中药提取物对人免疫缺陷病毒逆转录酶抑制作用的研究

人免疫缺陷病毒(HIV,艾滋病毒)逆转录酶是人免疫缺陷病毒复制的关键酶,也是目前国际上筛选抗HIV药物的主要目的靶之一。本文研究了三十三种中药复方、提取物、成份药对HIV逆转录酶的作用,发现MBAA、MBAH_1、MBAH_2、檞寄生黄酮、白毛夏枯草黄酮、马兜铃酸、虎杖提取物、田七粉等对HIV逆转录酶有较强的抑制作用。对效果最强的MBAA的成份药MBAA9045作了酶抑制动力学研究,证实MBAA9045为HIV逆转录酶的非竞争性抑制剂。同时,将MBAA9045与HIV逆转录酶抑制剂PFA等作了比较,发现MBAA9045对HIV逆转录酶的抑制作用低于PFA,与suramine接近,IC_(50)为22μmol/L。     

柯萨奇B组病毒逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

根据柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）基因组５’非编码区核苷酸序列，选用了一对组特异性引物，用于逆转录聚合酶链反应检测ＣＢＶ－ＲＮＡ。结果显示该法可检出ＣＢＶ１～６型ＲＮＡ，灵敏度为１０ＰＦＵ，不能检出其他病毒ＲＮＡ。采用的碘化钠－异硫氰酸胍－氯仿法提取ＣＢＶ－ＲＮＡ与传统的蛋白酶Ｋ－酚－氯仿法及异硫氰酸胍－酚－氯仿法比较，具有快速、简便、稳定、可靠的特点。应用该法检测ＣＢＶ－５感染鼠外周血ＲＮＡ，第３ｄ即为阳性，提示本法可用于ＣＢＶ感染的早期诊断     

表没食子儿茶素没食子酸酯对呼吸道合胞病毒的抑制作用

目的:为探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)体内和体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)作用。方法:在体外以不同浓度的EGCG分别作用于RSV复制周期的3个阶段,用CPE法观察EGCG抑制RSV的致细胞病变作用,用MTT法检测EGCG作用RSV的病毒抑制率;在体内建立RSV感染的BALB/c小鼠的动物模型,通过观察肺外观和HE染色镜下观察、计算肺指数、实时定量RT-PCR检测RSV核酸水平和空斑试验检测肺组织匀浆病毒滴度,探讨EGCG对RSV感染的保护作用。结果:在体外,EGCG对RSV有抗生物合成作用和预防作用,但是无直接杀伤作用。在体内,口服EGCG能够减少RSV感染的BALB/c小鼠肺组织病变程度,肺指数、RSV核酸水平表达和病毒滴度较RSV组明显降低。结论:EGCG在体内外均具有较好的抗RSV感染与复制作用。     

猴免疫缺陷病毒荧光定量聚合酶链反应检测标准品的体外合成

【目的】合成猴免疫缺陷病毒(SIV)荧光定量检测标准品,并总结出核糖核酸(RNA)标准品体外合成的基本原则。【方法】首先寻找到SIV保守序列,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆于T载体,测序,然后在所测得的SIV序列中进一步寻找保守序列,设计带有T7启动子的引物,PCR扩增,将所获得的PCR产物凝胶回收纯化,用T7RNA聚合酶进行体外合成RNA,再用PCR和电泳检测验证。【结果】通过数次引物调整,最终成功合成了SIV荧光定量PCR标准品。【结论】SIV荧光定量标准品的成功合成必须遵守以下4条基本原则:①必须选择保守序列;②在选择保守序列之后还需要搜索是否含有较多潜在的终止密码或者起始密码,设计引物使这些中止或起始密码排除在PCR目标产物之外;③必须注意将启动子(如T7启动子)挂在适当的引物上,以保证所合成的RNA模板与所要定量检测的RNA模板一致,而不是互补;④合成好RNA后必须检测,以保证不含其他RNA或者未消化完毕的DNA。     

水芹总酚酸对人类免疫缺陷病毒逆转录酶的抑制作用

目的探讨水芹总酚酸对人类免疫缺陷病毒（HIV）逆转录酶的影响作用。方法将水芹总酚酸和阳性对照药奈韦拉平用磷酸盐缓冲液（PBS）和二甲基亚砜（DMSO）分别配制成10、1、0.1mg／L和50（13．32mg／L）、10（2．66mg／L）、μmol／L（0．27mg／L）的药液,加入Oligo（dT）15包被板中,最终用酶标仪测定405nln波长处OD值,计算各加药组OD值,空白对照组OD值,判断药物对HIV逆转录酶的影响。结果与空白对照组相比,水芹总酚酸对HIV逆转录酶活性有较强的抑制作用,高、中、低剂量组的OD值分别为（0．316±0．033）、（0．442±0．044）、（0．627±0．009）;平均抑制率分别为85．20％、73．67％和55．83％,具有良好的量效关系（P〈0．01）。阳性药奈韦拉平50μmol／LOD值为（0．245±0．017）,平均抑制率为94．36％（P〈0．01）。结论水芹总酚酸对HIV逆转录酶有比较显著的抑制作用。     

