钙三醇抑制肾间质成纤维细胞的活化

目的 通过观察钙三醇对肾间质成纤维细胞增殖和凋亡的影响，及其对转化生长因子（TGF）β1诱导的成纤维细胞转分化和细胞外基质(ECM)合成的干预作用，旨在探讨钙三醇抗肾间质纤维化的潜在效应及相关机制。 方法 体外培养大鼠肾间质成纤维细胞NRK-49F，分别以不同浓度TGF-β1（1、2、5和10 μg/L）和（或）不同浓度钙三醇（10－4、10－5、10－6、10－7、和10－8 mmol/L）进行干扰。MTT法观察细胞增殖情况；流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡改变；实时定量PCR和Western印迹法分别检测细胞内α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结缔组织生成因子（CTGF）及纤连蛋白（FN）的mRNA和蛋白表达。 结果 钙三醇能明显抑制正常和TGF-β1（5 μg/L）诱导的NRK-49F细胞增殖（P < 0.01）。经不同浓度钙三醇（10－4、10－5、10－6、10－7、和10－8 mmol/L）作用48 h后，NRK-49F细胞G2/S期细胞比例较TGF-β1刺激组均明显减少（分别为25.88%、21.81%、21.73%、23.28%、23.61%比27.42%，均P < 0.05），但对细胞凋亡无明显影响。NRK-49F细胞经TGF-β1刺激后，其α-SMA、CTGF、FN mRNA表达量显著上升，并在TGF-β1 1~5 μg/L的范围内呈剂量依赖效应。钙三醇能明显抑制TGF-β1诱导的α-SMA、CTGF、FN mRNA表达上调（均P < 0.05），而不同钙三醇浓度干预组之间差异无统计学意义。钙三醇能显著降低TGF-β1诱导的α-SMA和FN蛋白表达（P < 0.05）。 结论 钙三醇可通过G1期停滞抑制大鼠肾间质成纤维细胞增殖，但不影响凋亡。钙三醇具有拮抗 TGF-β1致肾间质纤维化的潜在作用。     

MG-132对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化与凋亡的影响

目的：探讨蛋白酶体抑制剂MG-132对体外培养的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化和凋亡的影响及其机制。方法：体外培养HK-2细胞,随机分组：对照组,TGF-β1刺激组（5ug／L）,MG-132组（2．5μmol／L）,MG-132＋TGF-融组（MG-132 2.5μmol／L孵育30min后再加TGF-β1 5μg／L）。培养24h后收集细胞,RT-PCR法检测Smurf1、Smurf2和Smad7 mRNA的表达;Western免疫印迹检测Smurf1、Smurf2、Smad7和P-IκB-α和IκB-α蛋白表达;免疫组织化学检测胞浆中Fn和α-SMA的表达;Hoechst 33258染色免疫荧光检测细胞凋亡形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：TGF-β1刺激组HK-2 Smurf1、Smurf2 mRNA及蛋白表达水平较对照组高（P〈0．05）,但Smad7 mRNA及蛋白表达水平较对照组低（P〈0．05）,且胞浆中FN和α-SMA水平较对照组高（P〈0．05）。MG-132＋TGF-β1组与TGF-β1刺激组比较,Smurf1、Smurf2 mRNA表达降低（P〈0．05）,Smad7 mRNA略升高（P〉0．05）,而Srnad7蛋白明显升高（P〈0．05）,胞浆中Fn和α-SMA表达减少。MG-132组、MG-132＋TGF-β1组分别与对照组及TGF-β1组比较,P-IκB-α和IκB-α蛋白浓度升高,细胞凋亡率增加,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：MG-132可抑制TGF-132诱导的HK-2 Smurf1、Smurf2的表达,促进Smad7表达,抑制其降解,减轻FN和α-SMA的表达,从而抑制HK-2转分化;另-方面,MG132可能通过抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞NF-κB活化促进HK-2细胞凋亡。     

