血小板衍生膜微粒对内皮细胞增殖及血管生成的影响

目的探讨血小板衍生膜微粒（PMP）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的影响。方法在血小板悬液中加1.0U/ml的凝血酶,37℃下作用10min后,800g离心20min,取上清,17000g离心分离出PMP,采用BCA法测定PMP含量（以蛋白含量计）,将HUVEC与不同浓度的PMP和血管内皮细胞生长因子（VEGF）共同孵育培养24h后,采用MTT法测定细胞增殖;将20μl的PMP（40μg/ml）和VEGF（10μl/ml）分别接种于CAM上,孵育72h后,观察PMP对CAM血管生成的影响。结果HUVEC的增殖与PMPs呈剂量依赖关系,在培养液中添加40μg/mlPMP时,HUVEC增殖是空白对照组的（1.83±0.33）倍;而VEGF（10μl/ml）组HUVEC的增殖是空白对照组的（1.91±0.47）倍,两者相比差异无显著性（P〉0.05）。PMP组及VEGF组在接种点周围可见不同程度放射状密集生长的血管网,而对照组无特异性密集血管生成。PMP组及VEGF组的CAM血管分支点数分别为112.5±11.3、128.4±10.0,均显著高于空白对照组82.6±8.1。结论PMP可促进人脐静脉内皮细胞的增殖和CAM血管的生成。     

恒磁场对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的　研究不同强度的恒磁场对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。方法　体外培养的第 3代人脐静脉内皮细胞 ,分为对照组及不同剂量磁场组。各剂量磁场作用组的磁感应强度分别为 0 .0 5mT、0 .1mT、1mT、10mT、30mT、60mT和 10 0mT ,磁场作用时间均为 48h。用3H TdR法及MTT法测定细胞增殖。结果　 0 .0 5mT组细胞增殖显著高于对照组 (0 .2 92± 0 .0 10对 0 .2 2 0± 0 .0 0 8,P <0 .0 5 ) ;0 .1mT组细胞增殖与对照组相比无明显差异 (0 .2 31± 0 .0 0 9对 0 .2 2 0± 0 .0 0 8,P >0 .0 5 ) ;其余剂量组细胞增殖均显著低于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　 0 .0 5mT的恒磁场可以促进人脐静脉内皮细胞的增殖     

重组腺病毒Ad-Endo对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究人内皮抑素(endostatin,Endo)对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响.方法:利用腺病毒载体系统AdEasy-1及AAV 293细胞构建并包装出携带Endo基因的重组腺病毒Ad.Endo,感染人脐静脉内皮细胞ECV 304,Western-blot检测Endo蛋白表达,流式细胞术及Hochest 33258染色检测ECV 304细胞凋亡情况,并绘制细胞生长曲线.结果:病毒感染48 h后检测到Endo蛋白表达,ECV 304细胞在Ad-Endo感染后细胞增殖受到抑制.流式细胞术及Hochest 33258染色均检测到细胞凋亡增加.结论:重组腺病毒Ad-Endo在体外可抑制ECV 304细胞的增殖并诱导细胞凋亡.这可能是Endo抑制血管生成的重要机制.     

骨桥蛋白靶向干扰RNA对体外人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:观测骨桥蛋白靶向干扰RNA对体外人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和凋亡的影响.方法:体外化学合成骨桥蛋白序列特异性的短发夹RNA(shRNA)质粒载体与阳离子脂质体结合介导转染HUVEC,同时设计空白载体转染对照和空白对照,用MTT法等方法检测各组HUVEC生长增殖情况的变化,并用流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果:OPN-shRNA载体转染HUVEC后明显抑制细胞增殖(P＜0.05)和使细胞分裂周期出现阻滞,凋亡二倍体数量增加,凋亡率显著升高(P＜0.05).结论:骨桥蛋白靶向干扰RNA在体外能够抑制HUVEC的增殖,升高细胞凋亡率.     

