乳腺癌患者外周血干细胞诱导为树突细胞的实验研究

目的乳腺癌患者经动员后采集外周血干细胞,通过体外培养的方法诱导为成熟树突细胞。方法乳腺癌患者注射G-CSF进行干细胞动员3天,血细胞分离机采集外周血干细胞悬液,用Ficoll分离,收集单个核细胞,RP-MI-1640培养基重悬静置30min,贴壁细胞用含GM-CSF 1 000U/ml、IL-4 500U/ml、10%FBS的RPMI-1640培养基继续培养,第4天2/3量换液,补足GM-CSF、IL-4,并加入TNF-α500U/ml,第7天换液,补足细胞因子。结果培养至第9天,收集培养的1-2×105个树突细胞经流式细胞仪检测表达CD83＋（47.8±6.2）%,CD86＋（83.2±10.1）%,HLA-DR（75.9±7.9）%,CD1a（60.3±6.8）%。结论动员后的乳腺癌患者外周血干细胞经GM-CSF、IL-4及TNF-α联合培养能诱导出成熟树突细胞,为乳腺癌的免疫治疗提供了临床应用基础。     

双歧杆菌对过敏性哮喘儿童DC成熟及其分泌细胞因子的影响

目的研究青春型双歧杆菌对过敏性哮喘儿童外周血单个核细胞（PBMC）来源的树突状细胞（DC）表达CD86和HLA-DR及其分泌IL-1βI、L-6I、L-10、IL-12、IL-23和IFN-γ的影响。方法从15名过敏性哮喘儿童和15名非哮喘儿童的外周血单个核细胞诱导生成未成熟DC,分别加入青春型双歧杆菌或脂多糖（LPS）后继续培养DC 2天,①每天于倒置显微镜下观察DC形态;②用流式细胞仪检测各组DC表面CD86和HLA-DR的分子表达;③用ELISA方法检测培养上清中IL-1βI、L-6I、L-10、IL-12I、L-23和IFN-γ的水平。结果①DC经双歧杆菌和LPS分组处理后第2天,于倒置显微镜下观察到双歧杆菌组和LPS组的DC突起均较空白组明显,具有突起的细胞数量较空白组增多,而双歧杆菌组与LPS组比较,LPS组有突起的细胞数量明显增多,提示DC过度生长。②双歧杆菌刺激后,哮喘儿童DC表面CD86表达明显增高,HLA-DR表达无明显变化,非哮喘儿童CD86和HLA-DR表达均无明显变化;LPS刺激可明显增加哮喘儿童和非哮喘儿童CD86和HLA-DR的表达。③双歧杆菌刺激哮喘儿童DC分泌IL-12、IFN-γI、L-1β及IL-6水平增高,刺激非哮喘儿童DC分泌IL-12I、L-10I、L-1β及IL-23水平增高。结论①过敏性哮喘儿童DC表面CD86的表达可能存在缺陷,双歧杆菌能适度上调其表达,在DC的成熟过程中可能起调节作用。②双歧杆菌能刺激过敏性哮喘儿童DC分泌IL-12和IFN-γ,从而改变Th2优势分化,纠正Th1/Th2失衡。③过敏性哮喘儿童DC分泌IL-10可能存在缺陷,从而影响免疫耐受的形成。④双歧杆菌可能通过刺激哮喘儿童DC分泌IL-1β及IL-6增高,达到促进Th17细胞分化的作用。     