姜黄素保护大鼠肾小管上皮细胞对抗氧化应激引起的损伤作用

目的 探讨姜黄素对氧化应激诱导大鼠近端肾小管上皮细胞 (NRK-52E) 损伤作用的影响。 方法 用不同浓度的H2O2处理NRK-52E细胞,建立氧化应激损伤NRK-52E的实验模型。应用Hoechst 33258染色法观察凋亡细胞的形态学改变;PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western印迹法检测Bcl-2蛋白的表达。 结果 H2O2在100~500 μmol/L浓度范围内处理NRK-52E细胞24 h,呈浓度依赖性地增加细胞的凋亡率;500 μmol/L H2O2能显著抑制NRK-52E细胞Bcl-2的表达（P < 0.05）。20 μmol/L和40 μmol/L姜黄素能显著阻断H2O2对NRK-52E细胞的致凋亡作用[（32.9±8.1）%、（22.23±9.3）%比（72.7±10.5）%,均P < 0.05],并能显著拮抗H2O2对Bcl-2蛋白表达的下调作用（P < 0.05）。40 μmol/L姜黄素本身也能上调Bcl-2蛋白的表达（P < 0.05）。 结论 姜黄素能保护NRK-52E细胞对抗氧化应激引起的细胞凋亡,此肾小管上皮细胞保护作用可能与其抑制H2O2对Bcl-2蛋白表达的下调作用有关。     

大黄酸抑制肾间质成纤维细胞激活的实验研究

目的 研究大黄酸(Rhein)抑制转化生长因子β1(TGF-β1)激活大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F)作用及探讨大黄治疗肾脏病的作用机制。方法 以NRK-49F细胞为研究对象，采用细胞计数观察细胞生长，流式细胞仪分析细胞周期变化。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)作为细胞活化指标，同时检测纤连蛋白(FN)表达的水平以评价细胞外基质合成的变化。结果 TGF-β1具有促进NRK-49F增殖的作用，大黄酸呈时间依赖性和剂量依赖性抑制该增殖作用。TGF-β1能够促进NRK-49F进入S期和G2/M期，而经大黄酸作用的细胞主要是G0/G1期细胞。大黄酸呈剂量依赖性显著抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞α-SMA蛋白表达水平，同时，大黄酸还可减少TGF-β1诱导的NRK-49F细胞FN 蛋白的表达水平。结论 大黄酸能够阻止TGF-β1诱导的肾间质成纤维细胞由G0/G1期进入S期和G2/M期，抑制该细胞的增殖。同时，大黄酸还具有抑制TGF-β1激活肾间质成纤维细胞的作用，并拮抗TGF-β1导致的FN表达与合成。     

塞来昔布协同顺铂P13K/Akt途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 塞来昔布(50 μmol/L或100 μmol/L)和(或)顺铂(10 μg/ml)作用骨肉瘤MG-63细胞48 h后,MTT法测定细胞增殖的抑制率,电子显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测基因水平COX-2表达变化,Western blot检测COX-2及凋亡相关蛋白表达变化.P13K抑制剂Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测蛋白表达变化.结果 塞来昔布导致MG-63细胞阻滞在G1期,通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9的内源性凋亡途径诱导细胞凋亡;顺铂单药作用后骨肉瘤MG-63细胞凋亡率为5.93%,而联合应用塞来昔布50μmol/L或100 μmol/L后,凋亡率分别为6.66%和37.15%,与顺铂联合具有明显的协同作用;COX-2蛋白表达未降低.塞来昔布联合顺铂明显降低P13K/Akt、survivin、Bcl-2的表达,检测到caspase-9、caspase-3的激活和PARP裂解片段.Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测到pAkt(Thr308)、Bcl-2、survivin表达下调.结论 塞来昔布可通过非COX-2途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡,与P13K/Akt、survivin、Bcl-2蛋白相关,并且PI3K/Akt途径在survivin、Bcl-2表达调控中发挥重要作用.这可能是塞来昔布药物干预的中心环节.     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导骨肉瘤细胞凋亡及其对p27Kip1蛋白表达的影响

