RhoC基因对胆管癌细胞株QBC939细胞增殖和cyclinD1基因的影响

目的研究RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株的增殖及cyclinD1 mRNA表达的影响。方法将正、反义RhoC cDNA真核表达载体,转染人胆管癌细胞QBC939,检测细胞生长曲线,RT-PCR检测cyclinD1在QBC939细胞、转染空载体的QBC939细胞(QBC939-V)、转染正义RhoC的QBC939细胞(QBC939-S)、转染反义RhoC的QBC939细胞(QBC939-AS)的mRNA相对表达量。结果与QBC939及QBC939-V对照细胞相比,QBC939-S体外生长较快,QBC939-AS体外生长较慢,cyclinD1表达在QBC939-AS与对照组减少(P0.05),cyclinD1表达在QBC939-S与对照组增加(P0.05)。结论 RhoC可能通过调节cyclinD1来调控QBC939的增殖能力。     

蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939增殖及cyclin E和P27蛋白表达影响的研究

目的 已有诸多研究显示中药蟾蜍灵具有明显抑制肿瘤增殖的作用,观察蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939的cyclin E和P27表达的影响,探讨其调控胆管癌细胞增殖的途径和机制. 方法 MTT比色法观察不同浓度蟾蜍灵(0.1、1、10μmol/L)对人胆管癌细胞QBC939增殖的影响;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)实验检测蟾蜍灵毒性;流式细胞术检测人胆管癌细胞QBC939细胞周期的变化;Western blot法测定cyclin E、P27蛋白水平变化. 结果 MTT比色法结果 表明蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939生长具有较强的抑制作用,并在一定范围内具有时间和浓度依赖性,流式细胞仪检测细胞周期阻滞在G0/G1期,具有良好的量效关系.Western blot 测定cyclin E蛋白表达量下降,P27蛋白表达量升高. 结论 蟾蜍灵可能是通过阻滞细胞周期,减少cyclinE蛋白表达,增加P27蛋白表达,来达到抗肿瘤作用.     

SiRNA 抑制 p63 基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法 荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot 检测干扰效率。噻唑蓝（MTT）和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

SiRNA抑制p63基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot检测干扰效率。噻唑蓝(MTT)和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

烯脂酰辅酶A水合酶短链1对胆管癌细胞Warburg效应的影响

【摘要】 目的 研究烯脂酰辅酶A水合酶短链1（Enoyl coenzyme A hydratase short chain 1，ECHS1）对胆管癌细胞Warburg效应的影响以及对人胆管癌裸鼠移植瘤生长的影响。方法 本研究分为实验组及对照组，实验组：干扰ECHS1基因；对照组：ECHS1未干扰；采用酶标仪测定ECHS1对胆管癌QBC939糖酵解代谢的影响；采用免疫组化法检测糖酵解代谢关键酶PKM2表达水平变化，分析ECHS1对胆管癌Warburg效应的影响；同时将构建的含siECHS1 siRNA的质粒转染人胆管癌细胞QBC939，建立裸鼠皮下移植瘤模型。观察siRNA干扰ECHS1表达对胆管癌细胞QBC939裸鼠移植瘤生长的影响。结果 酶标仪测定显示，实验组胆管癌细胞QBC939对葡萄糖的吸收较对照组明显减少，实验组胆管癌细胞QBC939乳酸生成降低，差异均有统计学意义（P＜005）；免疫组化法检测结果表明，较对照组而言，干扰ECHS1可降低实验组胆管癌QBC939细胞中PKM2的表达，差异有统计学意义（P＜005）。抑制ECHS1表达可减小实验组裸鼠皮下肿瘤大小(P＜005)。结论 ECHS1通过调控PKM2蛋白表达影响胆管癌QBC939细胞Warburg效应，同时抑制胆管癌的增殖。     

