人腺病毒7型DNA结合蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达人腺病毒（HAdV）7型DNA结合蛋白（DBP）,制备DBP蛋白多克隆抗体。方法:合成HAdV-7 DBP基因并克隆至pET30a载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导进行原核表达。经镍离子金属螯合层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,使用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定该抗体效价...     

Sao蛋白多克隆抗体制备鉴定及促全血杀菌作用

目的 制备2型猪链球菌（S.suis 2）表面抗原一（Sao）重组蛋白的多克隆抗体,鉴定其免疫学特性。方法 通过PCR从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中扩增基因Sao,构建重组表达质粒pET28a-Sao,转化E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷诱导表达目的蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物,His亲和层析柱纯化重组蛋白,利用纯化后Sao蛋白制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,评价Sao多克隆抗体的促全血杀菌作用。结果 构建的重组质粒可以在宿主菌中高效表达,纯化后获得的重组蛋白纯度可达90%;间接酶联免疫吸附试验测定Sao多克隆抗体效价为1：102400;Western blot结果显示,Sao多克隆抗体有较好的特异性;全血杀菌实验显示,05ZYH33在含有Sao多抗血清的全血中相对存活率下降85%。结论 本研究制备的2型猪链球菌重组Sao蛋白多克隆抗体效价高,特异性好,可明显增强全血对细菌的杀伤作用。     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

2014年盐城市盐都区肠道埃可病毒18型病毒性脑炎疫情调查

目的了解2014年春夏季盐城市盐都区病毒性脑炎流行病学及病原学特点,探讨防制对策。方法回顾性调查分析225例病毒性脑炎患儿的流行病学资料和临床资料。结果盐城市盐都区2014年春夏季共报告225例病毒性脑炎病例,疫情始于4月,6月为高峰,终于7月;病例多为15岁儿童,4~9岁患者占发病总数的74.22%;报告暴发疫情1起,4所幼儿园发生聚集性疫情,其余病例呈高度散发状态。采集13份患者脑脊液、肛、咽拭子标本,埃可病毒18型肠道病毒阳性9份。结论 2014年春夏季盐城市盐都区病毒性脑炎的流行主要由肠道病毒埃可18型引起。应加强对医疗机构临床严重不良病例/事件监测预警和防控工作。     

人细小病毒B19VP1基因片段原核表达载体的构建及其表达

目的　克隆人细小病毒B19　VP1基因片段,构建其重组克隆载体和表达载体,并诱导表达。方法　利用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,将B19病毒VP1基因片段扩增后,构建pGEM-T-easy克隆载体;经PCR筛选后,亚克隆于pGEX-4T-1表达载体中,并转化至BL21感受态菌;经诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)诱导表达,并以免疫印迹法对表达蛋白进行鉴定。结果　扩增出一条约 801bp的基因片段,PCR鉴定结果的与预期结果一致。经IPTG诱导,VP1融合蛋白在大肠杆菌中得到成功表达,PAGE上出现相对分子量约为 54KD的一条新生蛋白带,经蛋白印迹验证为表达蛋白B19VP1。薄层扫描现示,表达产物占菌体总蛋白的 27. 4%。结论　获得人细小病毒B19VP1基因片段的原核表达载体及其产物,对进一步研究其纯化及B19疫苗有重要意义。     

盐城市1起病毒性脑炎疫情的肠道病毒Echovirus18VP1基因分子特征

目的对盐城市1起病毒性脑炎聚集性疫情分离的Echovirus18(E-18)型肠道病毒进行VP1基因分子进化特征分析。方法通过实时荧光RT-PCR方法,对2019年盐城市病毒性脑炎聚集性疫情标本进行肠道病毒的检测,对非EV71或CVA16其他肠道病毒进行分子分型,采用RT-PCR扩增E-18型肠道病毒VP1基因并测序,采用生物信息软件从核苷酸、氨基酸和分子进化3个层面进行分子特征分析。结果该起病毒性脑炎聚集性疫情是由E-18型肠道病毒感染引起,其6例病例;肛拭子肠道病毒核酸通用阳性4例,阳性率66.67%;均为轻症,全部治愈。4株E-18型肠道病毒株VP1基因片段均未见核苷酸的插入或者缺失,长度均为861bp、编码287个氨基酸,其核苷酸、氨基酸同源性分别为99.9%～100.0%和100.0%;与2019年E-18型手足口病盐城株(151/HFMD/JSYC/2019)VP1基因核苷酸、氨基酸同源性分别为99.5%～99.7%和100.0%;与原型株Metcalf VP1基因核苷酸、氨基酸同源性分别为79.0%～79.1%和93.4%。遗传进化树显示,2019年盐城市4株病毒性脑炎代表株与1株手足口病代表株聚集成簇,构成1个独立进化分支,属于C2基因亚群分支毒株。与原型株Metcalf相比,盐城市4株病毒性脑炎代表株涉及19个氨基酸位点的变异,变异率为6.62%,与1株手足口病代表株在VP1基因B-C loop区域发生了R84N氨基酸位点的变异。结论该起病毒性脑炎聚集疫情由E-18型肠道病毒引起,该病毒属于C2基因亚群优势进化分支,与本地手足口病代表株可能有共同的来源。     