目的探讨蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO(MG132)对人骨肉瘤MG-63细胞诱导凋亡的作用及其对p27Kip1蛋白表达的影响。方法分别以不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG132培养p53突变型人骨肉瘤MG-63细胞、正常二倍体成纤维细胞WI-38和p53野生型人骨肉瘤U2OS细胞。通过MTT法检测不同培养时间的细胞增殖活力、琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡、流式细胞仪定量检测不同时间的细胞凋亡发生率、Westernblot检测p27Kip1表达情况。结果MG132能选择性抑制人骨肉瘤MG-63和U2OS细胞生长,IC50分别为(0.92±0.06)μmol/L及(0.33±0.05)μmol/L,均低于二倍体成纤维WI-38细胞(9.13±0.12)μmol/L。1μmol/LMG132处理MG-63细胞24h后,DNA琼脂糖凝胶电泳可检测到典型的“阶梯状”DNA条带,而WI-38细胞则为基因组DNA。流式细胞仪于1μmol/LMG132作用12h后检测到明显的亚G1峰(凋亡细胞峰),且存在时效关系。Westernblot发现,处理后p27Kip1蛋白表达明显上调。结论蛋白酶体抑制剂MG132在体外可选择性诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡。p27Kip1蛋白在诱导MG-63细胞凋亡中可能起重要作用。     

氯沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠肾小管上皮细胞氧化应激反应的作用

目的 探讨血管紧张素I型受体阻断剂氯沙坦对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠肾小管上皮细胞氧化应激反应及转化生长因子β1(TGF-β1)产生的影响。 方法 以大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E）为研究对象,分别给予氯沙坦（10-5 mol/L）和（或）NADPH氧化酶抑制剂联二亚苯碘锚（DPI,10-5 mol/L）预处理1 h后再加入AngⅡ（10-7 mol/L）刺激24 h,同时设立空白培养基作为对照组。实时定量PCR和Western印迹法分别检测4组细胞NADPH 氧化酶p22phox、p47phox、Nox-4 mRNA和蛋白水平及TGF-β1 mRNA水平。用2,7- 二氯荧光素双乙酸盐（H2DCF-DA）作为荧光探针,采用荧光分光光度仪检测细胞内活性氧（ROS）的水平。应用比色法测定细胞上清液中超氧化物歧化酶（SOD）水平。 结果 AngⅡ（10-7 mol/L）刺激细胞15 min后开始产生大量的ROS,至60 min达平台期。单纯AngⅡ刺激1 h后,NRK-52E细胞上清液中SOD水平显著低于对照组（27.31 μU/L 比48.29 μU/L,P < 0.01）;经氯沙坦预处理1 h后再加入AngⅡ刺激1 h细胞上清液中SOD水平升高至36.37 μU/L,与AngⅡ组差异有统计学意义（P < 0.01）。单纯AngⅡ刺激NRK-52E细胞24 h可显著上调NADPH氧化酶p22phox、p47phox和Nox-4 mRNA和蛋白水平,其mRNA水平分别为对照组的5.57倍、5.55倍和9.41倍（均P < 0.01）,蛋白水平分别为对照组的4.53倍、4.17倍和6.50倍（均P < 0.01）。经氯沙坦干预后,p22phox、p47phox和Nox-4 mRNA水平分别为对照组的2.71倍、2.18倍和5.23倍（均P < 0.01）,蛋白水平分别为对照组的3.20倍、2.30倍和4.30倍（均P < 0.01）。AngⅡ刺激细胞24 h后TGF-β1 mRNA表达也显著增多,为对照组的4.36倍（P < 0.01）,氯沙坦处理细胞后TGF-β1 mRNA水平为对照组的1.57倍。 结论 氯沙坦通过抑制NADPH氧化酶的表达和增加SOD的表达减少ROS的产生,并能通过减少ROS产生,抑制AngⅡ诱导的TGF-β1 mRNA水平增高。     

