从基因敲除小鼠心肌组织中筛选热休克反应中受HSF1调控的靶基因

目的：用cDNA芯片从热休克转录因子1（HSF1）基因敲除小鼠心肌组织中筛选热休克反应受HSF1调控的靶基因。方法：用cDNA芯片检测热休克反应（42℃ 15 min,恢复3 h）中HSF1 / 小鼠心肌组织基因表达谱的改变(以HSF1+/+小鼠为对照);用RT PCR对cDNA芯片筛选结果进行验证;对差异表达的已命名基因进行启动子区转录因子结合位点的分析。结果：共筛选到差异表达基因1 142个;其中在HSF1 / 小鼠心肌中表达下调的基因为398个,已命名基因为173个;在HSF1 / 小鼠心肌中表达上调的基因为641个,已命名基因为235个。在HSF1 / 小鼠心肌中表达下调2.5倍的已命名基因中,有5个基因启动子区含有热休克元件（HSE）;在HSF1 / 小鼠心肌中表达上调2.5倍的已命名基因中,有6个基因启动子区含有HSE。结论：在热休克反应中,HSF1可对多个基因的表达进行直接或间接的调控。     

凋亡素与热休克蛋白70启动子区热休克元件特异结合诱导HepG2细胞凋亡

目的 探讨凋亡素下调HepG2细胞热休克蛋白70 (HSP70)的分子机制.分析凋亡素与HSP70启动子区热休克元件(HSE)的相互结合作用.方法 应用凝胶电泳迁移率分析(EMSA)法检测凋亡素与HSE的结合;荧光素酶报告基因实验进一步分析凋亡素在细胞内与HSE的结合能力.结果 EMSA结果表明凋亡素在体外和细胞水平可以直接与HSP70启动子区的HSE结合,凋亡素浓度越高,与HSE结合能力越强;Luciferase报告基因结果显示凋亡素对HSE具有专一的结合能力,揭示在与HSE结合上,凋亡素与HSF1间存在竞争关系.结论 凋亡素与HSP70启动子区HSE序列结合,抑制HSP70转录的起始,显著下调HSP70的表达,解除HSP70对肿瘤细胞的保护作用,诱导肿瘤细胞的凋亡.     

HSF1调控的炎症相关基因的筛选及SOCS3基因的实验验证

目的：筛选热休克因子1（HSF1）调控的炎症相关基因,初步探讨HSF1对下游基因的调控作用。方法：采用HSF1基因敲除小鼠,制备内毒素腹腔注射以及热休克反应后再给予内毒素腹腔注射的内毒素血症模型,分别抽提HSF1缺失突变纯合子和HSF1野生型小鼠肺组织总RNA,用微阵列进行筛选;用转录元件搜索软件分析差异表达基因的启动子区;选取启动子区含有热休克元件的基因：细胞因子信号转导抑制子3（SOCS3）,采用热休克反应（HSR）和HSF1过表达的RAW264,7巨噬细胞给予内毒素刺激,抽提总RNA进行RT—PCR,Northern印迹实验,观察HSR和HSF1过表达对内毒素诱导的SOCS3基因表达的影响。结果：用微阵列的方法筛选到HSF1可能抑制表达的炎症介质基因15个,其中9个基因的启动子区含有热休克元件;HSF1可能促进表达的炎症介质基因11个,其中8个基因的启动子区含有热休克元件;HSR和HSF1过表达可明显抑制小鼠RAW264．7巨噬细胞内毒素诱导的SOCS3mRNA的表达。结论：HSF1可抑制炎症介质SOCS3mRNA的表达。     

3种转录因子对FXN基因表达的影响

目的弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia,FRDA)是一种常染色体隐性遗传疾病,其发病机制是frataxin(FXN)基因的第1个内含子上GAA序列的大量重复扩展,使FXN蛋白表达量减少所致。文中旨在研究FXN基因启动子区域上的转录因子对FXN表达的影响。方法运用Genomatix软件预测出FXN基因的启动子区域及转录因子可能的结合位点,用基因定点突变技术克隆这些结合位点,并用双报告基因法检测启动子活性;qPCR、Western blot以及酶活性实验分别用于检测过表达转录因子后FXN表达量的变化及FXN在铁代谢中的功能。结果启动子活性测定发现FXN基因的启动子1和启动子2活性较高,在该活性较高区域,预测出转录因子可能结合位点,并发现这些结合位点对启动子的活性很重要;过表达转录因子HMX2、HMX3和EGR3能促进细胞内源性FXN mRNA和蛋白的表达,并影响细胞内铁代谢水平。结论转录因子HMX2,HMX3和EGR3能够促进FXN基因的表达,增强细胞铁代谢的能力和线粒体的功能。     

