生长分化因子11对炎症微环境中兔BMSCs成骨分化的影响

目的 探讨生长分化因子11(GDF11)对炎症微环境中兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的影响。方法 复苏冻存的兔BMSCs并将其分为3组：对照组（Vehicle）、肿瘤坏死因子-α诱导组（TNF-α）、GDF11干预组（TNF-α+GDF11;GDF11）。流式细胞术检测细胞周期;成骨诱导培养后,检测ALP活性,qPCR检测成骨相关基因Runx2、Osx、ALP和OCN的转录表达,Western blotting检测成骨相关蛋白ALP和OCN的表达。结果 与Vehicle组相比,TNF-α显著促进BMSCs增殖（P <0.05）;TNF-α下调Runx2、Osx和ALP的转录表达,降低ALP和OCN蛋白水平（P <0.05）,而GDF11干预可显著上调Runx2、Osx和ALP转录表达,提高ALP和OCN蛋白水平（P <0.05）。结论 GDF11可促进炎症微环境中兔BMSCs成骨分化。     

富血小板纤维蛋白提取液对经TNF-α刺激下人牙周膜细胞的影响

目的:检测富血小板纤维蛋白提取液(PRFe)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激下的人牙周膜细胞(hPDLCs)成骨分化能力的影响.方法:组织块法分离培养hPDLCs,免疫组化鉴定其来源;Choukroun法制取PRFe;实验分为空白对照组、TNF-α(10 ng/ml)组、PRFe组和PRFe+ TNF-α(10 ng/ml)组.碱性磷酸酶试剂盒检测ALP活性;茜素红染色观察细胞矿化功能;Western blotting检测Runx2、Osterix蛋白含量.结果:ALP活性检测、茜素红染色和Western blotting结果显示TNF-α组各项指标均低于空白对照组(P＜0.05),PRFe组各项指标均高于空白对照组(P＜0.05),PRFe+ TNF-α组各项指标均高于TNF-α组(P＜0.05),PRFe组各项指标均高于PRFe+ TNF-α组(P＜0.05).结论:PRFe可促进经TNF-α刺激的hPDLCs成骨分化.     

炎症环境下线粒体自噬与大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化相关性研究

目的：探索高浓度肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的炎症环境下线粒体自噬与大鼠骨髓间充质干细胞(Rat Bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)成骨分化能力的相关性。方法：利用100ng/ml TNF-α构建体外炎症微环境。探讨在炎症微环境下,线粒体自噬与成骨分化的相关性,将实验分为T组(TNF-α 100ng/ml组)、T+促进剂组(TNF-α 100ng/ml+雷帕霉素(Rapamycin)组)和T+抑制剂组(TNF-α 100ng/ml+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组)。使用免疫荧光观察线粒体自噬变化,通过CCK-8,碱性磷酸酶(alkaline ph osph atase, ALP)活性测定、茜素红染色法检测线粒体自噬的变化对细胞增殖与成骨分化的影响,利用RT-PCR、Western Blot分别检测成骨与线粒体自噬相关基因和蛋白的表达情况,以期探索炎症环境下线粒体自噬对成骨分化能力的影响。结果：TNF-α 100ng/ml成功构建体外炎症微环境。Mito-tracker与LC3共定位PC...     