新型钌(Ⅱ)配合物抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖并诱导其凋亡

目的 通过体外实验探讨新型钌(Ⅱ)多吡啶配合物△-[Ru(phen)2MCMIP]2+(△-1)对人骨肉瘤细胞MG-63株增殖及凋亡作用. 方法 CCK-8法检测经0.00、12.50、25.00、50.00、100.00、150.00 μmol/L△-1作用24、48、72 h后,MG-63细胞的增殖情况;流式细胞术检测经0.00、25.00、50.00、100.00 μmol/L△-1作用24h后,MG-63细胞的凋亡及周期变化. 结果 △-1可明显抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖,并呈明显剂量和时间依赖性;24、48、72 h IC5o分别为57.80 μmol/L、45.27 μmol/L、32.51 μmol/L;流式细胞术检测得不同浓度△-1作用24h后,细胞早期凋亡比例从(1.06±0.12)％上升至(37.10±1.25)％,细胞周期被阻滞在Go/G1期. 结论 △-1能抑制MG-63细胞增殖,诱导细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在Go/G1期.     

脂氧素A4通过上调Smac表达诱导肾间质成纤维细胞凋亡

目的验证脂氧素A4(LXA4)是否诱导肾间质成纤维细胞凋亡,并探讨其作用机制是否与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caapase)第2个线粒体激活因子(Smac)表达上调有关。方法将大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F)培养于含5%胎牛血清的培养液中,用较高浓度的LXA4刺激后,应用吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色观察细胞凋亡形态,应用碘化丙锭/Annexin双染色及流式细胞仪计数凋亡的细胞,应用对硝基苯胺法测定caspase-3酶活性。应用Western印迹方法测定Smac表达,对NRK-49F细胞用脂质体转染Smac反义寡核苷酸,再观察LXA4处理后Smac表达、细胞凋亡的改变。结果LXA4在100nmol/L、1μmol/L的高浓度时,分别引起9.83%、33.82%的NRK-49F细胞发生凋亡、caspase-3活性升高、Smac表达上调。应用Smac反义寡核苷酸处理细胞后,可抑制LXA4所致的Smac表达与细胞凋亡。结论较高浓度的LXA4能够引起大鼠肾间质成纤维细胞发生凋亡,其机制与上调Smac表达有关。     

葛根素抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡

目的观察葛根素对吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡的影响。方法 MTT法检测不同浓度葛根素(0.01-100μmol/L)和吡格列酮(20μmol/L)作用于MC3T3-E1细胞24 h后细胞增殖活性影响。流式细胞仪测定葛根素和吡格列酮对MC3T3-E细胞凋亡的影响。Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax的表达情况。结果 1、与对照组相比,吡格列酮组的细胞增殖活性明显下降(P0.05),而0.1-10μmol/L葛根素组细胞增殖活性明显增强(P0.05)。2、与吡格列酮组相比,加入0.1-1μmol/L葛根素后细胞的增殖活性明显增强(P0.05)。3、加入1μmol/L的葛根素后,吡格列酮导致的细胞凋亡率上升受到抑制(P0.05)。4、吡格列酮处理后caspase-3、caspase-8、Bax蛋白的表达上调,Bcl-2蛋白的表达下调,而加入葛根素共同作用后,caspase-3蛋白表达下调,Bcl-2蛋白的表达上调。结论葛根素可以抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡。     

Effect and mechanism of cysteine-rich protein 61 on transforming growth factor -β1-activated renal fibroblasts