阴性突变Rac-N17基因转染对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨基因转染对内皮细胞凋亡的影响及其相关机制。方法 采用凝血酶诱导法诱导人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）凋亡，检测细胞凋亡情况及caspase-3活性。结果 结果显示，凝血酶诱导48 h后，HUVECs细胞浆内颗粒和空泡增多，细胞凋亡率明显增高，caspase-3活性明显增加，而加入RacN17干预后，细胞凋亡率明显降低、caspase-3活性明显下降。结论 Rac-N17基因转染能防止细胞的凋亡与衰老，保护血管内皮细胞。     

甲醛对人脐静脉内皮细胞氧化损伤作用

目的 探讨甲醛对人脐静脉内皮细胞的损伤作用及可能机制。方法 将人脐静脉内皮细胞暴露于不同浓度甲醛（0、5、10、20、40、80μmol／L）下；同时以过氧化氢为阳性对照组，抗氧化药物维生素C为保护组。24h后通过MTT比色法检测细胞生长抑制率，硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛含量，观察甲醛是否对内皮细胞具有损伤作用及维生素C对甲醛损伤的内皮细胞是否具有保护作用。结果 甲醛能抑制细胞的生长活性，细胞生长抑制率随甲醛浓度的增加而增加；甲醛诱导细胞外丙二醛的生成，且其含量随甲醛浓度的增加而增加。维生素C能降低甲醛对内皮细胞的生长抑制率，降低细胞外MDA含量。结论 甲醛能诱导内皮细胞产生损伤作用，这种作用与其增加内皮细胞产生过多的脂质过氧化物有关。抗氧化刺维生素C能减轻甲醛对内皮细胞的氧化损伤。     

血小板衍生膜微粒对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响

本研究探讨血小板衍生膜微粒(platelet-derived membrane microparticles,PMP)对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管形成的影响。用凝血酶激活血小板释放出PMP,再经高速离心分离出PMP,用流式细胞仪检定PMP,并用BCA法测定PMP的含量。将PMP接种于鸡胚绒毛尿囊膜上,观察PMP对CAM血管生成的影响。结果显示:当PMP的浓度为80μg/ml时,孵育72小时后混合纤维素滤膜周围可见到放射状密集生长的血管网,血管分支数为112.5±11.31,血管面积为(6.19±1.29)(,而在对照组无特异性密集血管生成,血管分支数为82.6±8.05,血管面积为1.78±0.33,二组比较有显著性差异(P<0.05);而与VEGF组比较,后者的血管分支数为128.4±10.02,血管面积为7.44±1.36,二组比较差异无显著性。结论:PMP对CAM新生血管的生成有促进作用。     

蜂胶黄酮对人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶9的影响

背景:研究表明,基质金属蛋白酶9与动脉粥样硬化斑块的稳定性有关,蜂胶黄酮具有抗动脉粥样硬化的作用.目的:拟证实蜂胶黄酮对人脐静脉内皮细胞摹质金属蛋白酶9表达的影响.设计、时间及地点:对比观察.实验于2008-01/08在山东泰山医学院生命科学研究所完成.材料:蜂胶黄酮由泰山医学院生命科学研究所实验室提取;出生1 h内新生儿脐带由山东泰安市中心医院提供,产妇知情同意.方法:进行人脐静脉内皮细胞的体外培养和鉴定.按四甲基偶氮唑盐实验筛选的浓度,分别加入25,50,100,200 mg/L不同剂量的蜂胶黄酮处理细胞24 h,以空白组做对照.主要观察指标:免疫细胞化学染色和ELISA法测定蜂胶黄酮对基质金属蛋白酶9表达的影响.结果:不同剂量的蜂胶黄酮作用人脐静脉内皮细胞24 h后均能明显抑制细胞基质金属蛋白酶9的表达,并且随着浓度的升高抑制作用明显增强.结论:蜂胶黄酮能明显降低人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶9的表达.     