PPAR-γ在肝门部胆管癌中的表达及其配体激活后对胆管癌细胞的作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）在人类肝门部胆管癌细胞系QBC939中的表达及经其配体吡格列酮（pioglitazone）激活后对QBC939细胞生长的影响。方法 培养QBC939细胞并分别加入不同浓度的吡格列酮进行干预培养,通过RT—PCR检测QBC939中PPAR—γmRNA的表达;光镜下细胞计数了解吡格列酮干预后对细胞增殖的作用;流式细胞技术了解吡格列酮对QBC939细胞周期及凋亡的影响。结果 QBC939中有PPAR—γmRNA表达;PPAR-γ经其配体激活后明显抑制细胞增殖,使细胞周期出现G2／M期停滞,并诱导细胞凋亡。结论 PPAR-γ经其配体激活后通过抑制细胞增殖及促使细胞周期G2／M期停滞而抑制细胞的生长,且诱导细胞凋亡的发生。因此PPAR-γ有可能成为胆管癌治疗的新的分子靶点。     

RhoC反义基因转染对人胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用

目的　构建人 Rho C基因反义真核表达载体 ,研究 Rho C基因对胆管癌 QBC939细胞株增殖的影响。　方法　应用分子克隆技术 ,将含 Rho C基因全长开放阅读框目的片段克隆到真核载体 pc DNA 3.1/ Hyg(+)上 ,构建反义 Rho C c DNA真核表达载体 ,以脂质体转染人胆管癌 QBC939细胞。检测细胞生长曲线 ,RT- PCR检测Cyclin D1 在 QBC939细胞、转染空载体的 QBC939细胞 (QBC939- V)和转染反义 Rho C重组载体的 QBC939细胞(QBC939- AS)的 m RNA相对表达量。　结果　与 QBC939细胞及 QBC939- V细胞相比 ,QBC939- AS细胞体外生长较慢。 QBC939- AS细胞、QBC939- V细胞和 QBC939细胞的 Cyclin D1 的表达量分别为 0 .15 1± 0 .0 76 ,0 .2 96±0 .0 2 6和 0 .2 87± 0 .0 5 7;QBC939- AS细胞的 Cyclin D1 的表达量与 QBC939- V细胞及 QBC939细胞的差异有显著性 (P<0 .0 5 )。　结论　 Rho C可能通过调节 Cyclin D1 来抑制 QBC939细胞的增殖能力。     

HCV核心基因转染对QBC939细胞凋亡及细胞周期的影响

[目的]研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)对肝门部胆管癌细胞(QBC939)细胞凋亡及细胞周期的影响.[方法]将包含HCV-C基因的真核表达质粒pcDNA HCV-C和空载体,利用脂质体介导将其转染QBC939,经G418筛选获得稳定转染HCV-C的QBC939细胞(QBC939 HCV-C ),RT-PCR和免疫荧光法检测HCV-C蛋白表达,MTT法检测QBC939 HCV-C 细胞、空白质粒转染QBC939(QBC939pcDNA)细胞和未转染QBC939细胞生长增生率;流式细胞术(FACS)检测3组细胞凋亡率和细胞周期,以及QBC939 HCV-C 细胞经Fas抗体诱导凋亡后的细胞周期变化.[结果]①QBC939 HCV-C 细胞增殖率显著高于空白质粒转染QBC939和未转染QBC939细胞增殖率;②细胞未经Fas抗体诱导凋亡时,QBC939 HCV-C 细胞S期(20.1%±1.8%)高于未转染QBC939细胞S期(14.2%±3.6%),QBC939 HCV-C 细胞凋亡率(5.0%±0.7%)低于无HCV-C转染QBC939细胞凋亡率(9.2%±0.7%);③QBC939 HCV-C 细胞经Fas抗体诱导凋亡时,细胞S期低于未经诱导凋亡细胞S期.[结论]HCV-C蛋白具有抑制QBC939细胞凋亡和促进细胞增殖作用.     

