人抵抗素基因全长的体外拼接及真核表达载体的构建

目的:利用合成的寡核苷酸片段,在体外拼接人抵抗素(Resistin,Retn)基因的全长,并构建其真核表达载体。方法:根据已知抵抗素基因(GenBank:AF323081),设计并合成10条寡核苷酸片段,采用降落PCR方法进行拼接,获得预期大小的PCR产物后将其克隆入pSecTag2B载体进行测序确认。结果:降落PCR法扩增的特异条带与目的基因的大小一致。克隆载体测序结果与GenBank中已知序列完全符合。结论:降落PCR成功地拼接和扩增了人抵抗素全长基因,并构建了含有该基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础。     

改良的降落PCR扩增中国地鼠目的基因

目的优化PCR程序，尝试用降落PCR扩增中国地鼠目的基因。方法设计了4对引物，用普通PCR和改良的降落PCR扩增中国地鼠COX1、COX2、NADH5、NADH6部分基因。结果普通PCR只有1对引物扩增出特异性条带，而降落PCR4对引物都扩增出特异性条带，并与中国地鼠目的基因大小一致。结论降落PCR省略了常规PCR中摸索最适退火温度的过程，对中国地鼠一些Tm值相近的基因可以使用降落PCR温度程序扩增，是一种行之有效的PCR方法。     

小鼠可溶性ST2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆小鼠可溶性ST2基因并构建其真核表达载体。方法:从小鼠肥大细胞株P815中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠可溶性ST2基因全长编码区,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mST2,然后进行酶切鉴定和序列分析。结果:小鼠可溶性ST2基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠可溶性ST2基因的全长编码序列为1 011 bp,编码336个氨基酸。结论:用热启动PCR技术能方便、准确地获得目的基因片段。成功地克隆小鼠可溶性ST2基因并构建了其真核表达载体,为进一步进行小鼠可溶性ST2蛋白的表达和功能研究奠定了基础。     

X-连锁肾上腺脑白质营养不良分子诊断中排除假基因干扰的一个新方法

目的:探讨X-连锁肾上腺脑白质营养不良分子诊断中排除假基因干扰的新方法。方法:应用长链RT-PCR技术扩增3个X-连锁肾上腺脑白质营养不良患者的ABCD1基因编码区全长,再分4个片段进行二次PCR,并对PCR产物直接测序;应用巢式PCR对ABCD1基因相应区域进行扩增,其中第一轮PCR产物覆盖ABCD1基因从外显子6至3′非编码区的一个大片段,并对PCR产物进行测序,分析患者的基因组DNA,进一步确证其ABCD1基因突变。结果:在3个XALD患者的ABCD1基因上,存在3个不同的碱基改变(2235C>T,2065C>T和2190A>T),分别造成2个错义突变(R617C和P560L)和1个无义突变(K602X)。结论:应用巢式PCR能快速、有效地排除X-ALD分子诊断中ABCD1假基因的干扰。     

巢式PCR-RFLP法检测Cystatin C基因多态性的实验研究

目的 建立检测高GC含量的CST3基因多态性的巢式PCR-RFLP方法.方法 以巢氏PCR方法扩增CST3基因5'端和外显子1的特异性片段,用RFLP方法分析该基因的多态性.结果 应用Enhancer System,以巢氏PCR方法能高效扩增出高GC含量的CST3基因5'端和外显子1区的特异性片段,用Sac Ⅱ限制性酶切对CST3基因多态性进行有效分析.结论 该方法能准确、高效的对CST3基因多态性进行分析,研究结果对高GC含量基因的研究有借鉴价值.     

RT-SHIV rt基因单拷贝PCR扩增方法的建立及初步应用

目的建立RT-SHIV病毒全长rt基因单拷贝PCR扩增方法,用于HIV-1 rt基因体内遗传与变异研究。方法 Oligo软件设计RT-SHIV rt基因特异性扩增引物,梯度稀释方法进行特异性和灵敏度筛选,进而优化退火温度和PCR反应最佳循环数等条件,建立rt基因PCR扩增方法;在此基础上将模板进行有限稀释,摸索rt基因单拷贝PCR扩增条件;使用该方法扩增感染猴体内RT-SHIV病毒rt基因,BioEdit软件进行基因序列分析。结果筛选得到一组巢式PCR引物,成功建立了RT-SHIV rt基因PCR扩增方法;当模板浓度为100 copies/μL时,扩增产物为单拷贝序列;测序结果显示RT-SHIV感染猴d266和d294血浆样本分别存在1处和6处氨基酸突变。结论本研究建立的全长rt基因单拷贝PCR扩增方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可以应用于各类RT-SHIV病毒的全长rt基因分析。     