Objective To observe the expression of cysteine-rich protein 61 (Cyr61) in transforming growth factor -β1 (TGF-β1)-activated renal fibroblasts (NRK-49F), and to explore its effect and mechanism. Methods (1) NRK-49F cells were activated by TGF-β1 with different concentrations (0.0, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 μg/L). Western blotting was used to detect the expression of Cyr61 protein, and CCK-8 assay was used to test the proliferative activity of NRK-49F cells. (2) NRK-49F cells with low expression and over expression of Cyr61 were established by plasmid transfection. The cells were divided into control group (null vector transfection), over-expression group and low-expression group. The proliferation was discovered by CCK-8 assay after 24, 48 and 72 h. Further, 5.0 μg/L TGF-β1 activated these three groups. The proliferation was also discovered by CCK-8 assay and the cell cycle was analyzed by flow cytometry. The mRNA expressions of fibrosis markers (Col1α1, Col3α1, MMP9, MMP13) and factors of cell senescence signal pathway (p53, p21, Rb, p16) were ascertained by real time PCR, and the protein expressions of Col3 and MMP9 were detected by Western blotting. Results (1) Compared with 0.0 μg/L TGF-β1 group, the proliferation of NRK-49F cells was enhanced in 0.5, 1.0, 2.0 and 5.0 μg/L TGF-β1 groups (all P＜0.05), while the expression of Cyr61 protein was decreased in 1.0 μg/L group and increased in 5.0 μg/L group (all P＜0.05). (2) The proliferation of over-expression group was lower than that of control group after 24, 48 and 72 h (all P＜0.05), which was in a time-dependent manner. (3) Compared with control group activated by TGF-β1, the over-expression group expressed less fibrosis factors (Col1α1 and Col3α1) and more anti-fibrosis factors (MMP9 and MMP13) with decreased proliferation (all P＜0.05). Simultaneously, the proportion of cells bogged down in G1 phases, as well as the expressions of p53, p21 and Rb mRNA increased (all P＜0.05). The above effects of low-expression group were just opposite to over-expression group. Moreover, there was no significant difference in the expression of p16 gene among the three groups (P＞0.05). Conclusions Cyr61 can curb the proliferation and fibrotic phenotypes of fibroblasts, thereafter slowing down the process of renal fibrosis. The p53/p21/Rb interrelated cell senescence signal pathway may be involved in the anti-fibrosis process.     

Change of autophagy in the transforming growth factor-β1-induced activation of renal fibroblasts in vitro

Objective To explore the changes of autophagy in the transforming growth factor (TGF)-β1-induced activation of renal fibroblasts in vitro. Methods (1) NRK-49F cells were cultured with 10 μg/L TGF-β1 for different times (0, 12, 24 h) in vitro. Morphological changes of the cells were observed under inverted microscope. The protein expressions of α-smooth muscle actin (α-SMA) and typeⅠcollagen (ColⅠ) in NRK-49F cells were measured by Western blotting. (2) NRK-49F cells were cultured with 0, 2, 5, 10, 15, 20 μg/L TGF-β1 for 1 hour and with 10 μg/L TGF-β1 for different times (0 min, 7 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h) in vitro. The protein expressions of microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3), p62, total- mammalian target of rapamycin (t-mTor), phospho-mammalian target of rapamycin (p-mTor) and Beclin 1 were detected by Western blotting. (3) NRK-49F cells were cultured with 10 μg/L TGF-β1 for different times (0, 1, 4 h) in vitro after cultured with serum-free medium for 2.5 hours. The protein expressions of LC3 and p62 in NRK-49F cells were measured by Western blotting. Results (1) The morphology of NRK-49F cells changed from stellate to spindle shape after cultured with TGF-β1. The expressions of cell activation markers α-SMA and ColⅠgradually increased as the extend of stimulation time (all P＜0.05). (2) TGF-β1 transiently increased the expressions of autophagy proteins p62 (peak value appeared after 4 h) and p-mTor (peak value appeared after 30 min), while decreased Beclin1 expression level (all P＜0.05). (3) TGF-β1 decreased the protein expression of LC3-Ⅱ in NRK-49F cells cultured with serum-free medium, whereas increased the protein expression of p62 at the same time (all P＜0.05). Conclusions The autophagy activity of renal fibroblasts is inhibited by the TGF-β1-induced cellular activation in vitro, which may contribute to the progression of renal interstitial fibrosis.     

5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡机制影响的初步探讨

目的拟观察5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和β转化生长因子（transforming growth factor-β,TGF-β）Ⅰ型受体以及细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法（1）瘢痕疙瘩组织成纤维细胞原代培养,取4～6代传代细胞加入5个不同浓度（10,20,40,80,160μmol／L）5-氟尿嘧啶干预24,48,72h。（2）利用四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力。（3）应用蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测各组瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad7和TGF-βI型受体的表达及对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果（1）MTT实验中,当5-氟尿嘧啶浓度为10,20μmol／L作用24h时,未发现成纤维细胞死亡,与空白对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）;其他浓度下作用各组成纤维细胞死亡现象差异均有统计学意义（P〈0．01）。（2）免疫印迹法实验结果如下：①与空白对照组相比,TGF-βI组Smad7表达明显减弱,TGF-βI型受体表达则显著增强,差异有统计学意义（P〈0．01）。②加入5-氟尿嘧啶干预后可显著增强Smad7的表达,差异有统计学意义（P〈0．01）。③经不同浓度5-氟尿嘧啶干预后,实验组Bcl-2蛋白表达均低于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。但实验组Bax蛋白表达均高于对照组（P〈0．05）,TGF-βI型受体表达无明显影响,差异均无统计学意义（P〉O．05）。结论5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。     