两步法扩增诱导脐血及动员外周血CD34+细胞来源树突状细胞的比较

为了比较先扩增、后诱导的两步法从脐血(CB)CD34+细胞和动员外周血(MPB)CD34+细胞诱导所得DC的产量及功能,将免疫磁珠分选获得的CB-CD34+细胞和MPB-CD34+细胞用FL、TPO、SCF、GM-CSF等细胞因子先扩增10天,然后加入GM-CSF、IL-4及TNF-α、CD40Ab、PGE2等细胞因子组合诱导获得DC.采用流式细胞仪检测DC表型,混合淋巴细胞培养检测DC刺激异基因T细胞增殖能力,ELISA法检测DC分泌IL-12能力,Transwell板检测DC在次级淋巴组织趋化因子(SLC)介导下的趋化功能.结果表明 ①扩增10天时CB组、MPB组细胞中CD14+CD1a-细胞含量无显著差异[(40.48±16.85)% vs (28.07±23.19)%, P＞0.05].但由于CB组细胞扩增倍数显著高于MPB组(388.88±84.63倍vs 79.67±10.32倍, P＜0.01),CB组CD14+CD1a-细胞扩增倍数显著高于MPB组(189.42±25.02倍vs 28.74±23.27倍, P＜0.01); ②TNF-α/CD40Ab/PGE2条件下与TNF-α条件下相比,CB组和MPB组所得DC均表达更高的CD83[分别为(34.52±11.22)% vs (3.70±2.27)%、(36.69±13.36)% vs (7.34±3.364)%, P均＜0.01]; ③CB组与MPB组在TNF-α/CD40Ab/PGE2诱导条件下所得DC均高水平表达CD83、CD86、HLA-DR、CD11c、CD54、CD40,CB组所得CD83+细胞的扩增倍数显著高于MPB组(198.72±117.53倍vs 33.95±6.19倍,P＜0.01); ④CD40Ab/PGE2/TNF-α条件下CB与MPB来源的DC在刺激异基因T细胞增殖、IL-12的分泌[(16.2±4.31)pg/ml vs (13.5±4.1)pg/ml]以及SLC介导的迁移率[(28.09±7.76)% vs (18.5±3.47)%]上均无显著差别(P均＞0.05).结论 在两步法培养体系下,CB-CD34+细胞与MPB-CD34+细胞来源的DC具有相同的功能,而前者产量显著高于后者.     

外周血树突状细胞的制备和表型分析

目的：探讨体外分离人外周血单个核细胞（PBMC）和诱导生成树突状细胞（dendriticcell,DC）。方法：从外周血分离PBMC,加入细胞因子诱导DC,流式细胞仪测定CD86和HLA-DR,分析其成熟度和激活度。结果：HLA—DR和CD86在PBMC中几乎无表达,经GM-CSF和IL-4诱导后低表达;加入TNF-α后高表达。结论：GM-CSF和IL-4诱导培养PBMC,可获得大量不成熟DC,加入TNF-α后,DC成熟度高,激活性好。     

嗅鞘细胞诱导树突状细胞成熟的作用研究

目的体外研究嗅鞘细胞(OEC)调节树突状细胞(DC)成熟的作用。方法从流产人胚胎和健康志愿者外周血浓缩白细胞中分别培养OEC和DC。使用DMEM/F-12(5%FBS)培养基,在24孔板中进行10~3OEC、10~3OEC+10~5DC共培养、10~3OEC/10~5DC分室培养、10~5DC或者10~5DC+1μg/mL LPS。在37℃,5%CO_2条件下孵育,48 h后,分别收集培养上清液和DC,用ELISA试剂检测上清中的TNF-α和IL-12p40的含量,流式细胞仪检测DC成熟的表面标志物CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达水平。结果经过10~(-5)mol/L的阿糖胞苷筛选培养12 d,NGFRp75免疫荧光检测表明OEC纯度达到90%以上,RT-PCR检测OEC表达NGF、BDNF、GDNF。OEC作用于DC能够增强DC分泌TNF-α和IL-12p40的表达,DC成熟表面标志物CD40、CD80、CD86和HLA-DR表达增加;同时,细胞因子和成熟表面标志物在分室培养中表达量增加更为显著。结论 OEC体外可诱导DC的成熟,且这种作用为非细胞接触的作用而是OEC通过分泌的可溶性分子作用结果。     