SDF-1α复合Pluronic F-127对兔上颌窦底提升术成骨影响的实验研究

目的 :通过制备基质细胞衍生因子(SDF1-α)的Pluronic F-127复合凝胶材料,观察这种复合材料在体外对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的矿化及成血管作用和复合凝胶材料在兔上颌窦外提升术中的成骨及成血管效果。方法:将兔骨髓间充质干细胞、50ng/ml SDF1-α和质量百分比浓度0.1%的Pluronic F-127复合培养,MTT法检测其细胞毒性,碱性磷酸酶活性测定及茜素红染色。将18只新西兰大白兔双侧进行上颌窦外提升术,双侧植入不同的复合材料(共3种)并进行对照。材料分别为:β-磷酸三钙(β-TCP),生理盐水及SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶。于术后4、8、12周处死,X线片观察双侧上颌窦骨质形成情况,行HE染色、CD31+、CD34+、BMP-2及VEGF免疫组织化学染色观察成骨及成血管作用,并进行统计学分析。结果:体外实验采用MTT法证实了0.1%w/w Pluronic F-127无细胞毒性(P>0.05)。BMSCs-SDF1α复合凝胶碱性磷酸酶染色下,细胞质可见大量碱性磷酸酶染色沉淀,其余3组未见沉淀。BMSCs-SDF1α复合凝胶、BMSCs-单纯凝胶、单纯BMSCs在成骨诱导培养条件下均产生矿化结节,非成骨诱导组未见矿化结节形成。体内实验,X线片结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶及β-TCP充填侧均有阻射影,生理盐水组未见明显阻射影;HE染色结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶成骨效果与β-TCP成骨效果明显,生理盐水组未见骨质形成,统计学分析表明BMSCs-SDF1-α复合凝胶成血管作用较β-TCP及生理盐水组明显增加。结论:SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶能够成功诱导BMSCs分化为成骨细胞,无细胞毒性,在体外及兔上颌窦内成骨、成血管效果明显。     

SDF-1α/CXCR4信号轴介导柚皮素对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的: 探讨柚皮素对骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的影响,SDF-1α/CXCR4信号轴是否参与介导柚皮素促进BMSCs成骨分化。方法: 分离、培养及鉴定大鼠BMSCs,CCK8法检测不同浓度柚皮素对BMSCs增殖的影响,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性;RT-qPCR法检测各组ALP、骨钙素（osteocalcin,OCN）、趋化因子受体4（CXCL receptor 4,CXCR4）和基质细胞衍生因子1α（stromal cell derived factor-1,SDF-1α）的表达,ELISA法检测各组CXCR4和SDF-1α蛋白的表达。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 细胞鉴定结果表明,培养细胞为高纯度的BMSCs。第1、3天,柚皮素对BMSCs增殖无显著影响（P>0.05）;第5天时,50 μg/mL柚皮素可促进BMSCs增殖;第7天时,不同浓度柚皮素均促进BMSCs增殖（P<0.05）;同时,ALP活性随时间推移逐渐增强。RT-qPCR结果表明,柚皮素组和成骨诱导液组中相关基因表达均较培养基组明显增加,而AMD3100组中各基因表达均受到显著抑制（P<0.05）。ELISA检测结果显示,各组CXCR4和SDF-1α蛋白表达随诱导时间增加均逐渐上调,且两者均在100 μg/mL柚皮素组表达最高。结论: 柚皮素可促进BMSCs增殖和成骨向分化,SDF-1α/CXCR4信号轴参与柚皮素对BMSCs的成骨分化,主要在BMSCs成骨分化早期阶段。     

富血小板纤维蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化的研究

目的 :研究富血小板纤维蛋白(PRF)通过Wnt/β-catenin信号通路对骨髓基质干细胞(BMSCs)分化的影响。方法:分离、培养原代兔BMSCs,取第三代细胞进行干细胞鉴定,收集同一只兔耳缘静脉血离心制备PRF,将PRF与BMSCs置于Transwell小室中共培养并进行成骨分化。实验分组:A组为单纯BMSCs对照组;B组为PRF与BMSCs共培养组;C组为加入DKK1的PRF与BMSCs共培养组;D组为加入Wnt3a的PRF与BMSCs共培养组。茜素红染色观察各组钙结节形成情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测各组ALP活性,定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测成骨成脂相关基因Runx2、OCN、PPARγ2及LPL的m RNA表达,同时检测Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达。结果:流式细术检测结果显示,原代培养的BMSCs符合间充质干细胞鉴定标准。茜素红染色结果显示,B组和D组的钙结节数量明显多于A组和C组,A组和C组之间无明显差异。碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果显示,B组与D组的ALP活性较A组和C组明显增加(P<0.05),且两组之间差异无明显统计学意义。q RTPCR结果显示B组与D组中的成骨分化标志基因Runx2、OCN的m RNA表达,较A组和C组显著增加(P<0.05),而成脂分化标志基因PPARγ2、LPL的m RNA表达显著降低(P<0.05)。此外,B组和D组中Wnt/β-catenin信号通路关键因子Cyclin D1及β-catenin的m RNA表达较A组和C组显著增加(P<0.05)。结论:PRF通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化而抑制其成脂分化。     

