肠出血型大肠埃希菌免疫PCR检测方法的建立

目的建立检测肠出血型大肠埃希菌O157：H7的免疫PCR技术,确定该方法的灵敏度和特异性。方法链亲和素桥联生物素化的二抗和双链DNA指示分子,构建桥联系统,进而建立免疫PCR技术,通过PCR扩增指示分子检测O157：H7。结果免疫-PCR技术最少可检测到10 CFU/ml的纯培养菌,灵敏度较ELISA提高103倍,非O157：H7菌株检测结果均为阴性。结论免疫-PCR技术具有较高的灵敏度和特异性,操作简便、快速,可作为肠出血型大肠埃希菌O157：H7的检测方法。     

四种致泻性大肠埃希氏菌实验室检测研究进展

肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）四种致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌,也是我国绝大多数地区引起腹泻的主要病原菌,因此快速准确地检测这四种病原菌对预防和控制由其引起腹泻有着十分重要的作用。本文介绍了这四种致泻性大肠埃希氏菌实验室检测技术的研究进展,主要包括细菌分离培养、免疫学检测、多重PCR、实时荧光PCR等分子生物学方法。     

大肠埃希菌qnrA基因的检测

[目的]了解大连地区耐环丙沙星的大肠埃希菌中qnrA基因的流行情况并研究其耐药机制。[方法]收集临床分离的耐环丙沙星的大肠埃希菌213株,通过PCR法扩增qnrA基因,对qnrA基因阳性株,KB纸片法检测抗菌药的体外抗菌活性,琼脂稀释法测MIC,并进行质粒结合试验。[结果]213株菌中查到2株qnrA阳性菌株,测序结果与Genbank中qnrA基因比对吻合率达100%。其中一株对多种抗菌药耐药,另一株则比较敏感。[结论]大连地区检测到了qnrA基因阳性的菌株,耐药机制复杂,应引起临床重视。     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化

目的制备肠出血型大肠埃希菌(EHEC)O157:H7EspF蛋白多克隆抗体并初步纯化。方法生物信息学方法分析EHECO157:H7EspF蛋白的柔韧性、亲水性、表面可能性及抗原表位,选取1条由15个氨基酸残基组成的多肽为半抗原,在其C端偶联钥孔血蓝蛋白(KLH),免疫新西兰大白兔制备抗血清。ELISA测定抗血清效价,免疫印迹法鉴定其特异性,辛酸-硫酸铵法初步纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度。结果选择EspF蛋白抗原指数最高的肽段72-TPSRPAPPPPTSGQA-86(0.506)为半抗原,合成抗原多肽经高效液相色谱鉴定,纯度为95.78%,经质谱分析其分子量为1563.76Mr,与目的多肽分子量一致;加强免疫3次后,EHECO157:H7EspF蛋白的抗血清效价达1:2048000;该血清对EHECO157:H7野生株和espF突变株(△espF)的EspF蛋白均有特异性,并经辛酸-硫酸铵法获得一定纯度的抗体。结论成功地制备了效价高、特异性强的EHECO157:H7EspF蛋白多克隆抗体。     

肠致病性大肠埃希菌病原学检验探析

目的:本文将对腹泻患儿进行肠致病性大肠埃希菌病原学检验,从而探讨肠致病性大肠埃希菌的病原学特点。方法:对所有腹泻患者进行粪便采集样本,之后应用病原学检验方法对样本中肠致病性大肠埃希菌进行分离,给予病原学检查,包括形态特征分析、培养特征分析以及生化反应特征分析等,得出结论。结果:231例腹泻患儿粪便样本中均检测出肠道致病性大肠埃希菌,检出率为100.00%。肠道致病性大肠埃希菌菌落呈现出灰色,可略带白色,菌落具有整齐的边缘以及光泽表面;对肠致病性大肠埃希菌进行革兰氏染色可知,其结果为阴性,无芽孢出现,但出现鞭毛,属于短小杆菌,两端呈现出圆顿形。结论:研究肠致病性大肠埃希菌的病原学特点能够有效提高肠道致病性大肠埃希菌引发腹泻等疾病的确诊率,使患者及时得到具有针对性的治疗措施,提高患者治疗效果。     

