western blot法检测Bax和Bcl-2的蛋白表达.结果:透射电镜观察蟾蜍灵干预组可见凋亡早期形态学改变.逆转录PCR和Western blot结果显示蟾蜍灵组较脂多糖组Bax表达增多,Bcl-2表达减少,差异均具有统计学意义(P＜0.01),蟾蜍灵干预后,Bax较Bcl-2表达过量.结论:蟾蜍灵可能通过调节Bax和Bcl-2的相对表达量而诱导脂多糖作用后肾小球系膜细胞发生凋亡.     

隐孔菌多糖对脂多糖诱导人肺上皮细胞生成单核细胞趋化蛋白-1的作用

目的：研究隐孔菌多糖（CP）对脂多糖（LPS）诱导人肺上皮细胞株A549生成单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的影响。方法：在有或无CP条件下用LPS诱导A549细胞株,分别采用ELISA和RTPCR法,测定MCP-1蛋白浓度和MCP-1 mRNA的表达。结果：LPS 1000μg／L诱导A549细胞24h明显增加MCP1的生成。CP 100μg／L或地塞米松1μmol／L对A549细胞株的生长和活力无明显影响。CP100μg／L或地塞米松1μmol／L能明显抑制LPS诱导A549细胞株的MCP-1蛋白含量和mRNA的表达。结论：结果证明,CP能调节MCP-1的生成,可能是其抗肺部炎症的作用机制之一。     

~（125）I标记反义肽核酸对SKOV3细胞CerbB-2 mRNA和Her-2蛋白表达的抑制作用

目的探讨利用脂质体转染125I标记的CerbB-2反义肽核酸（asPNA）阻断人卵巢癌细胞株SKOV3中CerbB-2mRNA翻译并抑制Her-2蛋白表达的作用。方法 （1）125I用CH-T法标记CerbB-2-asPNA,测定其标记率和放化纯。（2）分对照组、非标记分子探针组和125I标记反义肽核酸组,运用RT-PCR法检测各组细胞CerbB-2mRNA的翻译。（3）运用流式细胞仪检测各组细胞的Her-2蛋白表达率。结果 （1）125I标记CerbB-2-asPNA的标记率为（56.90±4.38）%,放射化学纯度为（87.00±0.99）%,放射性浓度为3.7MBq/ml,化学浓度为5.00μmol/L。（2）125I标记CerbB-2-asPNA作用SKOV3细胞24h后,SKOV3细胞CerbB-2在mRNA水平上明显下降,与SKOV3细胞对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）。（3）125I标记CerbB-2-asPNA作用SKOV3细胞24h后,细胞的Her-2蛋白表达率降低幅度较大,与SKOV3细胞组对比,两者间差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 125I-L-CerbB-2-asP-NA对人卵巢癌细胞株SKOV3CerbB-2基因表达在mRNA翻译和蛋白表达水平上均有抑制作用。     

虎杖甙对内毒素性心肌细胞损伤的防治作用

目的 观察脂多糖(LPS)对心肌细胞微丝蛋白的形态学影响以及中药虎杖甙(PD)的防治效果。方法 体外乳鼠心肌细胞培养，随机分为4组：正常对照组(D′-Hanks作用于心肌细胞30min)、PD组(0．2mmol／L作用于心肌细胞10min)、LPS组(100ng／ml刺激30min)和LPS PD组(100ng／ml LPS30min，0．2mmol/L PD治疗10min)。用免疫荧光技术标记纤维状肌动蛋白(F-actin)。结果 正常对照组心肌细胞皮质部分有较多纤维状肌动蛋白分布，细胞内纤维状肌动蛋白呈网状布满于整个细胞；LPS组细胞皮质部分染色较弱甚至消失，心肌细胞应力纤维(stress fiber)形成；PD(0.2mmol/L)处理10min后，心肌细胞应力纤维消失，形态趋于正常组细胞；而PD组和正常对照组细胞形态无明显差异。结论 LPS可能直接导致心肌细胞应力纤维的形成，PD对LPS导致的心肌细胞损伤有保护作用。