壬基酚人工抗原及多克隆抗体的制备

目的制备壬基酚人工抗原和多克隆抗体,为采用免疫学方法检测壬基酚做准备。方法利用碳二亚胺(DCC)法制备人工抗原,并用紫外扫描法初步验证,用所制备的人工抗原对家兔免疫制备多克隆抗体,并用ELISA法检测抗体滴度。结果初步验证人工抗原中壬基酚与匙孔嘁血蓝蛋白的结合比为18∶1,ELISA法测定抗体效价为1∶32 000。结论用碳二亚胺法成功合成了壬基酚人工抗原,并获得了较高效价的多抗血清,制备壬基酚多克隆抗体所用的时间不足3 d。     

一起由埃可病毒9型所致病毒性脑膜炎的暴发调查

病毒性脑膜炎是由各种病毒引起的中枢神经系统感染性疾病,其中以非脊髓灰质炎病毒（NPEV）最为常见,2009年7—10月,同心县发生一起不明原因的病毒性脑膜炎暴发,     

百草枯完全抗原及多克隆抗体的制备

目的改造百草枯(Paraquat PQ)半抗原,制备百草枯完全抗原及多克隆抗体,为建立酶联免疫吸附方法及其在食品安全快速检测中的应用奠定基础。方法改造半抗原PQ-hap,混合酸酐法合成免疫原(PQ-BSA)和包被原(PQ-OVA),采用SDS-PAGE电泳和质谱对其鉴定,免疫家兔2只,制备多克隆抗体;间接ELISA对其进行效价、灵敏度和特异性检测。结果成功合成百草枯免疫原和包被原,6次免疫后2只家兔血清的效价分别达到1∶40 000和1∶160 000,抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为281.6 ng/ml和98.4 ng/ml,与百草枯类似物没有明显交叉反应。结论合成的百草枯完全抗原具有较好的免疫原性,产生的抗百草枯多克隆抗体具有较好的灵敏度和特异性。     

Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1的克隆表达及抗体制备

目的 克隆表达Ⅱ型登革病毒(dengue virus 2,DV2)非结构蛋白1(DV2-NS1)基因,并制备其单克隆抗体。方法 提取Ⅱ型登革病毒的RNA,扩增其NS1全长基因片段,经TA克隆将NS1基因克隆至pQE30载体中进行诱导表达,表达产物经变性处理后用Ni柱亲和层析纯化并复性,经免疫印迹法(Western Blot)鉴定抗原性。用复性后的NS1蛋白和灭活Ⅱ型登革病毒交替免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法、间接免疫荧光法(IFA)进行单抗亚类、特异性的筛选与鉴定。结果 携带重组质粒pQE30/DV2-NS1的菌株经诱导,可高效表达重组DV2-NS1蛋白,经复性获得可溶性蛋白,Western Blot证实重组的DV2-NS1蛋白具有抗原性;用重组蛋白和病毒混合免疫,共获得10株抗NS1蛋白的单抗,其中3株为特异性抗DV2-NS1蛋白,与其他3型登革病毒无交叉,另7株为混合交叉型;亚类分析一株为IgG2b,余为IgG1。结论 获得重组Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1,并得到10株抗DV2-NS1蛋白的杂交瘤细胞株,为进一步研究NS1的生物学特性和临床诊断试剂建立奠定了基础。     

食品中残留抗生素多克隆抗体的制备

目的制备5种抗生素的多克隆抗体,为建立农药残留的酶联免疫方法奠定基础。方法采用重氮化法将甲基磺胺嘧啶、沙拉沙星、洛美沙星、氯霉素及AOZ半抗原与牛血清白蛋白结合形成复合物,作为全抗原免疫新西兰大白兔,通过层析法提取抗体。结果测定一免、二免、三免后不同时间多克隆抗体的水平,得到5种抗生素的多克隆抗体,效价分析分别为1∶12 000,1∶10 000,1∶10 000,1∶8 000,1∶16 000。结论通过观察5种抗生素兔免疫血清的变化,制备高效价的多克隆抗体。     

