携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW.方法 Sac Ⅱ线性化pLentiEF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平Sac Ⅱ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.565 kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUOGW.获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FF细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNEI和6-10B以建立相应病毒感染体系.结果 酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B.结论 成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础.     

慢病毒介导的外源基因体外投递系统的建立

目的 针对不同哺乳类细胞建立相应的慢病毒体外感染体系,以建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统.方法 按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染)、超速离心浓缩和保存等,随后用病毒上清或浓缩后的病毒感染293FT细胞.24～48 h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产:将携带EGFP基因的病毒上清或浓缩后的病毒分别加入内含293FT细胞、小鼠ES细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)或小鼠睾丸生殖细胞的培养板孔内,感染6～12 h后.用相应培养基替换感染液,数天后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功感染不同哺乳类细胞.结果 按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒(病毒上清或浓缩后的病毒)成功高效率感染293FT细胞、MEFs或小鼠睾丸生殖细胞;用浓缩后的病毒(携带EGFP基因)感染小鼠ES细胞.亦可获得EGFP阳性的ES细胞克隆.结论 熟练掌握了慢病毒包装、浓缩及鉴定等技术.同时针对不同哺乳类细胞建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外传递系统,这些为相关后续研究打下了良好的基础.     

靶向树突状细胞的肿瘤疫苗OVA慢病毒载体构建及其体外抗肿瘤效应

目的构建靶向树突状细胞(dendritic cell,DC)的肿瘤疫苗pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体,并观察肿瘤抗原特异性DC激活T细胞对小鼠Lewis肺癌细胞(lewis lung carcinoma cell,LLC)的抗肿瘤效应,为肺癌的临床治疗提供实验依据。方法以分子克隆方法构建携带模拟肿瘤抗原鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的慢病毒表达载体,经XhoⅠ及XbaⅠ双酶切后电泳和DNA测序验证;应用脂质体法三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,转导LLC,进行单克隆化筛选培养后,经RT-PCR、Western blot检测所获得的OVA稳定表达细胞株中OVA的表达;分离纯化小鼠骨髓DC;用慢病毒感染DC;分离纯化小鼠脾T淋巴细胞;应用MLR和MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激T淋巴细胞对LLC的杀伤作用。结果 (1)构建的pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体经酶切后电泳和DNA测序,结果显示载体构建正确;(2)获得了纯化的小鼠骨髓来源的DC;(3)获得了携带肿瘤抗原OVA的LLC和DC;(4)负载肿瘤抗原的DC刺激T淋巴细胞能有效地杀伤负载相同肿瘤抗原的LLC。结论本研究成功地构建了携带肿瘤模拟抗原OVA的慢病毒表达载体pHR-CMV-EGFP-OVA,并成功地转导LLC与DC,获得了稳定表达OVA的肺癌细胞株和携带OVA的DC,基于肿瘤抗原靶向DC的抗肿瘤策略能有效地杀伤LLC,为靶向DC的肺癌免疫治疗提供了体外实验依据。     

携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW.方法 Xho Ⅰ线性化pLentiEF1a-SOx2-IRES-EGFP,回收片段并补平Xho Ⅰ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.356 kb片段而获连接用Sox2-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Sox2-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUSGW.获pFUSGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、人胚肺成纤维细胞(HLFs)和人神经胶质瘤细胞(U87)以建立相应病毒感染体系.结果 酶切证实成功构建了pFUSGW,按标准程序生产的携带SOx2和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染MEFs、HLFs及U87.结论 成功构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW,为相关后续的研究打下了良好的基础.     

携带人miR302和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人miR302和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pFUM3GW.方法 Nhe Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pmiR302ApE以释放miR302,接着补平酶切位点而获连接用miR302:BamH Ⅰ酶切携带EGFP的慢病毒载体pFUGW,接着补平酶切产物.并去磷酸化而获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用miR302连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR302测序.所构建载体命名为pFUM3GW.获pFUM3GW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR302和EGFP基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F以建立相应病毒感染体系.结果 PCR、酶切和测序证实成功构建了pFUM3GW,按标准程序生产的携带miR302和EGFP基冈的慢病毒上清高效率感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)及鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F.结论 成功构建携带人miR302和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUM3GW,为相关后续研究打下了良好基础.     

NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的 构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3(HCCLM3),观察其转染效率及表达情况.方法 采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(IRES)-EGFP中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLemi6.3-NK4-IRES-EGFP共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度.以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞,筛选最适MOI,以最适MOI重组慢病毒感染HCCLM3细胞,观察转染效率.Western blot法测定细胞中NK4蛋白表达水平.结果 成功构建共表达NK4基因和EGFP基因的慢病毒载体pLenti6.3 -NK4 -IRES-EGFP,并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108 TU/mL.重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI为7.转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达,而未转染细胞中无NK4蛋白的表达.结论 成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体,有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白.     

稳定过表达miR-26a肝癌细胞株的建立

目的建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株。方法以CTE049质粒为模板,PCR扩增miR．26a序列418bp,片段两侧添加XbaI和BamHI酶切位点,In．Fusion克隆至pHAGE．fullEFla．MCS．IZsGreen中,次日挑选单菌落,提取质粒并进行测序和酶切鉴定;所构建的载体命名为pLVT．miR26a。获得pLVT．miR26a后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR．26a和ZsGreen基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞（Hepl．6）、人肝癌细胞（BEL．7402、HepG2、Sk—Hep．1、HepG2．1uc）,以建立稳定过表达miR．26a的肝癌细胞系：qRT．PCR检测所建立肝癌细胞系中miR26a的表达水平。结果测序和酶切证实成功构建了pLVT．miR26a,按标准程序生产的携带miR．26a和ZsGreen基因的慢病毒上清成功感染小鼠及人肝癌细胞。结论成功建立稳定过表达miR．26a的肝癌细胞株,为相关后续研究打下了良好基础。     

小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体。方法通过体外合成小鼠全长Sema3A c DNA,采用Gateway技术将其基因插入到p Down-m Sema3A-IRES/EGFP质粒中,再交换重组获得重组质粒p LV/EXPNZ-puro-m Sema3A-IRES/EGFP,经过测序鉴定后,包装与浓缩慢病毒载体p LV(Exp)-Puro-CMV-m Sema3A-IRES/EGFP,最后重组慢病毒载体转染293T细胞获得病毒液。结果重组慢病毒载体11 538 bp,测序结果证实Sema3A基因共2 319 bp正确插入带有EGFP的载体中,成功构建小鼠Sema3A基因过表达载体。结论成功构建小鼠慢病毒载体p LV(Exp)-Puro-CMV-m Sema3A-IRES/EGFP,为该基因在特定细胞内过表达株的筛选奠定基础。     

借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞

目的借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEFs),以基于PEFs建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法取35d西藏小型猪胚胎,酶消化法分离培养西藏小型猪的PEFs;按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染),随后用病毒上清感染PEFs,24～48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产和成功感染PEFs。结果成功分离培养西藏小型猪的PEFs,按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒高效率感染西藏小型猪的PEFs。结论针对西藏小型猪的PEFs建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外投递系统,为相关后续研究打下了良好基础。     

携强绿色荧光蛋白重组慢病毒的构建及其在原代培养SD大鼠皮层神经细胞中的表达

目的：构建携带强绿色荧光蛋白的重组慢病毒（Lent/EGFP）,感染原代培养SD大鼠皮层神经细胞,观察其感染能力及报告基因的表达水平。方法：采用PCR方法克隆EGFP cDNA;将EGFP基因片段亚克隆到慢病毒穿梭质粒多克隆位点内;用4质粒共转染系统在293ET细胞中包装出携带EGFP基因的重组慢病毒Lent/EGFP;重组病毒感染NIH 3T3细胞,FACS检测重组病毒滴度;Lent/EGFP感染体外培养的原代SD大鼠皮层神经细胞,共聚焦荧光纤维镜观察原代神经细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。结果：基因测序证明克隆的EGFP cDNA与GenBank提供的序列完全一致;琼脂糖凝胶电泳结果证实EGFP正确插入pLenti6/V5TOPO;FACS检测病毒滴度为2×10⁶;在体外分离培养的原代SD大鼠皮层神经细胞中,重组病毒感染72 h后可见较强的绿色荧光蛋白表达。结论：采用改良的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组慢病毒载体;Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达。     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