免疫磁珠富集-实时荧光PCR检测生畜肉中大肠埃希菌O157∶H7的实验研究

目的 建立免疫磁珠富集(immunomagnetic separation,IMS)-实时荧光PCR(q PCR)技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法 根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfb EO157设计引物和Taq Man探针,建立q PCR检测体系;对样品中的O157∶H7大肠埃希菌用出血性大肠O157抗体标记免疫磁珠进行特异性捕获,再利用q PCR技术对磁珠吸附的菌株进行检测。结果 采用IMS-q PCR方法检测,当25 g样本中菌量为100cfu,样品被1∶2稀释时,检测结果呈阳性,检测全过程需时2~3 h。结论 IMS-q PCR检测O157∶H7大肠埃希菌的方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点,可用于大肠埃希菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

实时荧光定量聚合酶链反应在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用.方法 从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以大肠埃希菌特异性引物应用实时荧光定量,扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定,对比实验结果.结果 通过对实时FQ-PCR体系特异性、敏感度、稳定性验证,结果表明具有较好的特异性...     

多重荧光PCR法与细菌培养法在食品中致泻性大肠埃希氏菌检测中的应用

目的通过多重荧光PCR法与细菌培养法在食品中致泻性大肠埃希氏菌检测中的应用,比较两种方法的敏感性、特异性、时限性、重复性。方法采集10类食品200份样品进行细菌培养法和荧光PCR法检测致泻性大肠埃希氏菌。结果在10类食品200份样品中细菌培养法检出普通大肠埃希氏菌30株,致泻性大肠埃希氏菌未检出。多重荧光PCR法检出EHEC阳性4份。其中生禽畜肉检出2份、水产品2份。EPEC、ETEC、EAEC、EIEC均为阴性。结论与传统的细菌培养法相比,多重荧光PCR法可以为细菌分离培养提供初步信息,提示实验室在进行分离培养时应有针对地重点考虑,减轻分离培养繁杂过程,有利于实验室诊断。     

HMGB1基因SNP位点实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立基于Taq Man探针实时荧光PCR技术的高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法。方法收集2014年4月在深圳口岸医院体检的健康人群样本20份,选择HMGB1基因上的2个SNP位点设计常规PCR和实时荧光PCR扩增引物和Taq Man探针,采用基因测序和实时荧光PCR方法对样本进行SNP分型。结果实时荧光PCR方法SNP分型结果显示,在20份样本中的HMGB1基因rs1412125位点检测到TT基因型11例,CC基因型1例,TC基因型8例;HMGB1基因rs3742305位点检测到GG基因型15例,GC基因型5例,未发现CC基因型。这一结果与基因测序方法结论完全一致。结论基于Taq Man探针技术的实时荧光PCR方法进行HMGB1基因SNP分型简单、快速、高效,可用于人群大规模样本的SNP筛查,具有广泛应用的价值。     

Fura-2/AM荧光探针法用于大肠杆菌胞内游离钙的测定

目的探讨经超声处理后大肠杆菌胞内游离钙的变化。方法超声波作用影响大肠杆菌,用Fura-2/AM探针法测定胞内游离钙的变化。结果经超声作用后的大肠杆菌胞内游离钙水平升高,打开了钙依赖性的离子通道,膜两侧离子交流加速,膜通透性增加。结论Fura-2/AM荧光探针法可用于微生物大肠杆菌胞内游离钙的测定。经一定条件下超声作用后的大肠杆菌胞内游离钙水平升高。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7 z0986-z1444双缺失突变株构建

目的 采用Red重组方法敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 z0986和z1444基因,构建双缺失突变株.方法 首先构建z0986、z1444打靶片段;其次以电击法转化感受态细胞,之后通过PCR鉴定所得菌株;最终所得阳性单克隆测定生长曲线.结果 z1444单基因缺失突变株(Δz1444/933)及z0986-z1444双基因缺失突变株(Δz0986/Δz1444/933)构建成功,其生长曲线与野生型EHEC O157:H7差异均无统计学意义.结论 z0986与z1444基因缺失对EHEC的生长无影响.构建Δz1444/933及Δz0986/Δz1444/933为深入研究z1444基因的功能及作用机制奠定了基础.     

致病性大肠杆菌引发宿主细胞A/E损伤分析方法的建立

目的 建立一种能够对由致病性大肠杆菌引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤(A/E损伤)进行半定量分析的方法,为进一步研究其致病性提供评价手段.方法 以大肠杆菌黏附HeLa细胞作为感染模型.采用姬姆萨染色和荧光肌动蛋白染色实验,通过菌落计数及肌动蛋白聚集数量定量分析,统计学处理,比较EPEC 43095、EHEC 0157:H7 Sakai株和弱毒株EHEC 0157:H7 0013015以及E. coli DH5α对HeLa细胞的黏附能力,评价它们对细胞的损伤程度.结果 EPEC对细胞的黏附及擦拭性损伤程度大于EHEC(P<0.05).EHEC Sakai和00B015在黏附能力上差异不大(P>0.05),但是,Sakai在肌动蛋白聚集形成能力方面却明显强于00B015(P<0.05).结论 成功建立了一种能够对EPEC或EHEC所引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤进行半定量分析的方法.     