雌二醇完全抗原及多克隆抗体的制备

目的 改造雌二醇半抗原,合成雌二醇完全抗原,并经免疫家免得到抗雌二醇多克隆抗体,为建立雌二醇的酶联免疫吸附方法及其在动物性食品安全快速检测中的应用奠定基础.方法 改造雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME),碳二亚胺(EDC)法合成免疫原(E2-BSA)和包被原(E2-OVA),采用SDS-PAGE电泳和质谱(MS)对其鉴定,免疫家兔2只,制备多克隆抗体;间接ELISA测定效价、灵敏度和特异性.结果 成功合成雌二醇免疫原和包被原,6次免疫后E2-T1和E2-T2抗血清的效价分别达到1∶128000和1∶32000,E2-T1抗体和E2-T2抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为44.00 ng/ml和45.59 ng/ml,与雌二醇类似物没有明显交叉反应.结论 合成的雌二醇完全抗原具有较好的免疫原性,产生的抗雌二醇多克隆抗体具有较好的特异性.     

T7噬菌体衣壳蛋白IOA的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化T7噬菌体衣壳蛋白10A,并免疫家兔得到抗10．4多克隆抗体．为研究噬菌体展示抗体技术,进而筛选致病微生物蛋白抗体奠定基础。方法37℃培养含有17噬菌体10A蛋白质粒的大肠杆菌BLT5615,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷直接诱导表达该蛋白;SDS．PAGE鉴定表达状态,盐酸胍变性一尿素复性纯化以包涵体形式存在的蛋白并免疫家兔：辛酸一硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体,间接ELISA测定效价,WesternBlot鉴定特异性。结果成功表达了T7噬菌体衣壳蛋白10A。SDS—PAGE显示所表达的蛋白相对分子质量约为37kDa。主要以包涵体形式存在：复性后SDS—PAGE分析获得单一条带蛋白。利用该蛋白免疫家兔,6次免疫后抗血清的效价均达到1：160003。纯化后的多克隆抗体可以和17噬菌体衣壳蛋白10A特异结合。结论成功表达、纯化了17噬菌体衣壳蛋白10A,并制备了其多克隆抗体。     

Ⅱ型登革病毒非结构蛋白1多克隆抗体制备和免疫特征分析

目的制备抗Ⅱ型登革病毒(dengue virus type 2,DENV2)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)多克隆抗体,分析该抗体的免疫特性。方法采用NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,取血分离血清,纯化获得抗NS1抗体。酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析抗NS1抗体与NS1蛋白和DENV2结合特性。免疫荧光法测定抗NS1抗体与人微血管内皮细胞株1(human microvascular endothelial cell 1,HMEC-1)的交叉反应性。ELISA法分析抗NS1抗体、HMEC-1和新鲜同系小鼠血清共培养体系中活化补体的含量。结果抗NS1抗体能与NS1和DENV2特异性结合,抗体最高滴度分别为1∶1 280和1∶640。抗NS1抗体能与HMEC-1细胞交叉结合,抗NS1抗体、HMEC-1和新鲜同系小鼠血清共培养上清液中C3a、C4a、C5a和s C5b-9含量均显著高于HMEC-1和新鲜同系小鼠血清共培养(均P<0.05),以及PBS、HMEC-1和新鲜同系小鼠血清共培养(均P<0.05)。结论抗DENV2 NS1抗体能交叉结合于血管内皮细胞并激活补体系统,可能在登革出血热的免疫病理机制中起重要作用。     

新型隐球菌Cap10蛋白的重组表达及多克隆抗体制备

目的:重组表达新型隐球菌Cap10蛋白并制备特异抗体,为新型隐球菌的检测和诊断提供特异抗原和抗体。方法:选择CAP10基因开放阅读框架(ORF)抗原表位集中、保守性高的片段,经过大肠杆菌偏嗜的密码子优化后进行基因合成,将目的片段克隆至原核表达载体pQE30中构建重组蛋白表达载体pQE30-CAP10并鉴定,IPTG诱导重组蛋白在M15中表达,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定;镍柱纯化后,免疫家兔制备抗血清。结果:在大肠杆菌中成功表达Cap10,其纯度大于95%;二免后家兔血清抗体效价达到200万以上。结论:获得了高纯度的Cap10蛋白及高效价的多克隆抗体,为新型隐球菌的检测和致病机制研究奠定了基础。     