限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究

目的 建立甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法,研究原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态.方法 针对P16基因启动子区富含CpG的序列,设计3条引物,进行半巢式降落PCR扩增,检测原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态;并将P16基因启动子区340 bp片段克隆到pMD18-T载体,E.coli JM109扩增此质粒后经CpG甲基化酶M.Sss Ⅰ处理,再用Hpa Ⅱ酶切验证获得P16基因启动子区甲基化阳性的质粒P16Pm 并进行特异性和灵敏度实验.以此甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法检测40例人原发性肝癌和3例正常人肝组织DNA样品的P16基因启动子区甲基化状态.结果 所采用的Hpa Ⅱ酶切后半巢式PCR方法的特异性强,灵敏度达100 fg;对40例人原发性肝癌组织DNA样品P16基因的启动子区甲基化状态检测显示甲基化阳性率为30%(12/40),3例正常人肝组织均为阴性(0/3).结论 P16抑癌基因启动子区甲基化可能与肝癌发生发展有关.本实验方法简便、成本低廉,并有高度的特异性与灵敏度,在大规模检查中有实际应用价值.     

激光捕获显微切割-单细胞PCR技术的应用研究

目的 建立一套优化的激光捕获显微切割-单细胞聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术,应用于分子组织学研究中单细胞基因的检测.方法 从淋巴结反应性增生冷冻组织切片中,应用激光捕获显微切割获取1-10个淋巴细胞,采用优化的单细胞PCR反应体系和条件进行β-珠蛋白基因检测.结果 单轮常规 PCR 各组多细胞的扩增阳性率比较无显著性差异(P>0.05),而单细胞的扩增阳性率低于各组多细胞,有显著性筹异(P<0.01);半巢式降落式PCR的单细胞扩增阳性率高于单轮常规PCR,有显著性差异(P<0.01).结论 联合应用优化的激光捕获显微切割及半巢式降落式PCR技术,显著提高了单细胞PCR的敏感性、特异性和稳定性.     

盐藻cbr基因启动子及其3''''-非翻译区序列的克隆

目的：克隆盐藻cbr基因启动子和3‘-非翻译9(3‘-UTR)片段。方法：设计2对引物，通过2轮巢式PCR反应，扩增cbr基因启动子，其中首轮PCR反应使用改良的降落PCR程序，第二轮巢式PCR反应的模板是第一轮PCR产物，使用普通PCR程序；cbr基因3‘-UTR片段的克隆采用一对引物，通过一般PCR程序得到。结果：通过巢式PCR得到长约1．1kb的cbr基因启动子片段，DNA测序结果表明碱基序列与文献记载完全相同，无任何碱基突变；克隆的长0．3kh的chr基因3‘-UTR片段经人工比较，与收录的序列吻合，无碱基突变。结论：利用普通Taq酶对用PCR方法克隆得到了盐藻胡萝卜素生物合成相天基因cbr的2个基因表达渊控序列；结合使用巢式PCR和改良降落PCR，可以非常有效地克隆具有复杂二级结构的DNA片段；通过两端人工添加的限制序列．将cbr基因启动子和3‘-UTR2个调控片段构建到同一个载体上，形成cbr基因表达盒，为构建转基因盐藻表达载体打下了基础。     

HIV-1基因PR区和RT区基因耐药突变检测之PCR-测序法的建立与评价

目的应用巢式PCR和Sanger测序技术,建立一种人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 pol基因蛋白酶(PR)区及逆转录酶(RT)区耐药突变检测的方法。方法根据HIV-1 pol基因保守区域设计特异性的2对扩增引物和6条测序引物,使用巢式PCR特异性扩增HIV-1 PR区以及RT区耐药突变基因序列,进而对靶标基因区域进行双向Sanger测序检测,实现了HIV-1基因PR区和RT区基因耐药突变检测的高灵敏性、特异性、准确性。结果本研究所建立的针对HIV-1 pol基因PR区和RT区耐药突变的检测方法,巢式PCR结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定有清晰、单一条带,符合扩增产物大小,其Sanger测序检测的HIV-1 PR区以及RT区耐药突变基因序列分析结果与HIV-1耐药性分析国家参考品一致。灵敏度:1×103copies/mL浓度的标准品重复测20次,检出率为100%;突变率检测:20%突变率的样本20个重复检测均100%为突变型;特异性验证:检测HBV、HCV、EBV血清样本,均为阴性。结论本研究建立的以巢式PCR和Sanger测序相结合的检测方法,具有灵敏度高、准确性高、结果可靠等优点,适用于HIV-1pol基因PR区以及RT区耐药突变的体外检测。