TNF-α促进树突状细胞分化成熟的实验研究

本研究探讨不同浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人外周血单个核细胞来源树突状细胞(MNC-derived den-dritic cells,MNCDC)分化成熟的影响。采集正常健康成人外周血30 ml,以Thomas法分离外周血单个核细胞(PBMNC),用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)于体外联合诱导培养8天,并于培养第5天加入不同浓度的rhTNF-α共同培养;用流式细胞术检测DC膜表面的HLA-DR、CD83和CD1a表达,用MTT法检测DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果表明,不同浓度的TNF-α能不同程度地刺激DC表达HLA-DR、CD83和CD1a,增强DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结论:TNF-α能够显著增强外周血单个核细胞来源DC的分化和成熟,不同浓度TNF-α能不同程度地刺激MNCDC功能成熟,TNF-α浓度为20ng/ml时刺激DC分化成熟的作用最强。     

微小RNA-4804对人单核细胞株THP-1细胞增殖与分泌细胞因子的影响研究

目的探讨miRNA-4804对人单核细胞增殖和分泌细胞因子功能的影响。方法实时定量PCR检测人单核细胞株THP-1中miRNA-4804和细胞因子m RNA的表达,流式细胞仪与CCK8检测miRNA-4804对THP-1细胞增殖的影响,酶联免疫吸附测定THP-1细胞培养上清中细胞因子的表达。结果与对照组比较,加入miRNA-4804模拟剂,IFN-γ诱导的THP-1细胞增殖、HLA-DR、CD86分子的表达明显受到抑制,CD80表达无明显变化;而加入miRNA-4804抑制剂,THP-1细胞的增殖,HLA-DR、CD86分子的表达明显增加,CD80表达也明显增加。IFN-γ刺激后,THP-1细胞和培养上清中IL-6、TNF-α和IL-12的表达明显增强,IL-10的表达明显下降;miRNA-4804模拟剂处理后,能拮抗IFN-γ诱导THP-1细胞表达IL-6、TNF-α和IL-12的作用,且促进THP-1细胞表达IL-10。反之,miRNA-4804抑制剂处理后,能促进IFN-γ诱导THP-1细胞表达IL-6、TNF-α和IL-12的作用,而抑制THP-1细胞表达IL-10,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 miRNA-4804能够影响单核细胞的增殖和分泌细胞因子的功能,可能在慢性乙型肝炎免疫稳态机制中发挥作用。     

干扰素α对慢性髓系白血病来源树突状细胞表达Th细胞因子和CCR7的影响

本研究探讨干扰素α（IFN-α）对慢性髓系白血病（CML）来源树突状细胞（DC）表达趋化因子CCR7及分泌IL-10、IL-12P70的影响。在诱导CML-DCs的无血清条件培养基中，除加入SCF、GM-CSF、TNF-α及IL-4外．还加入不同浓度IFN-α。培养10—14天后，用流式细胞术检测共刺激分子及CCR7表达。G显带法显示Ph1染色体，噻唑蓝（MTT）法检测CML-DC刺激正常人外周血淋巴细胞增殖状况，ELISA法检测培养上清IL-10及IL-12P70含量。结果显示：IFN-α（300U／ml）组与无IFN-α组比较其CML—DC的CD40、CD83、CD86及CCR7的表达均升高1倍，异体混合淋巴细胞反应（MLR）中OD值增加1倍，Ph1染色体阳性比例及IL-10和IL-12P70浓度均减低。结论：IFN-α能够部分纠正CML-DC免疫表型及功能缺陷，这同其上调DC共刺激分子和CCR7表达及解除了CML血清中IL-10对CML—DC分化的抑制有关。     

