ID-LC-MS/MS候选参考方法测定血清载脂蛋白A-Ⅰ和B的优化

目的优化检测载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)和载脂蛋白B(apoB)的同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC-MS/MS)候选参考方法。方法选5个正常三酰甘油(TG)含量(TG≤2.3 mmol/L)的样品为校准品,2个高三酰甘油血症患者和1个正常三酰甘油患者的血清为待测样品。载脂蛋白经过变性、烷基化、胰蛋白酶酶解后,经LC-MS/MS进行分离和定量。对apoA-Ⅰ的特征肽AKPALEDLR、apoB的特征肽TGISPLALIK和TEVIPPLIENR进行母子离子对的优化。结果优化后与优化前的峰面积比范围在1.5至67.2之间。优化后,定性/定量离子对的比值的不精密度降低,最高降低3.1%(AKPALEDLR 338.2/403.2),最低降低0.6%(AKPALEDLR 338. 2/532. 4)。AKPALEDLR肽段和VQPYLDDFQK肽段定量apoA-Ⅰ结果一致;TEVIPPLIENR肽段和TGISPLALIK肽段定量apoB结果除HTG2外一致。结论选择合适的离子对可以显著提高载脂蛋白相应特征肽的峰面积,降低定性/定量离子对的比值的不精密度,使定量结果更准确。     

重组人胱抑素C及其多克隆抗体的制备

目的探讨重组人胱抑素C（Cys C）及其多克隆抗体的制备。方法根据大肠埃希菌编码蛋白的特性设计Cys C编码基因序列,人工合成目的基因,并将其在大肠埃希菌中表达,目的蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔;采用Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测兔血清重组人Cys C及其多克隆抗体。结果制备的重组人Cys C纯度达90%以上,抗重组人Cys C抗体具有很好的结合效价和特异性。结论制备的重组人Cys C及其抗体可用于进一步的实验研究和临床应用。     

同位素稀释气相色谱质谱法测定血清孕酮

目的建立一种血清孕酮测定候选参考方法。方法以[3，4-^13 C2]孕酮为内标，用正己烷提取血清，以羟丙基-β-环糊精水溶液对提取液作净化处理，用七氟丁酸酐对孕酮进行衍生化。用气相色谱分离衍生产物，质谱选择离子监测模式检测孕酮与内标的特定碎片离子，用包括法定量。结果血清孕酮测定的总变异系数为0．69％～2．12％，平均分析回收率为98．3％～100．1％。分析血清孕酮标准物质，测定结果与靶值的偏差小于1．5％。结论建立的同位素稀释气相色谱质谱测定血清孕酮的方法，准确、精密，可望作为测定血清孕酮的参考方法。     

糖尿病肾病患者血清AGEs和CysC水平检测对心力衰竭的预测价值分析

目的探讨糖尿病肾病患者血清晚期糖基化终产物(AGEs)和胱抑素C(Cys C)水平检测对心力衰竭的预测价值分析。方法回顾性分析笔者所在医院2012年10月~2015年12月确诊治疗的糖尿病肾病患者80例,依据是否发生心力衰竭分为心衰组(31例)和对照组(49例),采用乳胶增强免疫比浊法检测血清Cys C,采用双抗体酶联免疫吸附法(ABC-ELISA)检测血清AGEs,采用ROC曲线分析血清Cys C、AGEs水平对心力衰竭的预测价值,统计分析所有患者血清Cys C、AGEs和左心室射血分数(LVEF)水平。结果心衰组血清Cys C、AGEs水平明显高于对照组,前者LVEF水平明显低于后者,有显著差异性(P0.05);ROC曲线分析结果显示,Cys C以1.20mg/L,AGEs以0.84ng/ml作为临界值,在预测心力衰竭的敏感度、特异度、准确度方面,血清Cys CAGEs两者联合,有显著差异性(P0.05)。结论血清Cys C、AGEs水平变化与糖尿病肾病患者左心室功能变化及发生心力衰竭有关,联合检测二者水平在预测心力衰竭发生中具有良好的敏感性、特异性和准确性,值得临床作进一步推广。     

白念珠菌烯醇化酶N端肽段ENO1 319P的原核表达和鉴定

摘要：目的:制备白念珠菌烯醇化酶N端基因重组肽段ENO1-319P并检测其抗原性。 方法:选择与人烯醇化酶蛋白α-ENO同源性低的白念珠菌烯醇化酶肽段ENO1-319P,将其编码DNA序列克隆到表达载体pET28a(+),并在大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导带有His标签的重组肽段的表达。用SDS-PAGE电泳分析,TALON金属亲和层析柱纯化重组蛋白,其抗原性用侵袭性白念珠菌感染（ICAI）患者血清进行western blot评估。 结果:成功表达并纯化了目的肽段,该蛋白可与ICAI患者血清发生特异性反应。 结论:获得了白念珠菌烯醇化酶N端肽段ENO1-319P的基因表达工程菌株,为将此重组肽段用于制备特异性更高的抗体打下基础。     