小鼠动力蛋白激活蛋白1-shRNA慢病毒载体的构建及在足细胞中的敲低效应

目的 构建表达小鼠动力蛋白激活蛋白1 (dynactin-1)特异性shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠足细胞dynactin-1的敲低效果.方法 针对小鼠dynactin-1 mRNA序列,设计合成3种shRNA,克隆到入门质粒pENTR/pTER中,再利用LR反应重组到pLenti X2 Puro慢病毒目的质粒,经过酶切测序鉴定后,将慢病毒质粒和包装质粒共转染293FT细胞,包装得到病毒颗粒.各组shRNA病毒载体转染小鼠足细胞后,用嘌呤霉素抗性筛选细胞,利用蛋白质印迹法检测各组细胞中dynactin-1蛋白的表达水平.结果 构建的各组shRNA入门质粒和慢病毒载体经酶切及测序鉴定正确;慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,制备病毒颗粒,转染小鼠足细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达shRNA的足细胞系;蛋白质印迹检测结果表明转染dynactin-1-shRNA组的dynactin-1蛋白表达降低.结论 构建的小鼠dynactin-1-shRNA慢病毒载体能有效降低小鼠足细胞中dynactin-1蛋白表达,为进一步研究dynactin-1在足细胞中的功能奠定了基础.     

改建型STAT1-CC基因慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的:构建携带STAT1基因和突变型STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,转染肺癌A549细胞并检测STAT1和STAT1-CC基因在肺癌A549细胞内的表达.方法:采用PCR技术从质粒模板中扩增得到目的基因STAT1和STAT1-CC,将其接入含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体中,构建慢病毒载体表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,双酶切和测序鉴定.分别将重组子Lenti-STAT1、LentiSTAT1-CC和包装质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,感染非小细胞肺癌细胞株A549.荧光显微镜观察A549细胞EGFP表达,Western Blotting验证STAT1在A549细胞株中的表达.结果:酶切及测序结果显示成功构建重组慢病毒表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,将慢病毒颗粒感染A549细胞48 h后,观察到宿主细胞内EGFP表达,Western Blotting证实STAT1蛋白在A549细胞中过表达.结论:本实验成功构建了携带STAT1基因和STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,并在A549细胞中过表达STAT1基因.     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

IP-10重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的利用细菌内同源重组法构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的!-干扰素诱导蛋白10(IP-10)重组腺病毒载体并制备重组腺病毒。方法将IP-10编码序列克隆入带有EGFP示踪的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移载体pAdTrack-CMV/IP-10,将其在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd/IP-10;酶切鉴定正确后转染HEK293细胞。收集病毒上清,PCR鉴定正确后,扩增并再次感染HEK293细胞检测病毒感染能力。结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在HEK293细胞中包装成有感染活性的病毒颗粒。结论成功地构建了表达IP-10蛋白的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒Ad/IP-10,为研究IP-10的蛋白功能提供了一个重要工具。     

hSALL4基因逆转录病毒载体的构建及在小鼠髓系祖细胞中的表达

目的：构建含人SALL4B基因的逆转录病毒载体并证明其在小鼠髓系祖细胞中的表达。方法：①用PCR方法从质粒pcDNA3-hSALL4B扩增包括有全部编码序列的人SALIABcDNA,将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成含hSALL4的重组逆转录病毒载体;②将重组质粒在包装细胞系PT67中进行包装,用病毒上清感染32D细胞;③RT—PCR分析其mRNA表达;④Westernblotting分析其蛋白质的表达。结果：①限制型内切酶酶切,PCR及DNA测序均证实hSALIAB成功地克隆入pLXSN;②转染的32D细胞在mRNA水平及蛋白水平均有SALIAB表达。结论：成功地构建了含人SALIAB的逆转录病毒表达载体;且表达于32D细胞中,为研究SALIA基因过表达对造血功能的作用及其机制奠定了基础。     

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

BMP2-EGFP融合蛋白的构建及其生物活性

目的：构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并检测其表达的融合蛋白的生物活性。方法：用基因重组技术构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染COS-7细胞,用荧光显微镜检测和Western blotting分析其在COS-7细胞表达,细胞活性实验和动物体内异位成骨实验进一步检测融合蛋白的生物活性。结果：经酶切和PCR鉴定重组质粒BMP2/pLEGFP构建成功。转染COS-7细胞后,荧光显微镜和Western blotting检测均显示融合蛋白在细胞中表达;分泌的产物经细胞活性实验和动物体内异位成骨实验证实具有BMP2和EGFP的双重蛋白活性。结论：基因重组技术成功构建BMP2/pLEGFP重组体,重组体表达的融合蛋白具有GFP和BMP2的双重活性。