黄芪多糖对胰岛素抵抗H9c2心肌细胞葡萄糖摄取的影响

目的:研究黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)对胰岛素抵抗H9c2(IR-H9c2)心肌细胞葡萄糖摄取的影响,并探讨其信号机制。方法:采用高浓度胰岛素处理复制IR-H9c2心肌细胞模型,给予一定剂量的APS处理,MTT法筛选合适的实验浓度,2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖法检测细胞的葡萄糖摄取,Western blotting法检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的磷酸化水平。结果:APS可以明显促进IR-H9c2心肌细胞对葡萄糖的摄取,并能显著提高其AMPK的活性,且AMPK抑制剂Compound C明显降低了APS刺激IR-H9c2心肌细胞葡萄糖摄取的作用。结论:APS可以促进IR-H9c2心肌细胞的葡萄糖摄取,这一作用与AMPK的活化有关。     

胰岛素激活PI3K-AKT通路而促进H9c2心肌细胞葡萄糖摄取

目的 探索胰岛素(Insulin)对H9c2心肌细胞葡萄糖摄取的影响及其与PI3 K-AKT信号通路的关系.方法 采用不同时间及不同浓度的胰岛素处理H9c2心肌细胞,确定胰岛素处理H9c2细胞的最佳浓度和最适时间.实验分空白对照组(NC组),2-NBDG组,Insulin组,Insulin+ PI3K-AKT通路抑制剂LY294002组(LY294002组),Insulin+ p38 MAPK通路抑制剂BIRB796组(BIRB796组),使用荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)检测H9c2心肌细胞葡萄糖摄取能力,以流式细胞仪和荧光酶标仪检测心肌细胞对葡萄糖摄取的变化.通过间接免疫荧光法及激光共聚焦检测H9c2心肌细胞葡萄糖转运体-1(glucose tansporter-1,GLUT-1)及葡萄糖转运体-4(glucose tansporter-4,GLUT-4)的表达.结果 ①2-NBDG可用于检测H9c2心肌细胞葡萄糖摄取能力.②Insulin处理H9c2心肌细胞最适浓度和时间分别为200 μmol/L和30 min.③Insulin组与对照组相比增加H9c2心肌细胞葡萄糖摄取(P＜0.05);LY294002组与Insulin组相比降低心肌细胞葡萄糖摄取,两组间差异明显(P＜0.05),BIRB796组较Insulin组无统计学差异(P＞0.05),提示LY294002可抑制Insulin促进心肌细胞葡萄糖摄取,而BIRB796不能抑制上述作用.④H9c2心肌细胞膜表达葡萄糖转运体1(GLUT1)和葡萄糖转运体4(GLUT4),Insulin处理H9c2心肌细胞30min后经激光共聚焦成像显示H9c2心肌细胞膜GLUT1和GLUT4表达增加(P＜0.05).结论 胰岛素促进H9c2心肌细胞葡萄糖摄取的作用可能与PI3 K-AKT通路相关,与p38MAPK通路不相关,胰岛素激活PI3 K-AKT信号通路后可能促进H9c2心肌细胞膜上GLUT-1及GLUT-4的表达,从而使H9c2心肌细胞对葡萄糖摄取增加.     

氯化镉诱导大鼠心肌细胞 H9c2 凋亡的作用机制

目的：研究不同浓度氯化镉（CdCl₂）引起大鼠心肌细胞 H9c2 凋亡及机制。方法：将培养的大鼠心肌细胞H9c2分为阴性对照组和镉处理组,阴性对照组为DMEM培养液,镉处理组分别暴露于 5﹑10﹑30﹑50和80 μmol•L^-1 CdCl₂ 作用6、12和24 h,采用MTT法检测细胞存活率;Annexin Ⅴ-FITC/ propidium iodide (PI)流式细胞技术(FCM)、丫啶橙（AO）/ 溴化乙啶（EB）双荧光染色法检测细胞凋亡情况。结果：镉处理组细胞存活率随着剂量的加大及时间延长明显下降,与阴性对照比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）;CdCl₂可引起H9c2细胞凋亡,各剂量组凋亡率明显高于阴性对照组（P<0.001）,各剂量组之间凋亡率差异无显著性（P>0.05）;AO/EB 染色镜下可见H9c2细胞呈典型早期凋亡形态学改变。结论：H9c2 细胞对CdCl₂的作用较敏感,低剂量﹑短时间作用即可引起细胞凋亡,但 H9c2 细胞对CdCl₂有一定耐受性。     