CpG ODN1826刺激人外周血树突状细胞对胃癌细胞杀伤效应的研究

目的探讨CpGODN1826在体外增强树突状细胞（dendriticcells,DC）抗胃癌作用的影响。方法分离正常人外周血DC,用GM-CSF和IL-4培养至第5天分组：GM-CSF＋IL-4组、GM-CSF＋IL-4＋TNF-α组、GM-CSF＋IL-4＋LPS组和GM-CSF＋IL-4＋CpGODN组。自外周血单个核细胞（PBMC）诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,MTT法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖的影响,检测其活性及对胃癌细胞的杀伤效应,ELISA检测各组分泌IL-12情况。结果体外培养第10天,CpGODN组出现大量典型的DC形态;流式细胞仪检测CpGODN组显著高表达CD40、CD1a、CD80、CD86、MHC-Ⅱ和分泌IL-12;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞的增殖,显著增强DC杀伤MKN-45细胞的活性。结论 CpGODN可显著地诱导人外周血DC分化成熟,增强DC对胃癌细胞的杀伤作用。     

树突状细胞及相关细胞因子在多囊卵巢综合征患者卵泡液的表达及其临床意义

目的研究树突状细胞及其细胞因子在多囊卵巢综合征患者在卵泡液中的表达及其临床意义。方法收集多囊卵巢综合征患者取卵日卵泡标本30例,以因男方因素行体外受精-胚胎移植30例患者作为对照组;应用流式细胞术检测树突状细胞的分布,酶联免疫吸附试验检测细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-23等表达水平,并分析HLA-DR平均荧光强度、TNF-α浓度与血雌二醇水平的关系。结果与对照组标本(21.27%±5.5%)相比,多囊卵巢综合征患者CD11c+HLA-DR+DC细胞显著减少(16.22%±5.5%);hCG日血雌二醇水平与DC活化标志HLA-DR平均荧光强度呈正相关(r=0.75,P<0.01),与卵泡液中TNF-α浓度水平呈负相关(r=-0.69,P<0.01)。与正常对照组相比,PCOS患者卵泡液TNF-α、IL-6和IL-10的浓度显著增多,而致炎性细胞因子IL-23浓度显著降低。结论 PCOS患者卵泡微环境呈现免疫抑制状态,与卵泡发育障碍可能具有相关性。     

多发性骨髓瘤间充质干细胞对树突状细胞功能的影响

目的探讨多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓来源的间充质干细胞（MSC）对树突状细胞（DC）分化、成熟和细胞因子分泌及其对DC辅助T细胞杀伤骨髓瘤细胞作用的影响。方法将从MM患者骨髓来源的MSC、正常供者外周血来源的DC及骨髓瘤细胞系U266细胞进行混合培养。流式细胞术测定DC的免疫表型,ELISA法测定上清液IL-12的含量,AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术测定骨髓瘤细胞凋亡比例。结果MSC能抑制rhTNF-α诱导的不成熟和成熟DC的CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR表达（P〈0.01）,并显著减少成熟DC分泌IL-12（P〈0.01）。MSC可以下调成熟DC的CD83表达,使其趋于不成熟状态（P〈0.01）。与未加入MSC组相比,MSC混合培养组凋亡骨髓瘤细胞明显减少（P〈0.01）;比较MM患者与正常供者骨髓来源的MSC对DC辅助T细胞诱导骨髓瘤细胞凋亡的影响,前者U266细胞凋亡比例比后者明显减少（P〈0.01）。结论MM患者骨髓来源的MSC可以抑制DC的分化、成熟和分泌细胞因子;无论是MM患者或正常供者骨髓来源MSC均可以抑制DC辅助T细胞对骨髓瘤细胞的凋亡诱导作用,且MM患者来源的MSC的作用更强。     