保妇康栓对人乳头状瘤病毒抑制作用的实验研究

目的:探讨中药制剂保妇康栓对人乳头状瘤病毒(HPV)16亚型的抑制作用。方法:以不同浓度的含保妇康栓培养基体外培养宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8,相差显微镜下观察活细胞形态学变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法以及流式细胞术技术检测不同浓度保妇康栓对细胞增殖的影响;应用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测人乳头状瘤病毒HPV16亚型E6E7的表达。结果:不同浓度的保妇康栓可以抑制细胞的增殖;在药物作用下,CaSki细胞G1期细胞增加(P<0.05),G2、S期细胞减少(P<0.05),CaSki细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),而对H8细胞周期和凋亡率影响不明显;两种细胞HPV16E6E7基因片段mRNA表达均明显低于对照组(P<0.01)。结论:保妇康栓在体外抑制宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8增殖,其机制可能是通过抑制HPV16E6E7表达而抑制肿瘤细胞生长。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶活力测定及临床意义

采用特异性免疫沉淀法检测血清中HBV DNAP活力216例,结果:HBeAg和抗-HBcIgM阳性组的HBV DNAP检出率和活力水平明显高于阴性组(P<0.01);且随HBsAg的滴度升高而升高。在各类乙型肝炎病人中DNAP检出率依次为;重症肝炎和急性肝炎>肝硬化和慢性潘动性肝炎>慢性迁延性肝炎和携带者。抗-HBe阳性组和HBeAg、抗-HBe均阴性组各有25％、54.71％可测到DNAP活力。证明HBV DNAP活力测定是乙型肝炎早期诊断、病毒在体内复制及是否具有传染性的灵敏指标。     

聚酯型儿茶素对人肝癌细胞生长的抑制作用及其机制

目的:探讨聚酯型儿茶素对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制作用及其机制。方法:应用MTT法、集落形成试验、同位素掺入试验、细胞内cAMP/cGMP浓度测定、原位杂交等方法进行检测。结果:50mg·L~(-1)聚酯型儿茶素对SMMC-7721细胞的生长、集落形成有明显的抑制作用;~3H-TdR、~3H-Leu掺入试验证明其可明显抑制细胞DNA和蛋白质合成;聚酯型儿茶素作用后,SMMC-7721细胞内cAMP及cGMP浓度明显增加,细胞的c-myc基因mRNA水平表达明显降低,而p53基因mRNA水平表达明显升高。结论:聚酯型儿茶素对肝癌SMMC-7721细胞的生长有明显的抑制作用,此作用与其抑制细胞DNA和蛋白质合成、升高细胞内cAMP浓度和抑制c-myc基因表达、增强p53基因表达有关。     

人端粒酶逆转录酶核心启动子的克隆

目的克隆出人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子,为构建hTERT核心启动子调控的重组腺病毒提供实验基础。方法提取肝癌细胞HepG2基因组DNA作为模板,进行PCR扩增,扩增产物酶切后亚克隆至pcDNA3.1（＋）质粒。对重组体进行酶切和测序鉴定。结果PCR扩增出约250 bp的目的片段,经酶切和测序鉴定表明质粒构建成功。结论hTERT核心启动子的成功克隆,为进一步实验提供了基础。     

羊开口提取物的分离及对艾滋病毒逆转录酶和DNA多聚酶活性的抑制作用

羊开口经提取分离为Ｙ－１、Ｙ－Ｐ、Ｙ－Ａ、Ｙ－Ｅ、Ｙ－Ａ－１和Ｙ－Ａ－１和Ｙ３～１１等部分,通过其对艾滋病毒逆转录酶（ＨＩＶ－ＲＴ）和ＤＮＡ多聚酶（ＤＮＡＰｏｌ）活性试验,发现Ｙ－１、Ｙ－Ａ、Ｙ－Ａ－１、Ｙ－９和Ｙ－１１有极强的抑制酶活性作用。５０％酶活性抑制浓度（ＩＣ５０）对ＨＩＶ－ＲＴ分别为０．１～０．５μｇ／ｍｌ,对ＤＮＡｐｏｌα为０．５～２．５μｇ／ｍｌ。ＨＩＶ－ＲＴ的抑制率当浓度Ｙ－Ａ、Ｙ－Ａ－１２．５μｇ／ｍｌ,Ｙ－９、Ｙ－１１２μｇ／ｍｌ和Ｙ－１５μｇ／ｍｌ时分别为９９．３７％,９３．３５％,９８．２４％,９９．９２％和９０．０％：ＤＮＡｐｏｌα的抑制率当Ｙ－Ａ、Ｙ－９、Ｙ－１１的浓度为２．５μｇ／ｍｌ和Ｙ－１浓度为５μｇ／ｍｌ时,分别为９５．４５％,９３．３３％,９３．０１％和９９．１１％。结果提示羊开口中存在抑制ＨＩＶ－ＲＴ和ＤＮＡｐｏｌα的物质。     