转染反义寡核苷酸对人胆管癌QBC939细胞XIAP基因表达及细胞周期作用的实验研究

目的研究转染反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞凋亡抑制蛋白基因（X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP）表达的抑制作用及对细胞周期凋亡的影响．方法脂质体介导ASODN瞬时转染QBC939细胞,荧光显微镜观察ASODN转染入细胞的情况,并计算转染率;RT—PCR检测转染前后XIAPmRNA表达的变化;流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化和凋亡率．结果转染后24h可达到最佳的转染效果;ASODN组的XIAP基因水平明显低于对照组（P〈0．05）,流式结果显示转染后QBC939G0／G1期细胞高于阴性对照组,凋亡率高于对照组（P〈0．05）．结论脂质体介导转染ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的XIAP基因表达,使其发生G0／G1期阻滞,并诱导胆管癌细胞凋亡,有望成为胆管癌基因治疗新的靶点．     

三氧化二砷对胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察三氧化二砷(As2O3)对胆管癌癌细胞株QBC939的增殖抑制作用并初步探讨其机制。方法 胆管癌细胞株QBC939用不同浓度As2O3处理，活细胞计数和细胞克隆试验观察As2O3对细胞动力学的影响；丫啶橙荧光染色、透射电镜，TUNEL观察细胞凋亡；流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期变化；增殖细胞核抗原(PCNA)、bcl-2单抗SABC免疫组化染色。结果 在0．75-6μmol/L范围内，As2O3明显抑制QBC939细胞增殖和诱导细胞凋亡，其作用随As2O3浓度增加和作用时间延长而增强；相应地PCNA和bcl-2表达减弱。流式细胞仪检测可见明显的凋亡峰，并阻滞细胞周期的G2-M期。结论 As2O3可明显抑制胆管癌细胞株QBC939的生长、诱导癌细胞凋亡，有临床治疗胆管癌的潜在价值。     

microRNA-21对裸鼠人胆管癌细胞移植瘤EMT的影响

目的 观察microRNA-21 ( miR-21 )对裸鼠人胆管癌细胞移植瘤生长及上皮间质转化( EMT)进程的影响. 方法在两组裸鼠侧腹部皮下注射对数生长期的胆管癌细胞QBC939和稳定表达miR-21的QBC939-miR-21细胞,建立裸鼠移植瘤模型. 采用Western blot、免疫组化及实时定量RT-PCR法检测EMT的上皮细胞标志物 E-钙粘蛋白( E-cadher-in)和间质标志物N-钙粘蛋白( N-cadherin)、波形蛋白( Vim-entin)的表达. 结果 QBC939-miR-21 组移植瘤体积大于QBC939组( P<0. 05 ) ,且E-cadherin相对表达量降低, Vim-entin、N-cadherin相对表达量增加. 结论 miR-21促进了裸鼠胆管癌细胞移植瘤生长和 EMT 进程,为进一步研究 miR-21在胆管癌中的功能及作用机制奠定了基础.     

腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用

目的 研究p16基因对胆管癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒p16转移到人胆管癌细胞QBC939,对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体朱病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导,用RT-PCR方法检测,在胆管癌QTBC939细胞系中p16呈低表达,重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达,重组体朱病毒介导的p16在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。流式细胞计数和细胞DNALadder,证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 p16基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用。     

p16对人胆管癌细胞增殖影响及其机制的研究

目的:通过构建稳定高表达抑癌基因p16的人胆管癌细胞模型,研究p16对胆管癌细胞增殖的影响及其相关机制。方法:将抑癌基因p16的cDNA构建到高效真核表达的质粒载体pcDNA3-neo中的EcoRⅠ/XbaⅠ位点,构建成p16真核表达质粒pcDNA3p16;通过脂质体法将pcDNA3p16质粒转染人胆管癌细胞系QBC939,经G-418筛选,获得稳定高表达p16的人胆管癌细胞模型。用MTT法测定细胞生长曲线,并测定细胞克隆形成能力,用流式细胞光度术测定细胞周期。用Western分子杂交分析癌基因c-myc的蛋白表达水平。结果:与对照组相比,p16高表达的人胆管癌细胞QBC939的增殖受到明显抑制;流式细胞光度术表明p16的高表达导致了较为明显的G1期阻滞作用,但对细胞周期的其他时相并无影响;Western免疫印迹分析结果表明癌基因c-myc的蛋白水平表达下降。结论:抑癌基因p16下调癌基因c-myc的表达是p16抑制细胞增殖的分子机制之一。     