HIF-1α促进BMSCs成骨及成血管作用的体内外研究

目的:运用基因工程技术,检测HIF-1α基因诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内、外向成血管和成骨方向分化的作用.方法:(1) HIF-1α基因突变后,应用Lentivirus构建Lenti-LacZ、Lenti-WT、Lenti-MT.(2)分别用Lenti-LacZ、Lenti-WT及Lenti-MT转染BMSCs,检测①细胞转染效率;②目的基因在mRNA及蛋白水平的表达;③目的基因在BMSCs细胞内的定位.(3) BMSCs成功转染目的基因后,分别在特定时间点提取总RNA和蛋白,通过RT-PCR和Western印迹检测目的基因对BMSCs成血管和成骨因子表达的调控作用.(4)行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和钙结节的表达检测.(5)检测生物支架材料-明胶海绵(GS)的结构、形态及细胞附着情况.(6)建立F344大鼠颅骨双侧直径5mm的标准骨缺损模型,分别将细胞复合支架材料植入骨缺损区.术后8周取材,行Microfil灌注,观察血管形成,通过大体标本观察、X线及Micro-CT检查、组织学和形态学检测等观察骨修复情况,采用SPSS10.0软件包对结果进行单因素方差分析,评价修复效果.结果:当感染复数(MOI)=15时,BMSCs的转染效率最高.免疫荧光检测表明,目的基因在BMSCs细胞核内.体外常氧条件下,HIF-1α能够显著上调BMSCs的成骨和成血管因子的表达,且ALP和钙结节结果表明目的基因可诱导BMSCs骨向分化.体内实验结果显示,8周时,Lenti-WT组和Lenti-MT组对骨缺损的修复作用明显强于Lenti-LacZ组,而Lenti-MT组又优于Lenti-WT组.结论:HIF-1α基因可以显著提高BMSCs成血管和成骨活性.     

糖尿病兔骨髓间充质干细胞成骨分化能力探讨

目的 观察糖尿病兔骨髓间充质干细胞（bone arrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）以成骨分化为主的生物学特性。方法 通过静脉注射水合四氧嘧啶,建立糖尿病模型,以注射等量生理盐水作为对照组。在无菌条件下,局麻后抽取兔髂骨骨髓,获取BMSCs。采用全骨髓贴壁培养法对细胞进行纯化及培养,分别对2组细胞行MTT检测、实时定量PCR检测、碱性磷酸酶（ALP）活性检测,以及ERK、AKT信号通路表达检测。采用SPSS 13.0软件包对数据进行单因素方差分析（ANOVA）和SNK post hoc分析。结果 与正常组比较,实验组糖尿病兔BMSCs细胞增殖活性、成骨基因表达、ALP活性及成血管基因表达均显著下降（P<0.05）。结论 糖尿病兔BMSCs的增殖活性、成骨分化能力及成血管基因表达能力均受到损害。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

神经调节蛋白1对2型糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 探讨神经调节蛋白1(Nrg1)对糖尿病小鼠骨髓干细胞（BMSCs）成骨分化的影响及其信号机制。方法 将C57小鼠BMSCs分为4组,对照组（普通小鼠BMSCs;Vehicle）,Nrg1干预普通小鼠BMSCs组（Vehicle+Nrg1）,糖尿病小鼠BMSCs组（DM）和Nrg1干预糖尿病小鼠BMSCs组（DM+Nrg1）。MTT法检测BMSCs的增殖活性。成骨诱导培养后,碱性磷酸酶（ALP）半定量试剂盒检测BMSCs的成骨活性,Western blot检测成骨相关蛋白ALP、OCN的表达及PI3K、Akt的磷酸化水平。结果 与Vehicle组相比,DM组成骨分化显著降低（P<0.05）。而Nrg1干预能提高糖尿病小鼠BMSCs的增殖活性,增强ALP活性,促进ALP和OCN的蛋白表达,显著提高PI3K和Akt的磷酸化水平（P<0.05）。结论 Nrg1能促进糖尿病小鼠BMSCs成骨分化,PI3K/Akt信号通路可能是其作用机制。     

