肺炎链球菌丝氨酸-苏氨酸激酶基因的原核表达及免疫血清的制备

目的制备抗肺炎链球菌(S.pn)丝氨酸-苏氨酸激酶(STKP)基因的特定区域的免疫血清,为疫苗研究奠定基础。方法 PCR扩增S.pn STKP蛋白C末端314个氨基酸区域的基因,将其克隆入pMD19-T载体,将鉴定正确的STKP基因从pMD19-T载体亚克隆至PET-32a(+)原核表达载体进行诱导表达;获得的可溶性蛋白经Ni2+柱纯化及Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗STKP血清,间接ELISA鉴定抗体效价,Western blot鉴定免疫血清特异性。结果成功将STKP基因特定序列克隆入PET-32a(+)原核表达载体并诱导表达,形式以可溶性表达为主,经Ni2+柱层析法纯化STKP,纯度达92%,免疫家兔制备出STKP免疫血清,间接ELISA检测抗体效价为1∶100 000,Western blot证实免疫血清能与目的蛋白特异结合。结论获得STKP重组蛋白及免疫血清,重组表达产物具有免疫原性,为S.pn多价联合蛋白疫苗研制奠定了基础。     

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:体外原核表达小鼠Foxp3蛋白,并以其免疫家兔,制备多克隆抗体。方法:从质粒Foxp3-pMD-18T扩增小鼠Foxp3全长基因,亚克隆至原核表达载体pET-32 a,转化E.coliBL-21;IPTG诱导表达目的蛋白,N i2 -NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白;纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹检测抗体特异性。结果:成功构建了Foxp3-pET-32 a原核表达载体,表达和纯化了目的蛋白;ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论:成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。     

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。     

重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的重组表达人细胞核输入蛋白α（Importin α）,制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段（1300bp）与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。     

胞嘧啶脱氨酶的原核表达和多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD)，制备鼠抗大肠杆菌CD多克隆抗体，方法：亚克隆CD基因到原核表达载体pMAL-c2和pBV222中，并转化入大肠杆菌DH5α内，诱导表达并纯化MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果：通过重组质粒的酶切筛选出重组阳性克隆，成功地表达和纯化出MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD成功制备了鼠抗CD多克隆抗体，并用6his-CD和GST-CD重组蛋白进行Western印迹分析，证实了抗体的正确性，结论：应用多克隆抗体可以检测体内外CD基因的表达，为临床前和临床上深入开展CD基因的生物治疗研究提供重要的实验材料。     

His标记小鼠SRG-S基因的克隆和表达纯化

目的构建His标记的小鼠精子发生相关基因SRG-S的原核表达载体并实现其表达及纯化。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆入pGEM-T-easy载体,经测序正确后,定向亚克隆入pET-30a( )表达载体,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,并利用抗His单克隆抗体进行Western blot检测。结果RT-PCR扩增得到大小约591 bp的目的基因片段,DNA序列分析结果与GenBank公布的序列一致,SDS-PAGE电泳显示经IPTG诱导有约32 kD的重组蛋白表达,纯化后的蛋白纯度达90%以上,且Western blot印迹表明该融合蛋白具有特异的抗His抗体特性。结论采用基因克隆技术成功构建了带His标签的小鼠SRG-S原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,有利于后期抗体的制备,为进一步从蛋白质水平研究该基因的功能奠定了基础。     

EBI3蛋白基因克隆、表达及其初步鉴定

目的 进一步研究EB病毒诱导基因3(EBI3)蛋白在病原生物感染宿主中的功能,探讨原核表达小鼠EBI3蛋白并初步鉴定.方法 收集日本血吸虫感染的C57/BL6小鼠脾细胞后提取总RNA,利用所合成引物经RT-PCR获得EBI3的cDNA,将该基因亚克隆入原核表达载体pET32a(+) ,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21株, 经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对包涵体进行变性、纯化和复性后获得可溶性的小鼠重组EBI3蛋白,用Western blot对其鉴定.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获取血清,经饱和硫酸铵法和DEAE-Sephadex A-50柱纯化得到抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,ELISA检测其免疫活性.结果 基因工程获得目的 蛋白变性复性成功后经Western blot鉴定证实为小鼠重组EBI3蛋白,免疫小鼠后取血清,分离纯化获得抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,ELISA结果表明该蛋白具有免疫原性.结论 成功地表达了小鼠重组EBI3蛋白,并制备了抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,为进一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能奠定了基础.     