白藜芦醇通过ERK1／2通路对H9c2心肌细胞抗氧化应激损伤的研究

目的培养H9c2心肌细胞建立氧化应激模型,同时选择并选用ERK1／2途径作为研究对象,利用ERK1／2通路特异性阻断剂U0126进一步探讨可能的作用机制,观测白藜芦醇对心肌细胞抗氧化应激损伤的保护及机制。方法通过传代方法培养心肌细胞细胞。实验分为以下5组：正常对照组、过氧化氢（H2O2）组、白藜芦醇＋H2O2组、白藜芦醇＋UO126＋H2O2组、UO126＋H2O2组,实验终止后,在倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态的变化,测定乳酸脱氢酶（LDH）的释放,测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性,通过流式细胞术来检测心肌细胞的凋亡。结果H2O2组心肌细胞LDH量较对照组有所增加（99808±23．07Vs477．11±17．78,P〈0．05）,SOD活性较对照纽有所下降（15．43±4．52vs35．03±2．17,p〈0.05）;白藜芦醇＋H2O2组LDH的量较H2O2组下降（208．51±1784Vs998．08±23．07,P〈005）,SOD的量较H2O2组下降（29．03±3．18Vs15．43±4．52,p〈0．05）;而白藜芦醇＋u0126＋H。02组与白藜芦醇＋H20,组相比LDH的量有所下降（617．3±11．23Vs708．51±1784,P〈0．05）,SOD的量有所下降（25．12±2．23Vs29．03±318,P〈0．05）,U0126＋H2O2组与H2O2组比较差异有统计学意义,P〈0．05。凋亡率结果显示,空白组细胞生长良好,对照组细胞集中在B3区,在B4区和B2区内无分布或分布甚少,凋亡率极低为6．73±2．38;H2O2组出现大量凋亡细胞,其凋亡率为56．2±4．73,与空白对照组相比差别有统计学意义（P〈0．05）;白藜芦醇＋H2O2组其凋亡率显著降低为48．17±308,与H2O2组相比差别有统计学意义（P〈005）;而白藜芦醇＋UO126＋H2O2组与白藜芦醇＋H2O2组相比凋亡率有所下降（4817±3．08Vs40．9±1．66,P〈0．05）,差别均有统计学意义。结论H2O2可以诱导心肌细胞的损伤及凋亡;白藜芦醇可以减轻H2O2所致的心肌细胞损伤及凋亡作用,ERK1／2通路可能为白藜芦醇发挥保护作用的途径之一。     

白藜芦醇对脂多糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响

目的 探讨白藜芦醇对脂多糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响及其与Sirt1表达量的关系.方法 H9c2心肌细胞株培养24 h后随机分为4组:空白对照组(CON组)、白藜芦醇对照组(RES组)、模型组(LPS组)和白藜芦醇处理组(RL组).RES组和RL组细胞接受白藜芦醇处理24 h,此后LPS组和RL组细胞接受脂多糖处理24 h.处理完成后,采用乳酸脱氢酶检测试剂盒测定细胞培养液中乳酸脱氢酶含量;硫代巴比妥酸反应法检测细胞内丙二醛(MDA)的含量;荧光探针标记法检测细胞内活性氧(ROS)的含量;Western blot法检测Sirt1表达量.结果 与CON组比较,LPS组中H9c2心肌细胞乳酸脱氢酶漏出量和细胞内MDA及ROS含量显著升高,Sirt1表达量显著降低;与LPS组比较,RL组中乳酸脱氢酶漏出量和细胞内MDA及ROS含量显著降低,Sirt1表达量显著升高.结论 白藜芦醇降低脂多糖诱导的H9c2心肌细胞氧化损伤,该作用可能与白藜芦醇提高受损心肌细胞内Sirt1的表达量有关.     

丙烯醛对缺氧复氧H9c2心肌细胞损伤的影响及机制初探

目的研究丙烯醛对缺氧复氧H9c2心肌细胞损伤的影响,并探讨其促凋亡作用机理。方法建立H9c2心肌细胞缺氧复氧(H/R)损伤模型,分为正常对照组、丙烯醛组(ACR)、缺氧复氧组(H/R)、丙烯醛+缺氧复氧组(ACR+H/R)。用10μmol/L丙烯醛预处理H9c2心肌细胞30min后2h缺氧16h复氧,采用MTT法检测细胞存活率,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色检测细胞核凋亡的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白cytochrome c(cyt c)、caspase 9和caspase 3的表达水平。结果与H/R组相比,ACR+H/R组H9c2细胞存活率下降、凋亡增加(P<0.05),cyt c的线粒体蛋白表达水平下调、细胞浆蛋白表达水平上调,caspase 9和caspase 3蛋白表达水平下调并出现明显裂解蛋白。结论作为一种来源于人类生活环境的心血管毒物,丙烯醛能加剧缺氧复氧H9c2心肌细胞的损伤,可能与cyt c由线粒体释放到细胞浆、激活caspase级联反应导致线粒体功能损伤有关。     

丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对亚砷酸钠导致的H9c2心肌细胞损伤的影响

目的 探究丹参酮ⅡA磺酸钠?(STS)?对亚砷酸钠?(NaAsO2)?导致的H9c2心肌细胞损伤的影响.方法 采用CCK-8法检测不同浓度的STS单独处理H9c2心肌细胞后以及STS预处理后加入NaAsO2作用后的细胞活力;检测STS与NaAsO2联合作用后细胞内caspase?3/7含量;检测STS预处理后加入NaA...     

黄连素介导的细胞自噬对缺氧损伤H9c2心肌细胞的影响

目的:研究黄连素(Berberine,BBR)对缺氧损伤H9c2心肌细胞的影响,并探索BBR所介导的细胞自噬机制在逆转心肌损伤中的作用。方法:设置不同浓度的BBR药物组,处理H9c2细胞24 h,采用CCK-8法检测细胞活力,筛选适宜的BBR药物治疗浓度。分别设置正常H9c2细胞对照组,缺氧H9c2细胞组(HP组),BBR药物处理组,缺氧/BBR处理组(HP/BBR组),BBR处理时间均为24 h。收集蛋白或细胞,采用Western blot及流式细胞仪法检测心肌细胞凋亡水平及自噬相关分子的表达水平。同时采用PI3K抑制剂抑制H9c2心肌细胞自噬,检测自噬相关分子表达。结果:一定浓度范围内的BBR对心肌细胞无细胞毒性,且可以显著降低缺氧损伤所致的H9c2心肌细胞凋亡;不仅如此,高浓度BBR可显著诱导H9c2细胞发生自噬,且心肌细胞自噬信号通过PI3K通路介导。结论:黄连素可通过介导细胞自噬发挥抑制H9c2心肌细胞凋亡的作用,且黄连素介导的心肌细胞自噬信号通过PI3K通路所介导。     

2-NBDG用于乳腺癌MDA-MB-231细胞荧光检测研究

目的:评价荧光2-N[7-硝基苯-2-乙二酸,3-4羟氨基](2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino],NBD)标记2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)即2-NBDG,靶向探测高表达葡萄糖转运蛋白1(Glut1)的MDA-MB-231乳腺癌细胞可行性. 方法:2-NBDG分别孵育接种在6孔板里的人乳腺癌MDA-MB-231细胞1,10,20,40 min后,荧光显微镜观察并摄像;为了进行竞争性抑制,用D型葡萄糖预先孵育细胞30 min后再加入2-NBDG孵育20 min,荧光显微镜观察并摄像.同时用流式细胞仪分析孵育不同时间及有无竞争抑制的细胞吸收2-NBDG量的差异.结果:荧光成像显示2-NBDG积聚在 MDA-MB-231细胞膜和细胞质内,加入D型葡萄糖竞争抑制后,荧光信号显著减弱;流式细胞仪分析表明最初的1 min 2-NBDG被肿瘤细胞迅速摄取(MDA-MB-231细胞自发荧光强度为2.66±0.09,2-NBDG孵育1 min后荧光强度为4.04±0.18),10 min时吸收持续增加(荧光强度为5.64±0.17),20 min吸收最明显(荧光强度为25.10±0.57);加入D型葡萄糖竞争抑制后,细胞摄取2-NBDG的荧光强度降低46%.结论:2-NBDG能迅速被高表达Glut1的MDA-MB-231乳腺癌细胞靶向吸收,有望成为葡萄糖代谢的光学标记物来检测高代谢的恶性肿瘤.     