气相色谱-质谱法测定毒鼠强的方法研究

[目的]为了发展毒鼠强的检测方法。[方法]样品经过前处理后，使用气相色谱-质谱（GC—MS）法进行测定。使用气相色谱-质谱（GC—MS）法进行毒鼠强的定性测定，并且从质谱的全扫描方式（50—400）和选择离子扫描方式（212、240）的比较来研究GC—MS上如何准确地进行定性和定量，如何提高灵敏度。[结果]毒鼠强保留时间10．62min，特征离子峰为240（分子离子峰）、212（脱N—CH2碎片离子峰）。毒鼠强在不同样品中的回收率分别为59．8％～91．2％。[结论]选择离子扫描方式去除了毒鼠强组分峰附近大部分的杂质峰，消除了试剂和样品中其他组分对毒鼠强检测的干扰，大大提高了灵敏度，非常适合于定量分析。     

液相色谱串联质谱法检测血清载脂蛋白C的酶解效率

目的分析液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)检测载脂蛋白(apo) C-Ⅰ、C-Ⅱ和C-Ⅲ的酶解效率,为其准确定量检测提供依据。方法对不同apo C含量的混合人血清样品进行变性、还原、烷基化等前处理,经胰蛋白酶酶解,用LC-MS/MS定量检测目标肽段;分析多肽释放图谱和样品间多肽释放的相关性。结果肽段TP(apo C-Ⅰ)、TY(apo C-Ⅱ)和GW(apo C-Ⅲ)的响应值较高。酶解1 h时,肽段ES和DA即达释放峰值; 3 h时,TY释放最充分;而TP、GW和EF的释放速率相对较慢,在8 h达最高值。TP、TY和GW达峰值后,峰面积随酶解时间延长而逐步下降。apo C-Ⅰ释放出的2条肽段EF和TP在5份样品之间一致,相关系数(r)=0.993 9(3 h)和0.992 9(20 h); apo C-Ⅱ(ES和TY肽段)和apo C-Ⅲ(DA和GW肽段)的r值介于0.976 1～0.997 3。结论 apo C-Ⅰ、apo C-Ⅱ和apo C-Ⅲ肽段的酶解效率受肽段自身特性和酶解环境影响,合适地选择代表性肽段和酶解条件将有助于其准确定量检测。     

胱抑素C在早期肾功能损伤的诊断价值

目的对胱抑素C（Cys C）在临床诊断早期肾功能损伤中的价值进行探讨。方法回顾分析该院2011年6月至2013年6月收治的140例慢性肾功能衰竭患者。采用免疫比浊法对其血清中的Cys C、尿β2-微球蛋白和血清肌酐水平进行检测,并与140例健康者的各项指标进行对比分析。结果 2组研究对象的性别、年龄差异无统计学意义（P〉0.05）;肾功能损伤患者血清中Cys C、尿β2-微球蛋白和血清肌酐水平都显著低于健康者,差异有统计学意义（P〈0.05）;而Cys C水平在患者中的特异性以及灵敏度显著大于尿β2-微球蛋白和血清肌酐,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论患者血清中Cys C水平具有很好的特异性以及灵敏度,能够及时、准确地对患者的肾功能损伤进行评估,对早期肾功能损害的诊断具有临床价值。     

基于血清肽谱的乳腺癌诊断模型的初步建立

目的为了提高乳腺癌诊断的准确率,建立新的血清学诊断平台。方法收集50例乳腺癌患者和50例健康对照者的血清标本,随机抽取一部分作为训练集,用于构建诊断模型;其余作为验证集,用于验证模型的诊断能力。使用弱阳离子磁珠分离血清多肽,MALDI-TOF MS进行质谱检测。结果通过对训练集27例乳腺癌患者和30例健康对照者的血清标本进行质谱分析,建立了一个八肽诊断模型,然后用验证集23例乳腺癌和20例健康对照者的血清标本进行检验,得到该模型的灵敏度为95.7%,特异度为95.0%。并应用生物信息学方法预测出模型中的4个肽片段分别来自间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、纤维蛋白原α链亚型1前体和核磷蛋白亚型2。结论初步建立了一个基于血清肽质谱分析方法的用于诊断乳腺癌的八肽模型,具有高度灵敏度和特异度。     

血清胱抑素C、超敏C反应蛋白联合检测在2型糖尿病早期肾损害诊断中的价值

目的探讨血清胱抑素C(Cys C)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平的变化与2型糖尿病(T2DM)早期肾损害发生趋势的关系,以及二者联合检测对糖尿病肾病的早期诊断价值。方法用全自动生化分析仪分别检测T2DM肾功能正常组67例、T2DM肾功能异常组53例患者及50例健康体检者(健康对照组)血清Cys C、hs-CRP及尿微量清蛋白(mALB)水平,并对结果进行统计学处理。结果各项指标在T2DM各组中与健康对照组比较差异均有统计学意义(P0.05或P0.01),T2DM肾功能正常组与肾功能异常组之间比较差异亦有统计学意义(P0.01)。联合检测阳性率明显高于单项检测(P0.01)。在T2DM患者中,血清Cys C和hs-CRP分别与尿mALB呈正相关(r分别为0.421及0.443,P0.05)。结论血清Cys C、hs-CRP联合检测有助于及时、准确地诊断T2DM的早期肾损害。