德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的 构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体.方法 应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western.blot检测多抗的效价及特异性.结果 从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000 Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白.将纯化、复性的重组蛋白免疫 9,得到了滴度高于1:10<'6>的高效价多克隆抗体.Western-blot显示此多抗能与32000 Mr的重组蛋白特异结合.并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白.结论 利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性.制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具.     

细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉抗原重组蛋白的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因(myophilin)的重组质粒进行原核表达、纯化,并初步鉴定重组蛋白的免疫学特性,为重组疫苗研制的后续工作提供依据。方法对已构建的基因工程菌株myophilin/pGEM-T/JM109进行酶切,获取目的基因。将目的基因亚克隆于表达载体pET28a构建基因工程菌株,筛选阳性表达菌株并进行诱导表达、经SDS-PAGE鉴定重组myophilin蛋白。以纯化的myophilin做抗原免疫小鼠,用Western blot、ELISA对该蛋白的免疫原性及免疫鼠血清抗体水平进行检测。结果成功构建含原核重组表达载体myophilin/PET28a/BL21,并纯化出浓度较高的重组蛋白;ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了一定水平的血清抗体;实验组血清与对照组血清抗体含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论纯化后的重组蛋白myophilin具有较强的免疫原性,有望作为包虫病候选疫苗进一步研究。     

人类DLK1基因的克隆、表达、纯化及抗体制备

目的 构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础.方法 从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不合信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度.结果 成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体.结论 成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础.     

短穗鱼尾葵花粉泛过敏原profilin基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的克隆并表达短穗鱼尾葵花粉中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白（profilin）。方法利用RT-PCR结合RACE技术克隆短穗鱼尾葵花粉中泛变应原profilin的全长基因,并进行序列分析。然后设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR获得整个短穗鱼尾葵花粉profilin的开放阅读框,将其与pET28a载体连接并转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,通过Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用Western-blot检测其IgE结合活性。结果克隆获得了短穗鱼尾葵花粉profilin的全长基因,由608个碱基组成,开放阅读框为396个碱基（包括终止密码子）,编码131个氨基酸。该序列编码的蛋白为小分子量酸性蛋白,等电点为4.52,相对分子质量约为14200。此序列已被GenBank收录,登陆号为EF173600。重组短穗鱼尾葵花粉profilin在大肠杆菌中高效的表达,进一步经Ni2＋亲和层析柱纯化后经Western-blot检测具有良好的免疫学活性。结论成功地克隆和表达了短穗鱼尾葵花粉profilin,为短穗鱼尾葵花粉过敏的诊断和免疫治疗奠定了基础。     

十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1) 基因的克隆及原核表达

目的克隆十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因并在大肠杆菌中表达。方法运用3′RACE及RT-PCR技术分别扩增Ad-FAR-1 cDNA部分片段,获得序列经拼接后利用在线BLAST程序检索GenBank中相似的核酸序列及推导的氨基酸序列;设计引物,将Ad-FAR-1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆到Ad-FAR-1全长cDNA序列并构建了pET32a/Ad-FAR-1原核表达重组质粒,Ad-FAR-1融合蛋白在大肠中得到了高效表达。结论成功获得并表达了十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因,为进一步研究该蛋白的特性与功能奠定了基础。     

小鼠PGRP-L分子PGRP结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆小鼠长型肽聚糖识别蛋白（PGRP—L）的PGRP结构域基因并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术。从Balb／C小鼠肝组织总RNA中扩增PGRP—L的PGRP结构域基因片段,将其克隆人pUCm-T载体,以PCR、酶切和测序进行鉴定。以PCR从含PGRP结构域基因的重组质粒中扩增目的基因片段,插入表达质粒pQE-30构建重组表达质粒,转化大肠杆菌M15,诱导表达并纯化目的蛋白。结果RT—PCR扩增得到约500bp的基因片段,将其与pUCm-T载体连接构建成重组质粒prnPGRPd,其酶切图谱与计算机分析结果一致,该基因片段长518bp,序列与Genbank中相应基因序列相同。构建成重组表达载体pQE-PGRPd,在大肠杆菌M15中表达,表达产物主要存在于菌体裂解液上清中,为一相对分子质量约29000的可溶性蛋白。结论成功克隆并原核表达了小鼠PGRP—L分子PGRP结构域基因,为PGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

人canstatin基因的克隆、表达、纯化及其生物活性测定

目的:克隆人Canstatin cDNA,在E.coli中融合表达和纯化,并测定表达产物抑制新生血管生成活性.方法:从中国人胎盘组织提取总RNA,RT-PCR扩增出Canstatin cDNA,克隆入pTYB1载体中并测序,构建原核表达载体pTYB1-hCAN,IPTG诱导表达,几丁质亲和纯化,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验进行活性测定.结果:RT-PCR产物约为700bp,测序结果与文献报道序列一致.构建了人Canstatin原核表达载体vTYB1-hCAN,在大肠杆菌中表达.纯化的融合蛋白在CAM实验中能明显抑制血管生成.结论:克隆、表达了具有生物学活性的人canstatin蛋白.     