异氟烷预处理激活Nrf2-ARE通路保护H9c2心肌细胞缺氧-复氧损伤

目的 研究异氟烷预处理对大鼠胚胎心肌细胞(H9c2)缺氧-复氧损伤及Nrf2-ARE信号通路的影响.方法 用大鼠H9c2细胞低氧模拟缺血性损伤,并将细胞分为空白对照组、缺氧-复氧组、异氟烷预处理组、转染Nrf2 siRNA组、转染非特异性siRNA组(Scramble组)、异氟烷预处理的Scramble组和异氟烷预处理的siRNA组.采用MTT法检测H9c2细胞存活率,TUNEL染色检测细胞凋亡,分别使用硫代巴比妥酸法(TBA)和分光光度法测定MDA和GSH水平,qRT-PCR及Western blot检测Nrf2、HO-1和NQO1基因的表达.结果 与空白对照组比较,缺氧-复氧组细胞活力降低,凋亡细胞数上升,MDA水平升高,GSH水平降低,同时H9c2细胞中Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表达降低,差异均具有统计学意义(JP＜0.01).与缺氧-复氧组比较,异氟烷可提高H9c2细胞活力,降低凋亡细胞数,并降低MDA水平,升高GSH水平,上调Nrf2、HO-1和NQO1的表达(P＜0.05).siRNA转染组Nrf2的mRNA和蛋白表达与缺氧-复氧组和Scramble组相比均降低(P＜0.05),2％异氟烷对siRNA转染组Nrf2 mRNA和蛋白表达均无影响(P＞0.05);经2％异氟烷处理的siRNA转染组H9c2细胞存活率与空白对照组、2％异氟烷处理组和2％异氟烷处理的Scramble组相比降低,凋亡细胞数增多,MDA水平升高,GSH水平降低(P＜0.05).结论 异氟烷预处理对H9c2细胞缺氧-复氧损伤具有保护作用,这种保护作用与激活Nrf2-ARE信号通路有关.     

Nardosinone protects H9c2 cardiac cells from angiotensin II-induced hypertrophy

Pathological cardiac hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ ） can subsequently give rise to heart failure, a leading cause of mortality. Nardosinone is a pharmacologically active compound extracted from the roots ofNardostachys chinensis, a well-known traditional Chinese medicine. In order to investigate the effects of nardosinone on Ang Ⅱ-induced cardiac cell hypertrophy and the related mechanisms, the myoblast cell line H9c2, derived from embryonic rat heart, was treated with nardosi- none （25, 50, 100, and 200μmol/L） or Ang Ⅱ （1 μmol/L）. Then cell surface area and mRNA expression of classical markers of hypertrophy were detected. The related protein levels in PI3K/Akt/mTOR and MEK/ERK signaling pathways were examined by Western blotting. It was found that pretreatment with nardosinone could significantly inhibit the enlargement of cell surface area induced by Ang Ⅱ. The mRNA expression of ANP, BNP and 13-MHC was obviously elevated in Ang Ⅱ-treated H9c2 cells, which could be effectively blocked by nardosinone at the concentration of 100μmol/L. Further study revealed that the protective effects of nardosinone might be mediated by repressing the phosphorylation of related proteins in PI3K/Akt and MEK/ERK signaling pathways. It was suggested that the inhibitory effect of nardosinone on Ang Ⅱ-induced hypertrophy in H9c2 cells might be mediated by targeting PI3K/Akt and MEK/ERK signaling pathways.     

缺氧预适应诱导人脐静脉内皮细胞释放的微囊泡对正常H9c2细胞的作用

目的:分离提取缺氧预适应（HPC）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分泌的微囊泡(MVs),探讨HPC-EMVs对正常H9c2心肌细胞的作用和其Caspase 3、Bcl-2和Bax表达的影响。方法:采用HPC方法诱导HUVECs释放MVs,将其和正常培养的大鼠H9c2心肌细胞孵育,通过MTT法检测细胞存活率和比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性; 通过Hoechst 33258染色观察细胞核的形态变化;比色法测定培养液中Caspase 3活性以及Western blot法检测H9c2细胞中Bcl-2和Bax的表达。结果:HPC模型构建过程中,与缺氧/复氧(H/R)组相比,HPC组细胞存活率显著升高（P<0.01）,即成功构建HUVECs 的HPC模型;HPC-EMVs处理H9c2细胞结果发现,与对照组H9c2细胞相比,HPC-EMVs 30、60 μg/mL组细胞存活率显著降低（P<0.001）,且LDH活性和Caspase 3活性显著升高（P<0.01或P<0.001）,凋亡细胞量增加, Bcl-2/Bax比值显著降低（P<0.001） 。结论:成功采用HPC的方法诱导HUVECs释放MVs,HPC-EMVs通过影响正常H9c2细胞Caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白的表达发挥促凋亡作用。     

过氧化氢对原代心肌细胞及H9c2细胞的损伤作用

目的:考察过氧化氢对H9c2心肌细胞及原代心肌细胞损伤作用的相似性。方法:选用H9c2心肌细胞与新生大鼠原代心肌细胞,应用MTT法测定不同浓度过氧化氢对H9c2心肌细胞及原代心肌细胞活性的影响,观察两株细胞对过氧化氢损伤的敏感性。结果:600～1 600μmol/L的过氧化氢对H9c2心肌细胞及原代心肌细胞所造成的氧化损伤均具有浓度依赖性,1 200μmol/L的过氧化氢使H9c2心肌细胞的存活率降低40%～60%(P<0.01),表现出与原代心肌细胞相似的H2O2损伤敏感性(P>0.05)。结论:H9c2心肌细胞与原代心肌细胞对过氧化氢氧化损伤具有相似的作用和浓度依赖性。     