白介素21对树突状细胞诱导的CTL抗白血病作用的影响

本研究探讨白介素21（IL-21）对树突状细胞（DC）诱导的CTL抗白血病的体外作用。以不同细胞因子诱导培养急性白血病（AL）患者缓解期外周血单个核细胞产生DC，自体AL细胞RNA作为抗原负载DC，与自体T淋巴细胞共培养诱导白血病特异性CTL产生；用LDH释放法检测CTL杀伤自体AL细胞的作用，并检测CTL产生IFN-γ和TNF-α的变化。实验共分2组：实验组，在DC—CTL共培养过程中加用IL-21（200ng／ml）；对照组，不加IL-21。同时对IL-21单独作用培养后成熟DC，检测其表面抗原表达变化以及诱导同种混合淋巴细胞反应能力。结果表明：对照组和实验组的CTL产生率分别为：（56．73±10．21）％，（73．43±18．01）％（P〈0．01）；培养上清中IFN-γ和TNF-α分别为：（154．91±67．20）ng／L，（310．62±141．15）ng／L（p〈0．01）和（8．77±5．09）μg/L，（15．25±6．56）μg／L（p〈0．01）。在效靶比为20：1时，两组对自体AL细胞的杀伤作用分别为（50．22±5．07）％，（75．38±9．47）％（P〈0．01）；IL-21作用后的成熟DC的CD1a、CD83、CD86、CD80和HLA—DR表达没有明显变化；诱导同种混合淋巴细胞反应能力亦没有明显不同。结论：IL-21可促进DC诱导的CTL增殖、增加IFN--γ和TNF—α产生从而增强其抗白血病作用；IL-21对成熟DC表面抗原表达及其免疫功能无明显影响；提示IL-21在白血病免疫治疗中发挥一定的作用，具有潜在的临床应用价值。     

肿瘤坏死因子α和白细胞介素4对脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞体外培养体系的影响

背景：造血干细胞是构筑免疫系统的最早的细胞，能分化为多种细胞，其中具有包括免疫应答调控树突状细胞。树突状细胞的诱导培养因前体细胞来源不同，所采用的细胞因子，及最佳的细胞因子配伍、应用顺序、实验室培养条件亦不相同，树突状细胞的发育、各种表型的表达及成熟度也不尽相同。目的：观察肿瘤坏死因子α和白细胞介素4对脐血CD34＋造血干细胞来源的树突状细胞诱导培养体系的影响，探寻该培养体系优化方法。设计、时间及地点：观察性实验，于2005—03／11在南京医科大学微生物与免疫学实验室完成。材料：健康新生儿脐血为南京市八一医院产妇同意捐赠。CD34单克隆抗体-磁珠分离系统为德国MiltenyiBiotec公司产品；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）、重组人白细胞介素4和重组人肿瘤坏死因子α为美国PeproTech公司产品。方法：淋巴细胞分离液分离获得脐血单个核细胞，免疫磁珠阳性分选CD34＋造血干细胞，并用流式细胞术鉴定CD34＋造血干细胞纯度；比较GT（GM-CSF＋肿瘤坏死因子α）方案和GTI（GM-CSF＋肿瘤坏死因子α＋白细胞介素4）方案及GTI方案中肿瘤坏死因子α和白细胞介素4不同时段加入对诱导培养产生的树突状细胞成熟的影响；通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析细胞表型及3H-TdR检测树突状细胞激发异体T细胞增殖能力。结果：免疫磁珠阳性分选CD34＋造血干细胞纯度可达90％以上。将CD34＋造血干细胞按GT方案和GTI方案进行培养，均可诱导产生树突状细胞，CD34的阳性表达率逐渐下降，HLA-DR的表达下降（P〈0．05），树突状细胞的相关分化抗原CD80，CD86，CD83和CDla的表达均相应增加，培养13～15d的细胞各表型表达较7-9d，10～12d充分。但经GT方案诱导的树突状细胞CD14表达较高，CD80，CD86，CD83，CD1α表达不如经GTI方案诱导的高；而GTI方案中，以肿瘤坏死因子Q0h、白细胞介素448h加入诱导培养的树突状细胞各表型表达相对较佳，其细胞表达CD80，CD86均较其他组高，尤以CD86表达为著，并具有激发异体T细胞增殖能力。结论：CD34＋造血干细胞经过合适的培养体系能够诱导分化为功能性树突状细胞，以GM-CSF与肿瘤坏死因子α0h加入、白细胞介素448h加入的GM-CSF＋肿瘤坏死因子α＋白细胞介素4方案更为可取。     