热休克蛋白与心肌保护

热休克蛋白(HSP)作为分子伴侣的防御机制首先需要热休克转录因子作为热休克反应的媒介。HSP的过度表达有心肌保护作用,能阻碍心肌细胞凋亡、保护缺血时心肌细胞微管和肌动蛋白骨架以及内皮细胞的完整性、参与蛋白激酶和转录因子如缺氧诱导转录因子(HIF)-1α和热休克转录因子(HSF1)的折叠和激活、黏附NO合成酶以及刺激其活性,还可能下调细胞因子产物。因此,避免任何不良反应,并采用药理学和基因治疗的程序诱导心肌中HSP水平的升高在心肌保护中有重要意义。     

热休克蛋白对癌的诊断、预后、预测及治疗的影响

热休克蛋白(heat shock protein,HSP)首次发现是作为一组蛋白,通过热休克反应及理化刺激诱导产生,存在于大多物种之中.随后发现,其具有分子伴侣特性.其表达在大多癌组织中是增高的,对癌逃逸凋亡起着重要作用,转录时需要转录因子1（HSF1）参与[1,2].HSP和HSF1表达增高的分子机制目前仍不清楚.     

HSF4b基因敲除下调αB-晶状体蛋白表达介导白内障发生

目的阐明热休克转录因子4b（HSF4b）对αB-晶状体蛋白（αB-crystallin, CRYAB）的调控在白内障发病过程中的作用及其机制。方法采用qPCR、Western印迹法和免疫荧光检测Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶状体中CRYAB和HSF4的表达情况;通过凝胶迁移实验、染色质免疫共沉淀、双报告基因检测等方法研究HSF4b对CRYAB的调控作用;通过免疫荧光分析和免疫共沉淀研究CRYAB与波形蛋白（vimentin, VIM）的相互作用。结果Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶状体中CRYAB表达下调;体外试验证实HSF4b和CRYAB的表达呈现正相关性;HSF4b直接与CRYAB启动子结合,激活CRYAB表达的转录过程;CRYAB与VIM存在相互作用。结论阐明了Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠中晶状体发育异常和白内障形成的分子机制。鉴定出CRYAB是HSF4b的下游调控分子。CRYAB对VIM具有稳定作用,有可能是抗白内障药物的作用靶点。     

热休克因子1在肿瘤侵袭与治疗中的研究进展

热休克因子1(HSF1)是调控真核细胞热休克基因转录的关键因子,在应激和正常生理条件下发挥重要作用。HSF1通过多种途径促进肿瘤的发生与发展,本文就HSF1的结构、肿瘤对HSF1的调控、HSF1在肿瘤中的作用及HSF1靶向治疗进行综述。     

成纤维细胞生长因子19转录活性及上游结合元件分析

目的 构建FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒,并研究分析其启动子区的转录活性和结合元件。方法 设计特异性引物PCR扩增基因组DNA,得到长为3323bp的FGF19基因启动子区片段,将此PCR产物插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic Vector,获得全长为3323bp的FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒。在此基础上设计特异性引物,构建5''端系列缺失荧光素酶报告基因质粒。通过瞬时转染实验检测所构建质粒的相对荧光素酶活性,分析不同启动子区片段对FGF19基因转录活性的影响,并用软件预测影响启动子转录活性的关键转录因子。结果 构建了7个FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒,经双酶切和测序验证均正确。瞬时转染及荧光素酶报告基因分析实验发现启动子区-2351~-2316是调控FGF19启动子转录活性的重要序列,且在线软件预测该序列存在潜在的转录因子位点。结论 FGF19基因启动子区-2351~-2316是调控其启动子转录活性的关键位置。     

人NFBD1启动子区域顺式作用元件CHR的定点突变分析

目的对NFBD1启动子区域顺式作用元件CHR进行定点突变分析,以分析CHR在NFBD1转录调控中的作用。方法以原有NFBD1核心启动子荧光素酶报告基因重组体NFBD1-PS1-325为模板,采用PCR介导的基因定点突变技术对NFBD1启动子区域中的CHR位点进行定点突变,构建相应的CHR定点突变重组体;采用荧光素酶双报告基因分析技术检测各重组体的启动子活性,分析CHR定点突变对NFBD1启动子活性的影响;结合阿霉素处理,分析CHR在DNA损伤后NFBD1转录下调中的潜在作用。结果CHR定点突变后能显著降低NFBD1的启动子活性;CHR定点突变后显著减弱了DNA损伤后NFBD1的转录下调比例。结论CHR参与NFBD1的基础转录调控及DNA损伤后的转录下调。     