小分子药物CX-3543对胆管癌QBC939细胞中c-Myc相关miRNA及miRNA靶基因表达的影响研究

目的 探讨在小分子药物CX-3543作用下,胆管癌细胞QBC939中癌基因c-Myc相关的miRNA及miRNA靶基因的表达变化.方法 MTT检测CX-3543对QBC939细胞增殖的影响.Western blot检测CX-3543处理后细胞中c-Myc及c-Myc相关miRNA靶基因的表达,同时,Northern blot检测c-Myc相关miRNA的表达.结果 CX-3543抑制QBC939细胞增殖.CX-3543可抑制QBC939细胞中c-Myc的表达,且与作用时间及剂量正关性.同时CX-3543抑制了c-Myc相关miRNA(miR-9、miR-19和miR-20α)的表达,继而上调了miR-9及miR-19的靶基因E-钙粘蛋白及RB1的表达,下调了miR-20α靶基因Pten的表达.结论 CX-3543可有效抑制胆管癌细胞系QBC939中癌基因c-Myc的表达,影响c-Myc相关miRNA及miRNA靶基因的表达,减弱c-Myc介导的通路对胆管癌的影响.     

下调iNOS表达对人胆管癌QBC939细胞侵袭和迁移的影响

目的 ：探索诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在胆管癌细胞的侵袭和迁移过程中的相关作用。方法 ：构建靶向iNOS基因的siRNA表达载体,借助脂质体稳定转染QBC939细胞（iNOS-siRNA）,同时设置转染无干扰质粒的阴性对照组以及未转染的空白对照组。使用Transwell小室法分别检测3组QBC939细胞侵袭的差异,划痕实验分别检测3组QBC939细胞迁移的差异。结果 ：与对照组相比,实验组的iNOS蛋白表达水平明显下降,同时检测到干扰组QBC939细胞侵袭以及迁移明显降低。结论 ：iNOS基因与胆管癌的侵袭和迁移相关,特异性沉默iNOS基因来下调其表达能明显抑制人胆管癌QBC939细胞的侵袭及迁移。     

过表达miR-29b可抑制胆管癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡

目的研究miR-29b在胆管癌中的表达情况,及其对胆管癌细胞QBC939增殖和凋亡的影响。方法Real-time PCR检测 miR-29b在胆管癌细胞QBC939与良性胆管细胞株H-69中的表达;及胆管癌组织与正常胆管组织中的表达。将对数生长期的 QBC939细胞分为3组,空白对照组,阴性对照组,miR-29b过表达组。MTT和细胞克隆形成实验分别检测过表达miR-29b对细 胞增殖和克隆形成率的影响;流式细胞术检测过表达miR-29b对细胞周期和凋亡的影响。结果miR-29b在胆管癌细胞及胆管 癌组织中表达较正常胆管细胞和组织中均显著降低（P<0.01）。miR-29b过表达组QBC939细胞的miR-29b较阴性对照组表达 明显升高（P<0.01）。在QBC939细胞中,过表达miR-29b可以显著抑制细胞的增殖和克隆形成（P<0.01和P<0.05）;过表达miR- 29b可阻滞细胞在S期（P<0.05）,并且导致细胞凋亡明显增加（P<0.01）。结论miR-29b作为一种抑癌microRNA,在胆管癌中 低表达,过表达miR-29b可以抑制胆管癌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