小鼠髓系树突状细胞的体外扩增和超微结构

背景:树突状细胞可激发初始型T细胞,是目前所知机体功能最强的专职抗原递呈细胞,但对其超微结构的研究鲜见报道.目的:观察小鼠髓系树突状细胞不同发育阶段以及CD40配基化和肿瘤坏死因子α刺激后树突状细胞的超微结构特征.方法:无菌取小鼠骨髓前体细胞,采用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4联合方案体外诱导获得未成熟树突状细胞,负载早期凋亡的肿瘤细胞后采用小鼠CD40L转基因CHO细胞和肿瘤坏死因子α刺激48 h,按常规方法制备超薄切片,透射电镜观察树突状细胞的超微结构特征.结果与结论:前体细胞及未成熟树突状细胞内有清晰可见的吞饮泡,未成熟树突状细胞的胞质内可见"C"形和环形溶酶体;凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞可见凋亡小体被吞噬或包裹的现象,小鼠CD40L转基因CHO细胞和肿瘤坏死因子α均可促进树突状细胞成熟,但肿瘤坏死因子α作用后,部分树突状细胞有自噬和凋亡改变.结果提示,小鼠骨髓来源树突状细胞在不同分化发育阶段有其特殊的超微结构表现,肿瘤坏死因子α可介导树突状细胞发生自噬和凋亡.     

米非司酮对人外周血来源树突状细胞成熟和功能的影响

目的观察米非司酮对人外周血来源树突状细胞(DCs)成熟及生物学功能的影响,探讨米非司酮作为紧急避孕药的免疫学机制。方法人外周血CD14+单核细胞在体外经GM-CSF、IL-4培养6d诱导分化为未成熟DCs,加入1800 nmol/L米非司酮继续培养48h,流式细胞仪检测细胞表型,ELSIA检测DCs培养上清液中IL-12p70水平,混合淋巴细胞反应检测DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果与阴性对照组相比,米非司酮处理后的DCs,其细胞表面HLA-DR及CD83分子表达上调(t分别=15.23、7.63,P均<0.05),IL-12p70分泌增加(t=12.62,P<0.05),且刺激同种异体T细胞增殖的能力明显增强,差异均有统计学意义(t分别=9.12、13.24、6.78,P均<0.05)。结论米非司酮能诱导人外周血来源DCs成熟,促进DCs诱导的免疫应答启动。     

Expression of the adhesion molecules CD49d and CD49e on G-CSF-mobilized CD34+ cells of patients with solid tumors or non-Hodgkin's and Hodgkin's lymphoma and of healthy donors is inversely correlated with the amount of mobilized CD34+ cells

The yield of CD34+ PBPC and colony-forming units-granulocyte-macrophage (CFU-GM) in leukapheresis products and the expression of the adhesion molecules CD11a, CD31, CD49d, CD49e, CD54, CD58, CD62L, c-kit (CD117), Thy-1 (CD90), CD33, CD38, and HLA-DR on CD34+ PBPC were analyzed in patients with cancer of the testis (n = 10), breast cancer (n = 10), Hodgkin's disease (n = 20), high-grade (n = 20) and low-grade (n = 20) non-Hodgkin's lymphoma, and healthy donors (n = 20) undergoing G-CSF (filgrastim)-stimulated PBPC mobilization. For each disease entity, G-CSF was administered in two different doses, 10 microg G-CSF/kg body weight (BW)/day s.c. vs. 24 microg G-CSF/kg BW s.c./day in steady-state condition. Data were compared for each dose group separately. Patients with cancer of the testis and breast cancer mobilized significantly more CD34+ cells than patients with high-grade and low-grade non-Hodgkin's lymphoma and Hodgkin's disease (p<0.05). Correspondingly, expression of CD49d on CD34+ PBPC was significantly lower in the same patients with cancer of the testis compared with high-grade and low-grade non-Hodgkin's lymphoma and Hodgkins' disease and in patients with breast cancer compared with high-grade and low-grade non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkins's disease, and healthy donors. Similar results were obtained for CD49e. These data suggest that the expression of the adhesion molecules CD49d and CD49e on G-CSF-mobilized CD34+ cells of patients with solid tumors, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's disease, and healthy donors is inversely correlated with the amount of mobilized CD34+ cells.     