蛋白酶体抑制剂MG-132对胃癌细胞株作用的实验研究

目的:探讨蛋白酶体抑制剂MG-132阻断泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)对体外胃癌细胞增殖的抑制作用及其相关机制。方法:将不同浓度的MG-132加入胃癌细胞株SGC-7901中,观察细胞形态变化,并应用MTT法测定细胞抑制效应,流式细胞仪检测细胞凋亡,免疫组化法检测P27kip1的表达。结果:MG-132对胃癌细胞增殖具有显著的抑制作用,瑞氏染色显微镜观察MG-132作用于胃癌细胞后,可见细胞出现细胞质、核仁消失,染色质固缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割及大量凋亡小体。5.0μmol/L的MG-132作用24、48h后的凋亡率分别为(16.7±5.1)%和(72.8±16.4)%。免疫组化显示,胃癌细胞在5.0μmol/L的MG-132作用48h后明显表达P27kip-1。结论:MG-132能显著抑制胃癌细胞的增殖,诱导其凋亡。其机制可能为通过上调抑癌蛋白P27kip-1水平而起到抗肿瘤作用。     

Smad核转录共抑因子在人近端小管上皮细胞转分化中的表达及作用

目的：观察Smad核转录共抑因子（SnoN）在TGF-β1致人近端小管上皮细胞转分化过程中的表达,探讨SnoN蛋白对TGF-β1所致的小管上皮细胞转分化的作用。方法：体外培养的人近端小管上皮细胞（HK-2）,随机分为正常对照组、TGF-β1（5ng/ml）组和TGF-β1（5ng/ml）＋MG-132（5μmol/ml）组。Western-blot检测细胞中SnoN蛋白水平的改变和Smad2/3磷酸化水平的改变;半定量RT-PCR方法观察细胞中SnoN mRNA表达的改变。免疫荧光检测间充质细胞标记物α-SMA的表达。结果：Western-blot的结果显示：（1）TGF-β1作用于细胞,SnoN蛋白表达迅速减少,10min为对照组的38%,并呈时间依赖进行性减少,60min较0min降低89%（P〈0.01）,24h有所恢复但仍较0min明显降低（P〈0.01）;TGF-β1＋MG-132组中SnoN蛋白表达与对照组差异无统计学意义,与TGF-β1组相比,SnoN蛋白水平明显上调。（2）半定量RT-PCR显示：TGF-β1作用于细胞后,与SnoN蛋白表达不同,SnoN mRNA迅速升高,60min其表达增高近1倍（与0min比较,P〈0.01）;TGF-β1＋MG-132组中SnoNmRNA的表达与TGF-β1组差异无统计学意义。（3）TGF-β1诱导细胞10min即可引发Smad2/3磷酸化（与0min比较,P〈0.01）,随着作用时间的延长,细胞中磷酸化的Smad2/3蛋白表达水平逐渐升高,TGF-β1＋MG-132组中,Smad2/3磷酸化蛋白的表达减少80%（P〈0.01）。（4）TGF-β1作用于细胞24h后免疫荧光检测到重新表达的α-SMA,TGF-β1＋MG-132组α-SMA的表达被抑制。结论：TGF-β1可诱导SnoNmRNA表达上调,但SnoN蛋白的表达遭遇泛素系统的降解显著减少,SnoN蛋白水平的下调可能是TGF-β1导致小管上皮细胞纤维化作用的必要条件。     