益心解毒方对Nox2和Nox4亚基过表达的心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响

目的通过观察益心解毒方含药血清对Nox2、Nox4亚基过表达的H9c2心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响,揭示其作用环节是否与干预相应亚型的NADPH氧化酶调控环节有关。方法采用PCR方法扩增Nox2、Nox4基因全长序列,经双酶切、连接载体和转化后提取重组质粒,经酶切鉴定的阳性质粒进行DNA测序,测序正确后按照lipofectamine 2000试剂的说明书瞬时转染H9c2细胞,转染后的心肌细胞分组给予不同的药物干预,24 h后检测NADPH氧化酶活性。结果 1含有Nox2/Nox4亚基的重组质粒载体通过测序鉴定,结果与Gen Bank报道的完全一致。2通过荧光显微镜下观察转染72 h后的H9c2细胞,可见大量发绿色荧光的细胞,流式细胞术计数结果显示转染率均在60%左右,符合实验要求。3空质粒载体组、模型组、益心解毒方组的NADPH氧化酶活性表达明显高于正常组(P<0.01,P<0.05);模型组和益心解毒方组的NADPH氧化酶活性表达高于空载体组(P<0.01);模型组NADPH氧化酶活性表达均明显高于其他各组,而益心解毒方各组的NADPH氧化酶活性表达均明显低于模型组(P<0.01,P<0.05)。结论成功构建大鼠心肌细胞Nox2、Nox4亚基的重组质粒载体,该重组质粒载体可以在心肌细胞中过表达,益心解毒方可以有效地降低NADPH氧化酶活性的表达。提示此复方治疗心衰的机制可能是抑制了Nox2和Nox4型NADPH氧化酶的表达。     

吡格列酮抗高糖诱导H9c2心肌细胞炎性损伤的机制研究

目的 探讨PPAR-γ激动剂吡格列酮（pioglitazone, PGZ）通过抑制p38MAPK/NF-κB信号通路减轻高糖诱导的H9c2大鼠心肌细胞炎性损伤。方法 离体培养的H9c2细胞随机分6组,分别为低糖组（5.5 mmol/L葡萄糖,NG组）、高糖组（35 mmol/L葡萄糖,HG组）、高糖+不同浓度PGZ组（HG+5 μmol/L PGZ 、HG+10 μmol/L PGZ、HG+15 μmol/L PGZ、HG+20 μmol/L PGZ）,采用CCK8法检测各组细胞干预24、48 h后细胞活性变化;据CCK8结果选取NG组、HG组、HG+10 μmol/L PGZ （Low组）、HG+20 μmol/L PGZ （High组） 4组细胞干预48 h,ELISA检测各组细胞炎性因子TNF-α、IL-1β的含量,Western-blot检测各组细胞p-p38、p-p65蛋白的表达。结果 CCK8检测结果显示,与NG组比较,24、 48 h后HG组明显活力下降（P<0.01）,表明高糖可诱导心肌细胞损伤;与HG组比较,48 h后HG+10 μmol/L PGZ、HG+ 15 μmol/L PGZ两组细胞活力均升高（P<0.05）,HG+20 μmol/L PGZ组细胞活力明显升高（P<0.01）,提示PGZ可对高糖环境下心肌细胞起保护作用。干预48 h后ELISA结果显示,HG组TNF-α、IL-1β含量与NG组比明显升高（P<0.01）,提示高糖环境可致心肌细胞发生炎性损伤;与HG组比较,Low组IL-1β含量降低（P<0.05）,High组TNF-α含量降低（P<0.05）,IL-1β含量明显降低（P<0.01）。提示PGZ可减轻高糖诱导心肌细胞炎性损伤。干预48 h后Western-blot结果显示,与NG组比较,HG组p-p65和p-p38蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）;与HG组比较,Low组p-p65和p-p38蛋白表达均降低（P<0.05）,High组p-p65和p-p38蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）。提示PGZ可下调高糖诱导心肌细胞NF-κB/p38MAPK通路的表达。结论 PPAR-γ激动剂吡格列酮可以减轻高糖诱导H9c2大鼠心肌细胞的炎性损伤,其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号转导通路有关。