羊开口提取物的分离及对艾滋病毒逆转录酶和DNA多聚酶活性的抑制作用

羊开口经提取分离为Ｙ－１、Ｙ－Ｐ、Ｙ－Ａ、Ｙ－Ｅ、Ｙ－Ａ－１和Ｙ－Ａ－１和Ｙ３～１１等部分，通过其对艾滋病毒逆转录酶（ＨＩＶ－ＲＴ）和ＤＮＡ多聚酶（ＤＮＡＰｏｌ）活性试验，发现Ｙ－１、Ｙ－Ａ、Ｙ－Ａ－１、Ｙ－９和Ｙ－１１有极强的抑制酶活性作用。５０％酶活性抑制浓度（ＩＣ５０）对ＨＩＶ－ＲＴ分别为０．１～０．５μｇ／ｍｌ，对ＤＮＡｐｏｌα为０．５～２．５μｇ／ｍｌ。ＨＩＶ－ＲＴ的抑制率当浓度Ｙ－Ａ、Ｙ－Ａ－１２．５μｇ／ｍｌ，Ｙ－９、Ｙ－１１２μｇ／ｍｌ和Ｙ－１５μｇ／ｍｌ时分别为９９．３７％，９３．３５％，９８．２４％，９９．９２％和９０．０％：ＤＮＡｐｏｌα的抑制率当Ｙ－Ａ、Ｙ－９、Ｙ－１１的浓度为２．５μｇ／ｍｌ和Ｙ－１浓度为５μｇ／ｍｌ时，分别为９５．４５％，９３．３３％，９３．０１％和９９．１１％。结果提示羊开口中存在抑制ＨＩＶ－ＲＴ和ＤＮＡｐｏｌα的物质。     

不同年龄正常人外周血淋巴细胞端粒酶催化亚单位的表达

目的:探讨不同年龄正常人外周血淋巴细胞端粒酶催化亚单位(hTERT)的表达规律。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及凝胶成像技术,检测105例20岁以上不同年龄正常人外周血淋巴细胞的hTERT表达的相对水平。结果:hTERT表达的相对水平在各年龄组分别为:20～29岁,0.557±0.190;30～39岁,0.600±0.360;40～49岁,0.723±0.206;50～59岁,0.498±0.213;60～69岁,0.626±0.203;70～79岁,0.524±0.340;≥80岁,0.702±0.214;各组间差异无显著性(P>0.05)。结论:正常人外周血淋巴细胞中端粒酶催化亚单位水平与年龄无明显相关性,提示端粒酶调控可能既有转录水平也存在转录后因素。     

人类端粒酶逆转录酶基因的反义寡核苷酸对HeLa细胞的端粒酶活性的研究

目的：研究人类端粒酶逆转录酶RNA(hTR)的反义寡核苷酸对HeLa细胞端粒酶活性的影响。方法：采用PCR-ELISA法检测Hela细胞在反义寡核甘酸处理前后端粒酶活性的变化。结果：经反义寡核苷酸处理后,HeLa细胞的生长受到抑制,端粒酶活性明显降低。结论：hTR的反义寡核苷酸显抑制肿瘤细胞的端粒酶活性,为恶性肿瘤治疗提供了一条新的有效的途径。     

骨肉瘤细胞中端粒酶逆转录酶mRNA的表达及意义

目的研究不同骨肉瘤细胞中人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA成分的表达情况。方法用全基因组芯片检测人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SAOS-2及人成骨细胞hFOB1．19中hTERTmRNA表达;用逆转录PCR、实时定量PCR法检测人宫颈癌细胞株HeLa、人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SAOS-2及人成骨细胞hFOBl．19中hTERTmRNA表达。结果全基因组芯片法显示MG-63、SAOS-2、U2-OS、hFOB1．19细胞系中hTERTmRNA表达强度分别为0．9、-0．1、-0．8、11．4,各细胞系均处于相对低表达水平;荧光实时定量PCR法显示MG-63、Hela细胞系中hTERTmRNA相对表达水平分别为1．00±0．08和2．13±0．11,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论hTERTmRNA在骨肉瘤各细胞系中表达率较低,端粒延伸替代机制可能在骨肉瘤端粒维持方面发挥重要作用。