骨髓基质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓基质干细胞低氧条件下培养后的成骨能力

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导内皮细胞(ECs)与自体BMSCs低氧条件下联合培养对BMSCs成骨能力的影响.方法:体外分离培养兔BMSCs并向ECs诱导培养,用CD34免疫细胞化学染色鉴定内皮细胞表型:实验分组为BMSCs常氧成骨诱导培养组,BMSCs低氧成骨诱导培养组,BMSCs+ ECs常氧成骨诱导联合培养组BMSCs+ECs低氧成骨诱导联合培养组,持续培养7d,前6d应用PNPP法每天固定时间测定碱性磷酸酶(ALP)活性并作统计学分析;茜素红染色观察第7d矿化结节形成情况.低氧组为1.0％O2浓度.采用SPSS11.0软件包对数据进行方差分析和q检验.结果:BMSCs在一定诱导条件下可诱导为ECs,CD34免疫细胞化学染色为阳性;统计学分析表明,BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组的ALP活性表达显著高于其他3组(P＜0.05).只有BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组有钙化结节形成,茜素红染色呈橘红色.结论:在一定时间内,由BMSCs诱导来源的ECs与自体BMSCs低氧条件下联合培养,BMSCs的成骨活性可显著提高.     

rhBMP-2/rhTGF-β_1联合应用对兔成骨样细胞增殖及分化的影响

目的: 探讨转化生长因子β(transforming growth factors beta,TGF-β)、与骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)联合应用对兔成骨样细胞增殖及分化的影响。方法: 体外培养兔成骨样细胞,采用四唑盐比色法和碱性磷酸酶试剂盒检测两种生长因子对兔成骨样细胞增殖及分化的影响。结果: 100ng/ml rhBMP-2促进兔成骨样细胞的分化,对增殖无明显作用。不同浓度的rhTGF-β1均可促进成骨样细胞的增殖,对分化无明显作用。二者在同时应用时,其作用部分或完全抵消。结论:在本实验条件下,rhBMP-2、rhTGF-β1联合应用时无协同效应。     

稀土元素铈对骨髓间充质干细胞成骨分化调控的体外实验研究

目的:研究铈离子对体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力的影响。方法:分离培养小型猪骨髓间充质干细胞,分别用含有1×10-5mol/L CeCl3的成骨诱导液和单纯成骨诱导液进行培养;然后用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测两组细胞诱导培养1、7、14、21 d的ALP活性;用实时荧光定量PCR分析两组细胞诱导培养14 d时的成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA的表达水平。结果:诱导培养1、7、14、21 d后,CeCl3组各时间点的ALP活性均较对照组显著增加(P<0.05);诱导14 d后,CeCl3组的各成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论:CeCl3能促进BMSCs的成骨分化。     

雷诺昔芬对骨质疏松大鼠骨髓基质细胞的影响

目的:研究不同浓度的雷诺昔芬对骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)增殖及分化的影响。方法:构建Sprague-Dawley(SD)大鼠骨质疏松模型,培养假手术组(Sham-ovariectomized rats,Sham组)及手术组(ovariectomized rats,OVX组)大鼠BMSCs,取生长良好的第3、第4代BMSCs,加入不同浓度的雷诺昔芬作用后,以MTT法检测BMSCs的增殖,速率法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的含量。结果:Sham组大鼠第4代BMSCs较第3代增殖缓慢,ALP含量无明显变化;OVX组大鼠第4代BMSCs增殖能力增强,但ALP含量亦无明显变化。结论:OVX组BMSCs的增殖活力、成骨分化能力显著高于Sham组。雷诺昔芬可促进Sham组BMSCs的增殖,可促进OVX组BMSCs的增殖与分化。     