血小板微颗粒对人脐静脉内皮细胞组织因子表达影响的初步探讨

目的探讨血小板微颗粒（PMPs）可刺激人脐静脉内皮细胞（ECV-304）表达组织因子（TF）。方法将一定数量分离于人富血小板血浆（PRP）的PMPs加到ECV-304细胞作用一定时间后,应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、流式细胞术检测细胞TF表达。结果一定数量PMPs可刺激ECV-304细胞表达TF,但与相同反应条件下一定浓度内毒素（LPS）作用于ECV-304细胞表达的TF量有所不同。结论PMPs可刺激ECV-304细胞表达TF。     

血小板微颗粒对人脐静脉内皮细胞组织因子表达影响的初步探讨

目的探讨血小板微颗粒(PMPs)可刺激人脐静脉内皮细胞(ECV-304)表达组织因子(TF)。方法将一定数量分离于人富血小板血浆(PRP)的PMPs加到ECV-304细胞作用一定时间后,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术检测细胞TF表达。结果一定数量PMPs可刺激ECV-304细胞表达TF,但与相同反应条件下一定浓度内毒素(LPS)作用于ECV-304细胞表达的TF量有所不同。结论PMPs可刺激ECV-304细胞表达TF。     

人脐静脉内皮细胞抑制单核细胞源树突状细胞的产生

本研究旨在探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对树突状细胞(DC)发育的影响.首先,利用酶消化法从人脐带分离获得HUVEC,从细胞形态、表型和功能进行鉴定;进一步将获得的HUVEC结合细胞因子配伍与CD14+单核细胞共培养,检测HUVEC对CD14+细胞向DC分化的影响;流式细胞术检测分化细胞的表型,混合淋巴细胞反应检测分化细胞的免疫学功能;采用中和抗体实验和Western blot检测对细胞增殖和分化起重要调控作用的IL-6和VEGF以及ERK和p38MAPK通路的改变.结果表明,从脐静脉分离获得的细胞呈长梭形形态,细胞表型为vWF+ CD31+ CD73+CD45-HLA-DR-CD86-CD34low,Dil-Ac-LDL吸收实验为阳性,且细胞可诱导形成血管样结构,提示分离获得了HUVEC;进一步将HUVEC与CD14+单核细胞共培养,流式细胞仪检测结果表明HUVEC可抑制CD14+单核细胞向DC的分化,诱导获得的细胞CD1a表达显著降低,混合淋巴细胞检测结果显示,与HUVEC共培养获得的DC刺激T细胞增殖作用显著降低,且具有剂量依赖性;中和抗体实验分析其可能的作用机制表明,IL-6和VEGF在CD14+单核细胞向DC分化过程中具有重要调控作用,Western blot检测结果说明其主要通过ERK和p38通路完成调控作用.结论:人内皮细胞参与DC的发育,且起到抑制作用.

Abstract：

This study was aimed to investigate the effect of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)on dendritic cell(DC)development.First,HUVEC were isolated from human umbilical cord by collagenase digestion,and then the morphology,immunophenotypes and functions were identified.Furthermore,the HUVEC were cocultured with CD14+ monocytes under the cytokine condition for detecting the influence of HUVEC on differentiation of CD14+ cells to DC.The phenotype of dendritic cells derived from CD14+ cells was analyzed by flow cytometry,the immunoregulatory function of DC was tested by mixed lymphocyte reaction(MLR).The change of IL-6 and VEGF as well as EPK and p38 signal pathway were analyzed by neutral antibody experiment and Western blot.The results showed that HUVEC isolated from human umbilical cord were characterized by spindle-shaped morphology,homogenous immunophenotypes (vWF+ CD31+ CD73+ CD45-HLA-DR-CD86-CD34(low),Dil-Ac-LDL incorporation ability and forming capillary-like structures.Following stimulation with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)plus interleukin-4 (IL-4),HUVEC cocultures could inhibit the initial differentiation of CD14+ monocyte to DC.Interestingly,IL-6 and VEGF enhanced the suppression effect of HUVEC on generation of DC via activation of the ERK or p38 mitogen activated protein kinase pathway.It is concluded that HUVEC are involved in DC development and can suppress the differentiation of monocyte to DC.     