p27kip1基因在人胆管癌细胞化疗增敏效应中的作用

目的 探讨外源性p27^kip1在人胆管癌细胞系QBC939中高表达对胆管癌细胞化疗敏感性的影响。方法 通过携带人p27^kip1基因的重组腺病毒载体Ad-p27mt转染人胆管癌细胞系QBC939。经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot检测p27^kip1在胆管癌细胞中的表达；经MTT比色法及流式细胞术检测5-氟尿嘧啶（5-FU）、丝裂霉素（MMC）、环磷酰胺（CTX）对转染p27^kip1前后的QBC939细胞生长抑制及凋亡的影响。结果 Ad-p27mt转染后5-FU、MMC和CTX对QBC939细胞生长抑制率，分别由转染前的41．89％、45．59％和38．91％显著增加为56．15％、55．65％和51．69％；凋亡率也由13．76％、11．76％和10．46％，明显升高为41．39％、35．94％、34．46％，差异均有显著性意义（均P〈0．05）。结论 p27^kip1在QBC939细胞中高表达，能显著增强胆管癌细胞对化疗药物的敏感性，为基因联合化疗药物治疗胆管癌提供了参考依据。     

nm23-H1基因转染对人胆管癌细胞系QBC939体外浸润能力的影响

目的：探讨nm23-H1基因转染对人胆管癌细胞系QBC939体外浸润能力的影响。方法：将含有全长nm23-H1 cDNA的真核表达载体通过脂腩体法转染人胆管癌细胞系。结果：转染成功的QBC939细胞，其nm23-Hl基因的mRNA、蛋白表达明显增加，转染nm23-H1基因的胆管癌细胞体外浸润能力下降，穿越matrigel的细胞数明显低于亲本QBC939细胞，代表浸润能力的IV型胶原酶（MMP-9）分泌量下降。结论：nm23-Hl基因可以抑制胆管癌细胞的体外浸润能力。     

HCVC蛋白调控肝门部胆管癌细胞中NF-κB活性的研究

目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV C)在肝门部胆管癌细胞中对核转录因子κB(NF-κB)的调控作用。方法 利用稳定表达HCV C蛋白的QBC939细胞株(QBC939HCV C ),通过NF-κB报道基因分析法、凝胶迁移率分析(EMSA)检测HCVC蛋白增强肝门部胆管癌细胞NF-κB的DNA结合活性和反式激活活性。RT-PCR、Western blot检测HCV C蛋白对核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA及P50、P65、IκBα蛋白表达及IκBα蛋白磷酸化的影响。结果 ①EMSA结果显示QBC939HCV C 细胞系中NF-κB相对信号密度明显比QBC939细胞高。②将pNF-κB-lun表达质粒转染稳定表达HCVC蛋白胆管癌细胞系中,通过单光子检测仪检测荧光素酶活性,结果显示QBC939HCV C 细胞中活化NF-κB为12．8倍,而QBC939细胞中NF-κB为2．6倍。③RT-PCR显示IκB mRNA在QBC939HCV C 细胞和QBC939细胞中的表达无明显差异;Western blot结果显示稳定表达HCVC蛋白的QBC939HCV C 细胞株的胞核中的P50、P65蛋白高水平表达,而未转染HCVC蛋白的QBC939细胞仅检测出极低水平的P50、P65蛋白。在QBC939HCV C 细胞胞浆中IκBα蛋白低水平表达。QBC939细胞高水平表达,但IκBα蛋白磷酸化水平则相反。结论 HCVC蛋白通过增加IκB降解激活的NF-κB在肝门部胆管癌的发生中起重要作用。     

原癌基因c-erbB-2在胆管癌细胞中的表达

目的：研究c-erbB-2基因在胆管癌细胞中的表达。方法：应用免疫细胞化学SABC法检测两株人胆管癌细胞（QBC一939和SK-ChA-1）、21例原代培养人胆管癌细胞和6例原代培养人正常胆管细胞中c-erbB-2蛋白的表达情况。结果：免疫细胞化学检测结果，c-erbB-2在QBC一939细胞和SK-ChA-1细胞中表达均为阳性；21例原代培养人胆管癌细胞中有18例（86％）表达阳性，3例表达阴性，6例原代培养人正常胆管细胞中e-erbB-2蛋白的表达均为阴性。结论：c-erbB-2蛋白在胆管癌组织中为诱导性表达，其表达上调与胆管癌的形成关系密切。