大鼠骨髓间充质细胞诱导成骨的体内外研究

目的研究大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)体内外成骨的能力。方法分离大鼠BMSCs,将原代细胞分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)诱导培养。应用碱性磷酸酶(ALP)活性和钙结节染色法检测体外成骨分化能力。建立裸鼠成骨模型,测定体内成骨能力。结果 OM组可明显诱导BMSCs成骨分化,表现出高水平的ALP活性和基质矿化能力。OM加骨粉组裸鼠培养8周后,镜下观察到广泛的新骨形成,而单纯OM组或骨粉组未见成骨。结论 OM可明显诱导BMSCs体外成骨分化,与骨粉联合应用能诱导体内异位骨形成。     

釉基质蛋白对人骨髓基质细胞增殖和矿化的影响

目的:观察釉基质蛋白(enamelmatrix proteins,EMPs)对人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:体外培养人骨髓基质细胞,以200μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。流式细胞仪检测EMPs对BMSCs细胞周期的影响,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。结果:体外培养的人BMSCs生长良好,200μg/ml浓度的EMPs能提高细胞的ALP活性;影响细胞周期变化,EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%。结论:釉基质蛋白可促进人骨髓基质细胞的分化,影响细胞周期变化。     

糖基化终末产物介导的牙周膜干细胞成骨分化过程中Wnt经典信号通路相关作用机制的研究

目的:探讨人牙周膜干细胞(human periodontal stem cells,HPDLSCs)成骨分化过程中在糖基化终末产物(AGE-HSA)介导下Wnt经典通路β-catenin的变化.方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪进行干细胞表型分子鉴定后,根据不同刺激环境随机分为OS组(单纯成骨诱导对照组)、OSA组(成骨诱导液+10 μg/mL AGEs)、OSDKK-1组(成骨诱导液+100 μg/mL DKK-1)、OSA+ DKK-1组(成骨诱导液+ 10 μg/mL AGEs+ 100 ng/mL DKK-1)4组,并进行相应的诱导培养.诱导培养7d后,碱性磷酸酶染色检测ALP活性;RT-PCR检测Wnt经典通路基因3-catenin mRNA以及成骨相关基因Runx2、ALP mRNA的表达变化情况;Western Blot检测细胞核蛋白β-catenin和细胞总蛋白Runx2的表达变化情况.结果:纯化的人牙周膜干细胞各表型分子CD29、CD90、CD146、stro-l均阳性表达,ALP染色结果显示:OSA组颜色最浅,OSDKK-1组颜色最深,OSA+ DKK-1组颜色介于两者之间;RT-PCR及Western Blot结果显示:与OS组相比,OSDKK-1组β-catenin的表达水平明显降低,Runx2、ALP的表达水平明显升高(P＜0.05),表明DKK-1抑制了经典wnt通路,而使HPDLSCs的成骨能力增强;而OSA组β-catenin的表达水平明显升高,Runx2、ALP表达水平明显降低(P＜0.05),表明激活了经典wnt通路,而使HPDLSCs的成骨能力下降;当联合加入AGEs和DKK-1(OSA+ DKK-1组)时,成骨能力与OSDKK-1组相比明显降低,而与OSA组相比明显升高(P＜0.05).结论:在HPDLSCs成骨分化过程中,抑制经典wnt通路可以促进其骨向分化;而10 ng/mL的AGEs可通过激活wnt经典通路从而抑制其成骨分化.     

rhBMP-4与rhIGF—Ⅰ联合应用对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响

目的:探讨rhBMP-4与rhIGF-Ⅰ联合应用对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响。方法:将人牙周膜成纤维细胞分别与10ng/ml rhBMP-4、10ng/ml rhIGF-Ⅰ、10ng/ml rhBMP-4 10ng/ml rhIGF-Ⅰ、无血清DMEM共同培养3d,用MTT法测定细胞增殖情况,用碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶的活性,用羟脯氨酸试剂盒检测细胞分泌Ⅰ型胶原的量。结果:第3天,10ng/ml rhBMP-4 10ng/ml rhIGF-Ⅰ组人牙周膜成纤维细胞的生长增殖能力最强,并与其它3组比较有显著性差异(P<0.05),但其增强细胞碱性磷酸酶的活性及促进细胞分泌Ⅰ型胶原的能力并不比两者单独作用强。结论:rhBMP-4与rhIGF-Ⅰ联合应用,能协同促进人牙周膜成纤维细胞增殖,但不能协同促进细胞分化。