高迁移率族蛋白B1对大鼠脾脏树突状细胞细胞因子表达的影响

目的 观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对树突状细胞(dendritic cells,DC)细胞因子蛋白合成和基因表达的影响.方法 分离正常Wistar大鼠脾脏DC后置于96孔培养板(1×105/孔),给予重组HMGB1刺激,研究HMGB1刺激与TNF-α,IL-12蛋白合成和基因表达的时间-效应关系,24孔细胞随机分为6组:正常对照24 h组(4孔/组)、正常对照48 h组(4孔/组)、正常对照72 h组(4孔/组)、HMGB1 24 h组(4孔/组)、HMGB1 48 h组(4孔/组)和HMGB1 72 h组(4孔/组),后3组分别以1 μg/mLHMGB1 刺激.刺激相应时间检测TNF-α,IL-12 mRNA的表达和蛋白水平.研究HMGB1刺激与TNF-α,IL-12蛋白合成和基因表达的剂量-效应关系,16孔细胞随机分为4组:正常对照组(4孔/组)、0.1μg/mL组(4孔/组)、1 μg/mL组(4孔/组)和10 μg/mL组(4孔/组),分别以相应剂量HMGB1刺激.刺激后48 h后检测TNF-α、IL-12 mRNA的表达和蛋白水平.应用Promega公司mRNA提取试剂盒裂解收集的DC,提取细胞mRNA.采用SYBR Green real-time(实时荧光定量)PCR技术检测TNF-α mRNA,IL-12mRNA表达水平.以三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)作为内参对照.扩增产物经Fast 7500 real-time PCR仪处理,作相对定量(RQ)分析.以ELISA试剂盒检测各组上清中IL-12,TNF-α蛋白水平.数据进行单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 1 μg/mL HMGB1 刺激后,脾脏DC IL-12,TNF-α蛋白合成和基因表达均分别于24～72 h明显上调(P<0.05或P<0.01),其中以作用48 h后其表达上调尤为显著(P<0.01);0.1/.μg/mL,1 tcVmL,10μg/mL HMGB1刺激48 h均可诱导DC IL-12、TNF-α蛋白合成和基因表达增强(P<0.01),其中HMGB1浓度在1 μg/mL时,DC IL-12和TNF-α蛋白合成和基因表达表达最明显(P<0.01).结论 HMGB1诱导DC成熟分化过程中能促进DC合成、释放IL-12和TNF-α,从而发挥其免疫调节作用.     