动物粪便中肠道出血性大肠杆菌PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速检测动物源性肠道出血性大肠杆菌的PCR方法。【方法】按照华大基因公布的检测肠道出血性大肠杆菌的方法,应用PCR的方法检测腹泻动物粪便中分离到的大肠杆菌Stx2-2基因和AFF-I-2基因。【结果】在分离到的45株大肠杆菌中,Stx2-2基因阳性菌株有7株,AFF-I-2基因阳性菌株有22株,其中2种基因阳性菌株有2株,其血清型分别为O142和O127:K63。【结论】成功建立了快速检测动物源性肠道出血性大肠杆菌的PCR方法。     

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。     

新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因

目的建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的人类mdr1基因的新型实时荧光定量PCR检测新方法。方法用Primer Express 2．0引物设计软件设计引物和MGB探针,以Taq Man-MGB探针技术为基础,运用Taq Man-MGB探针,以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1／A为阳性模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果所建立方法的最低检测限度为15个基因拷贝／反应,在待扩增DNA浓度为3．061×103 cps／ml-3．061×109cps／ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,决定系数r2为0．988243。结论应用Taq Man-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确性高等优点。     

实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的研究

目的建立一种鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析方法。方法根据6种致腹泻大肠埃希菌的8种特异性毒力基因设计8对引物,采用实时荧光多重聚合酶链反应后溶解曲线分析,根据曲线的峰值、高度、宽度、面积不同鉴别不同的致病菌。结果成功设计出8对引物,扩增出针对6种致腹泻大肠埃希菌的8种不同毒力基因,获得了特异性的溶解曲线。优化反应体系后在同一反应管中成功获得针对8种特异基因的溶解曲线,除肠侵袭性大肠杆菌、细胞致死膨胀性大肠杆菌具有相同的两种基因不能鉴别外,其中5种致腹泻性大肠埃希菌均可以明确鉴别。结论多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别致腹泻性大肠埃希菌是一种简单、特异、高效的方法,在腹泻病与食源性疾病的暴发调查和日常监测中具有广泛的应用价值。     

实时荧光定量PCR法分析苦参对大鼠胃肠道大肠杆菌数量的影响

目的:应用实时荧光定量PCR技术分析口服苦参对大鼠胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠部位以及粪便内大肠杆菌数量的影响,探索苦参对胃肠道中大肠杆菌菌群调节作用。方法:常规饲养大鼠150只,苦参水煎液分高、中、低剂量灌胃,另设空白对照组与抗生素组各10只。分别在第一、二、三周时采集大鼠胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠各段(含内容物)以及粪便,提取细菌基因组DNA,采用实时荧光定量PCR法(绝对定量方法)检测各样本不同给药时间点大肠杆菌的数量。结果:(1)与空白对照组相比较:各给药组十二指肠部位在第一、二、三周时,大肠杆菌数量显著降低(P0.01);在不同剂量组不同给药时间点,胃部、空肠、回肠部位以及粪便中大肠杆菌数量均有不同程度降低(P0.05)。(2)与抗生素组比较:低、中、高剂量组给药二周后,十二指肠、空肠、回肠部位大肠杆菌数量明显偏低(P0.05),而结肠及粪便部位在给药一周后高剂量组大肠杆菌数量明显偏高(P0.01)。结论:苦参水煎液灌胃可造成大鼠十二指肠、空肠、回肠部位大肠杆菌菌群数量降低,其中对十二指肠部位大肠杆菌数量的影响随时间推移呈递减趋势,与抗生素的作用基本一致。     

风疹病毒RNA Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法及参考标准的建立

目的建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。方法设计引物与探针,优化PCR条件,建立风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法,并制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。结果制备的风疹病毒特异性扩增子参考标准品为503 bp的片断,原液浓度为2.75×109copies/μl,纯度为92%;采用该特异性扩增子参考标准品建立的标准曲线相关系数r为-0.9993（r2=0.9986）,P〈0.001。结论本研究建立的风疹病毒特异性扩增子参考标准品稳定性好,纯度高;特异性扩增子参考标准品浓度的对数值与Ct值之间具有良好的线性关系,证实了本研究建立的风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。因而,建立的风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法简便快捷、定量准确,可用于临床标本中风疹病毒RNA的定量检测。