人HAS3基因核心启动子区域的初步鉴定与分析

目的对人HAS3基因的核心启动子区域进行初步鉴定和分析,为深入研究HAS3基因的转录调控奠定基础。方法以前期构建的人HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体P(-761/-305)为模板,采用PCR介导的基因定点突变技术构建4个不同的系列删除体,并对HAS3启动子区域中的Sp1结合位点和核心启动子元件进行定点突变,构建相应的定点突变重组体;采用荧光素酶双报告基因分析技术检测各重组体的启动子活性。结果构建了P(-761/-569)、P(-563/-305)、P(-490/-305)和P(-433/-305)4个系列删除体和5个定点突变体;启动子活性分析结果表明,P(-761/-569)无启动子活性,P(-563/-305)、P(-490/-305)和P(-433/-305)均具有较强的启动子活性,Sp1结合位点和核心启动子元件的定点突变可导致HAS3启动子活性的降低。结论 HAS3基因的核心启动子区域主要位于其转录起始位点上游附近-433～-305 bp内,Sp1可能在HAS3的转录调控中起重要作用。     

MAPK信号通路对人胆管癌细胞Fas配体基因表达的调节及其机制的初步探讨

目的观察MAPK/ERK kinase(MEK)抑制剂PD98059对人胆管癌细胞Fas配体(Fas ligand,FasL)表达的影响及其作用机制。方法用RT-PCR和Western bolt检测PD98059处理组及未处理组人胆管癌细胞(QBC939)中c-Myc、p-c-Myc和FasL的表达;构建含FasL基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,瞬时转染人胆管癌细胞,用PD98059处理后,检测荧光素酶相对活性,比较启动子活性的变化情况;染色质免疫共沉淀(ChIP)技术分析p-c-Myc和FasL基因启动子的结合情况。结果PD98059处理组胆管癌细胞磷酸化c-Myc(p-c-Myc)和FasL的表达均明显降低,而c-Myc未见明显变化;人胆管癌活细胞中p-c-Myc与FasL基因启动子有结合;PD98059处理组胆管癌细胞荧光素酶活性与对照组相比下降约80%。结论PD98059通过抑制MAPK/ERK kinase(MEK)的活性,降低c-Myc磷酸化水平,进而下调FasL基因启动子活性,从而抑制人胆管癌细胞FasL基因的表达。     

STAT1对hsp90∝基因表达的负调控作用

目的 探讨转录因子STAT1对hsp90∝基因表达的调控作用。方法 将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞,利用竞争性RT－PCR定量检测其内源性hsp90∝基因mRNA水平。共转染STAT1表达质粒和hsp90∝基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因质粒,利用定量RT－PCR检测CAT报告基因转录水平,用Western印迹分析方法检测42℃ 1h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态,用电泳迁移率变更分析（EMSA）检测STAT1与hsp90∝5‘基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度。结果 STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90∝基因的表达,又能抑制hsp90∝基因5‘上游调控区驱动的CAT报告基因活性。热激以前Jurkat细胞中的STAT1 701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化,热激以后其磷酸化程度明显升高,而且STAT1与hsp90∝基因5‘上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合。结论 STAT1对hsp90∝基因的表达具有负调控作用。     

热激启动子驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP的构建与鉴定

目的 构建热激启动子(pHSP)驱动的靶向敲低Polo样蛋白激酶1(PLK1)的真核表达质粒,并观察其对骨肉瘤U2OS细胞增殖的影响.方法 首先合成热休克蛋白HSP70的启动子,克隆至带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的真核表达质粒pEGFP-C1中,利用pHSP替换原有的CMV启动子,构建真核表达载体pHSP-GFP;其次,利用RNA干扰技术合成以plk1基因为靶向目标的shRNA,将其定向克隆至真核表达载体pHSP-GFP中形成重组质粒pHSP-shPLK1-GFP;另外设计一组阴性对照质粒pHSP-NC-GFP,最后,利用脂质体Lipo2000转染的方法将质粒转染至U2OS细胞,非热激组细胞正常培养,热激组及阴性对照组细胞42 ℃加热2 h,通过细胞免疫荧光染色实验检测GFP的表达,从而确定pHSP的驱动能力,采用Real-time PCR法检测细胞内plk1的mRNA表达水平,Western blot法检测PLK1蛋白表达水平,MTT法检测重组质粒对U2OS细胞增殖的影响.结果 成功构建了pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP;细胞免疫荧光染色实验结果显示pHSP可正常驱动gfp基因的表达,且GFP蛋白定位在胞质中;Real-time PCR结果显示热激组细胞plk1基因表达量明显降低,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示热激组细胞PLK1蛋白表达量比非热激组及阴性对照组低(P<0.05);MTT结果显示热激组细胞的增殖活性被明显抑制,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP能在U2OS细胞中表达,在42 ℃加热条件下,该重组质粒呈现更强的下调plk1基因表达和抑制增殖作用.