树突状细胞CD80和CD86表达及胞外白细胞介素12分泌与不同剂量青藤碱干预的影响

背景:青藤碱是从抗风湿中药青风藤中分离提取的单体生物碱,具有抗炎、镇痛、免疫抑制等药理作用,该药用于治疗类风湿性关节炎等风湿性疾病具有较明确的疗效,在临床上得到了广泛的应用。树突状细胞是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞。目的:观察不同剂量青藤碱对树突状细胞CD80和CD86表达及胞外白细胞介素12分泌的影响。设计:重复测量实验。单位:广东医学院药理教研室。材料:实验于2004-09/2005-05在解放军第三军医大学全军免疫学研究所完成。健康志愿者外周血由西南医院血库提供。青藤碱由湖南正清药业有限公司提供。RPMI1640培养基购于Hyclone公司,FITC标记的单克隆抗体CD80、CD86、鼠免疫球蛋白亚型IgG1均购于eBioscience公司,重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,重组人白细胞介素4,肿瘤坏死因子α购于PE公司。人白细胞介素12ELISA试剂盒购于法国Diaclone公司。方法:取健康志愿者外周血稀释,培养,按重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子1×106U/L、重组人白细胞介素45×105U/L终浓度加入细胞因子,培养7d后可获得树突状细胞。①将常规培养7d后的树突状细胞调整细胞浓度为2×108L-1,加入6孔培养板,分别加入青藤碱使其终浓度为3,10,30mg/L以及肿瘤坏死因子α使其终浓度为10μg/L,同时设对照组,于第9天分别收集悬浮细胞,每管取2×105细胞,用PBS洗涤2次,加入20μLFITC标记的CD80或CD86,对照管则加入鼠免疫球蛋白亚型IgG1,4℃避光孵育30min,充分洗涤后,10g/L多聚甲醛固定,将细胞悬液在流式细胞仪上进行分析。②将常规培养7d后的树突状细胞调整细胞浓度为2×108L-1,加入6孔培养版,分别加入青藤碱使其终浓度为3,10,30mg/L以及肿瘤坏死因子α使其终浓度为10μg/L,同时设对照组,继续培养48h后,收集上清进行白细胞介素12测定。白细胞介素12的检测采用夹心ELISA法检测胞外的白细胞介素12分泌量,按试剂盒说明操作。主要观察指标:①不同剂量青藤碱对树突状细胞表面CD80及CD86表达的影响。②不同剂量青藤碱对树突状细胞分泌白细胞介素12的影响。结果:①树突状细胞表面CD80及CD86表达:不同剂量青藤碱组与对照组树突状细胞表面CD80分子阳性表达率及平均荧光强度差异无统计学意义(P>0.05),各组细胞表面CD86分子阳性表达率及平均荧光强度差异亦无统计学意义(P>0.05)。②各组树突状细胞分泌白细胞介素12水平检测结果:由ELISA测量值可见,青藤碱小、中、大剂量组树突状细胞白细胞介素12水平分别为(863.1±33.7),(668.8±31.9),(512.6±29.6)ng/L,高于对照组[(922.2±36.6),P<0.05-0.01],随青藤碱剂量增大,抑制树突状细胞分泌白细胞介素12水平呈依赖性减少。结论:青藤碱可剂量依赖性地抑制树突状细胞分泌白细胞介素12,而对树突状细胞表面CD80和CD83表达无明显影响;青藤碱的抗类风湿作用可能与其抑制树突状细胞分泌白细胞介素12有关。     

自血疗法对寻常型痤疮患者外周血中CD14^+单核细胞TLR2的表达及血清IL-8、TNF-α浓度的影响

目的观察自血疗法对寻常型痤疮患者外周血中CD14^+单核细胞TLR2的表达及血清IL-8、TNF-α浓度的影响,初步探讨自血疗法治疗寻常型痤疮的部分抗炎机制。方法选取30例寻常型痤疮患者为治疗组,另在本院招募健康志愿者20例作为对照组。分析治疗组采用自血疗法前、后外周血CD14^+单核细胞TLR2的表达及血清IL-8、TNF-α浓度,并与对照组比较。结果治疗组患者TLR2表达与血清IL-8、TNF-α浓度呈正相关(P<0.05)。治疗组干预前的外周血中CD14^+单核细胞TLR2表达及血清IL-8、TNF-α浓度均高于对照组及干预后(P=0.000)。结论TLR2的表达及血清IL-8、TNF-α浓度与寻常型痤疮的发病相关。自血疗法可通过下调寻常型痤疮患者外周血CD14^+单核细胞TLR2的表达,减少血清IL-8、TNF-α的分泌,从而抑制炎症反应的发生。