人心肌肌钙蛋白T亚型的克隆及表达

目的 构建人心肌肌钙蛋白T(cTnT)亚型的重组载体。 方法 应用RT-PCR技术,从人胚胎心肌组织中扩增cTnT1及cTnT2基因,连接到T Easy vector载体上,筛选重组子。结果 成功地扩增出cTnT1（764 bp）及cTnT2(124)基因片段,经测序证实,构建pExSecI-cTnT1表达载体并获得表达。结论 获得单一亚型的cTnT1及cTnT2基因片段,为研究心力衰竭时的胚胎型基因重构与发病关系提供了依据。     

卵巢癌肿瘤标记物HE4基因的分子克隆与蛋白表达

目的构建HE4基因及蛋白表达系统,用于卵巢癌的早期诊断。方法提取卵巢癌细胞H08910的总RNA,利用RT-PCR技术扩增HE4基因,然后将该片段进行T-A克隆并测序鉴定,纯化回收后亚克隆于原核表达载体PGEX-4T-1中,然后提取质粒,酶切鉴定,最后经IPTG诱导,原核表达重组子在TOP10宿主菌进行表达,并进行SDS-PAGE、WesternBlot分析与鉴定。结果应用RT-PCR技术,从卵巢癌HO8910的总RNA中扩增到一条大小约为400bp的片段,经T-A克隆与测序鉴定,证实此片段为HE4基因,将PGEX-4T-1重组子转化入宿主菌,用IPTG诱导菌体表达HE4重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定证实,在相对分子量约39000处可见明显的特异性的高表达条带。结论已成功克隆HE4基因,并经IPTG诱导在TOP10宿主菌中表达了相应的蛋白,为进一步制备卵巢癌的早期诊断试剂奠定基础。     

人黑色素瘤特异性抗原基因的克隆及其在原核系统中的表达

目的：克隆及表达人黑色素瘤特异性抗原(PRAME)基因的cDNA片段。方法：从人急性髓细胞白血病细胞系HL-60提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出PRAME基因cDNA片段。将PRAME基因cDNA片段插入载体pGEM-T-easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建高效表达克隆，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmoL／L异丙基-β—D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，PRAME蛋白表达即达高峰。结论：PRAME基因在极少数正常组织中低表达，而在白血病患者高表达，并编码被自体细胞毒T淋巴细胞识别的抗原，所以该基因有望成为肿瘤免疫治疗的新成员。     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

内置式佐剂LTB对空肠弯曲菌重组蛋白疫苗免疫增强作用的研究

目的 构建空肠弯曲菌(CJ)外膜蛋白(PEB1)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其免疫原性.方法 应用重组PCR技术将PEB1和LTB序列连接,构建PEB1-LTB融合基因,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS- PAGE电泳表达,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.肌注方式免疫小鼠,末次免疫2周后,测定小鼠血清中IgG、IgA及黏膜冲洗液中sIgA抗体水平.结果 PCR扩增分别获得约787、372 bp产物,二者融合后获得一约1180 bp目的基因；该重组蛋白可具有良好的免疫原性,肌注小鼠后其血清IgG、IgA及黏膜冲洗液中sIgA含量均显著增高(P ＜0.01).结论 构建PEB1-LTB融合蛋白可有效增强小鼠免疫应答水平.     

人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建

目的　利用噬菌体表面展示技术 ,构建人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .方法　从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总 RNA,反转录成 c DNA后 ,用PCR扩增人 Ig G1Fd段及κ轻链 ,并克隆至噬菌粒载体p COMB3中 ,转化宿主菌株 XL 1- Blue,以辅助噬菌体M13K0 7超感染噬菌粒文库 ,构建成人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .结果　得到一个含克隆数为 1.2× 10 6 ,实际滴度约为 2 .5 6× 10 1 5 pfu· L- 1的 Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库 .结论　Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建 ,为下一步利用亲和富集筛选技术 ,获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础