抗流感病毒NS1蛋白抗体的制备及其生物特性研究

目的NSI蛋白在流感病毒复制和传播中起到重要的调节作用,其功能多样,如能调节宿主细胞的蛋白合成、诱导感染细胞的凋亡以及拮抗IFN作用等,此外还有许多功能至今尚未明了。因此,研制一个特异性高的抗NS1抗体,对NS1蛋白功能的进一步研究起到重要作用。方法RT-PCR扩增流感病毒NS1基因,将其克隆进原核表达载体pET-28a（＋）中。然后在大肠埃希菌B121中表达,用切胶纯化方法获取NS1融合蛋白。用该蛋白免疫新西兰大白兔,制备效价较高的多克隆抗体,并测定其效价（间接ELISA法）。用病毒感染细胞实验、Western印迹法和间接免疫荧光实验等方法,观察病毒复制过程中NS1蛋白的表达及细胞定位情况。结果首先构建了能表达NS1蛋白的质粒,并经原核细胞表达获得了NS1蛋白。然后用该蛋白免疫大白兔,获得了效价较高（1：256000）的抗NS1蛋白抗体。实验发现,该抗体可以特异性结合非依赖亚型的甲型流感病毒NS1蛋白。病毒感染后6h即可以检测到NSI蛋白,随着病毒复制时间的延长NS1蛋白表达量变化不明显;24h后NS1蛋白主要分布于细胞核内并能定位于核仁中,也有部分位于细胞质。结论本研究通过原核表达获得了NS1蛋白,并利用常规的免疫方法获得了效价较高的抗NS1多克隆抗体。所制备的多克隆抗体能够有效定位NS1蛋白的表达,并且能和甲型流感病毒各亚型结合,具有较高的特异性。该抗体不仅能用于NS1蛋白功能及其对宿主细胞影响的研究,而且可用于鉴别诊断猪或其他动物中的病毒感染还是接种疫苗后的反应,有较好的开发应用前景。     

三聚氰胺多克隆抗体的制备及其特异性鉴定

目的制备特异的能区分奶粉中α-乳清蛋白和乳铁蛋白等含氮化合物的三聚氰胺多克隆抗体。方法采用碳化二亚胺法将三聚氰胺和匙孔碱血蓝蛋白(KLH)藕联成完全抗原,在BALB/C小鼠皮肤背部多点注射,收集分离血清,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫印迹法(Westernblotting)鉴定抗血清特异性。结果在BALB/C小鼠体内制备出三聚氰胺多克隆抗体效价为1︰12 800,可与三聚氰胺免疫原多肽良好结合,不与奶粉中α-乳清蛋白和乳铁蛋白等含氮化合物发生交叉反应。结论成功的制备了三聚氰胺特异性多克隆抗体,为研制三聚氰胺免疫学检测方法奠定了基础。     

肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白的表达鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白,为抗体制备和病毒诊断试剂盒的开发奠定基础。方法利用一步法RT-PCR扩增出病毒VP1基因,构建重组原核表达质粒,IPTG诱导后经SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达的特异性。结果重组质粒在1 mmol/L的IPTG 37℃诱导6 h后可诱导表达得到约33 KD的蛋白,且表达的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。VP1蛋白特异性单抗和His蛋白单抗验证了蛋白表达的特异性。结论获得特异性的EV71病毒河南分离株VP1蛋白,可用于开发病毒诊断试剂盒。     

米酵菌酸多克隆抗体的制备

米酵菌酸是椰毒假单胞菌及其酵米菌亚种的毒性代谢产物之一，是引起酵米面和变质银耳等多种食品中毒致死的主要病因。作者成功地制备了米酵菌酸牛血清白蛋白结合物（ＢＡＢＳＡ）、卵清蛋白结合物（ＢＡ－ＥＡ），并在国内首次获得了抗ＢＡ半抗原的多克隆抗体，血清效价可达１：１２×１０４和１：８×１０４。建立了检测ＢＡ的直接和间接竞争ＥＬＩＳＡ法。为进一步研制抗ＢＡ的单克隆抗体、探寻特异性的免疫治疗手段提供了有价值的科学基础。     

人成熟型转化生长因子-β1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步临床应用

目的 获得兔抗人成熟型转化生长因子-β1(TGF-β1)多克隆抗体,并将其初步应用于临床检测.方法 将人成熟型TGF-β1融合蛋白经亲和层析法纯化,并将其作为抗原免疫家兔,获得兔抗血清,经饱和硫酸铵纯化,获得初步纯化的兔抗人TGF-β1多克隆抗体.采用双抗夹心间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定健康对照者、慢性肝病及肝硬化患者血清TGF-β1的OD值.结果 获得初步纯化的兔抗人TGF-β1特异性多克隆抗体,该抗体能与人TGF-β1起反应.各组血清TGF-β1的检测OD450值为轻、中度慢性肝炎组11.333±6.136,慢性重症肝炎组16.400±6.959,肝硬化组14.975±6.090,健康对照组7.275±3.222;前三组分别与健康对照组比较,差异均有显著性(P＜0.01);慢性重症肝炎组、肝硬化组分别与轻、中度慢性肝炎组比较,差异亦有显著性(P＜0.01).结论 制备的TGF-β1多克隆抗体可初步用于临床检测,判断肝纤维化程度.