肝细胞生长因子下调Smurf2拮抗肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化

目的 通过观察肝细胞生长因子( HGF)对正常大鼠肾上皮细胞(NRK-52E)转化生长因子β1( TGF-β1)诱导的Smad泛素化调节因子2(Smurf2)表达的影响,探讨HGF拮抗肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)的分子机制.方法 以NRK-52E细胞为研究对象,给予TGF-β1(5μg/L)处理0～24 h;或部分细胞经HGF(20 μg/L)预处理30 min后,再予TGF-β1(5μg/L)处理1h或48 h;另外部分细胞予以Smurf2质粒表达载体或Smurf2 siRNA 转染24 h后,再予HGF处理24 h.应用Western印迹及间接免疫荧光染色方法检测Smurf2、SnoN、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白(FN)的表达.结果 与对照组相比,TGF-β1处理后迅速上调NRK-52E细胞中Smurf2蛋白表达(P＜0.01);同时显著诱导FN和α-SMA蛋白表达,并下调E-cadherin表达.而予HGF预处理细胞后,可快速抑制TGF-β1诱导的Smurf2表达上调(P＜0.01);并逆转TGF-β1介导的SnoN(P＜0.01)、E-cadherin(P＜0.05)、α-SMA(P＜0.01)和FN(P＜0.01)表达变化.此外,在NRK-52E细胞中过表达Smurf2蛋白可部分抑制HGF诱导的SnoN蛋白上调;而抑制Smurf2表达则可进一步促进HGF诱导的SnoN蛋白表达.结论 在肾小管上皮细胞中,HGF可能通过下调Smurf2表达抑制SnoN蛋白发生泛素-蛋白酶体依赖性降解,进而拮抗TGF-β1介导EMT形成.     

复方鳖甲软肝片方对TGF-β1诱导的肾间质成纤维细胞增殖及分泌细胞外基质的影响

目的：观察中药“复方鳖甲软肝片方”对TGF-β1诱导的肾间质成纤维细胞（NRK-49F）增殖及分泌细胞外基质的影响。方法：以2 ng/ml hTGF -β1诱导 NRK -49F 细胞,并以软肝片方大、中、小剂量（分别以7g/kg、3.5 g/kg、1.75 g/kg）药物血清进行干预,分别应用MTT法、ELISA、免疫细胞化学方法,观察肾间质成纤维细胞增殖、细胞上清FN浓度及ColⅠ、ColⅢ的表达。结果：软肝方含药血清对hTGF-β1诱导的细胞增殖无影响;但大、中剂量软肝方能不同程度地降低FN的分泌及ColⅠ、ColⅢ的表达,软肝方大剂量组作用最强（P〈0.01）。结论：复方鳖甲软肝片方在一定程度上抑制TGF-β1诱导的肾间质成纤维细胞ColⅠ或ColⅢ的表达,大剂量软肝方作用最强。     

17β-雌二醇联合5-氮胞苷上调前列腺癌22RV1细胞p75NTR表达并促进凋亡的研究

目的 探讨17β-雌二醇(E2)联合DNA去甲基化试剂5-氮胞苷(5-AzaC)对雄激素非依赖性前列腺癌22RV1细胞生长抑制和凋亡的影响及作用机制. 方法 应用17β-E2和/或5-AzaC 处理前列腺癌22RV1细胞,并检测细胞生长抑制率、凋亡率以及雌激素受体2(ESR2)和p75神经生长因子受体(p75NTR)的表达情况. 结果 17β-E2或5-AzaC呈时间及浓度依赖性抑制22RV1细胞增殖,17β-E2和5-AzaC 48 h IC50分别是0.2 μmol/L和4.0 μmol/L.17β-E2(0.2 μmol/L)+5-AzaC(4.0 μmol/L)对22RV1细胞的增殖抑制及凋亡表现出协同作用,17β-E2或5-AzaC均能上调ESR2和p75NTR的mRNA及蛋白的表达,且联合应用时效果更明显. 结论 联合应用 17β-E2和5-AzaC上调ESR2和p75NTR的表达可能是雄激素非依赖性前列腺癌治疗的一个潜在的治疗策略.