原代人脐静脉内皮细胞分离培养方法的探讨及其鉴定

目的通过比较两种原代人脐静脉内皮细胞的分离培养方法并对细胞特异性抗原进行鉴定,探索提高原代内皮细胞体外培养存活率及纯化率的方法。方法采用一次性无菌注射器向人脐静脉灌注消化液,消化液的浓度和消化时间分别0.25%（质量体积比）胰蛋白酶,10min和0.1%（质量体积比）胶原酶Ⅱ,15min。通过在倒置显微镜下观察细胞的形态特点和用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,比较两种消化方法的优劣。结果 0.1%胶原酶Ⅱ,15min的消化方法较0.25%胰蛋白酶,10min对原代人脐静脉内皮细胞有更好的分离效果,活细胞数量多且细胞纯度较高。免疫荧光染色结果表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达。结论胶原酶Ⅱ可以有效分离脐静脉内皮细胞,最佳消化条件是0.1%胶原酶Ⅱ,37℃,15min。     

血小板衍生微粒对脐血粒巨噬祖细胞的促增殖作用

本研究探讨血小板衍生微粒(PMP)对脐血粒巨噬祖细胞集落形成单位(CFU-GM)的促增殖作用。采用不同浓度的凝血酶激活血小板释放出PMP,采用流式细胞术检测PMP的释放量,确定凝血酶的最佳实验浓度。应用Ficoll分离脐血单个核细胞(MNC),在含有不同浓度PMP的甲基纤微素半固体培养基中培养7天,观察CFU-GM集落形成情况。结果表明:2.0、1.5、1.0和0.5U/ml凝血酶激活血小板后的PMP释放率分别为:28.7%、47.7%、50.1%和43.9%;CFU-GM集落产率与PMP呈剂量依赖关系,PMP为10、50、100μg/ml时的CFU-GM集落产率(个/2×105MNC)分别为:119.8±32.2、142.8±45.2、180.8±85.1。50、100μg/mlPMP组的集落产率与空白对照组(103.0±24.8)相比,P值均<0.05;而10μg/mlPMP组的集落产率略高于空白对照组,但P值>0.05。结论:用1.0U/ml的凝血酶激活血小板释放的PMP较为均一,而且释放量最大。PMP可促进人脐血粒巨噬祖细胞的增殖。     

一株能支持造血的人脐静脉内皮细胞系的建立

为了方便研究人脐静脉内皮细胞在造血调控和心血管系统中的作用,利用脂质体介导基因转染的方法,将SV40大T抗原导入原代人脐静脉内皮细胞,建立了至少可传代培养25代的人脐静脉内皮细胞系IEC。免疫细胞化学染色显示IECⅧ因子阳性。流式细胞术检测I型荆豆凝集素结合率为97%。染色体分析表明IEC细胞内染色体结构和数目发生了改变。体外实验表明,IEC具有支持造血的能力。     

洛伐他汀对血管内皮细胞与平滑肌细胞增殖调节作用的对比实验研究

目的探讨洛伐他汀对人血管内皮细胞与平滑肌细胞的调节作用及其调节差异性。方法配制含不同浓度洛伐他汀的培养基f0、0．001、O．01、0,1、1、10μmol／L）,分别于96孔板中进行人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与血管平滑肌细胞（VSMCs）培养,在培养24、72、120h后以MTT法对两种细胞进行细胞活性及增殖情况评估。结果培养24h,0．1μmol／L的洛伐他汀对HUVECs存在明显的促进增殖作用;培养72h,1斗mol／L的洛伐他汀对HUVECs存在明显的促进增殖作用;培养120h后,O．001、0．01、0．1、1μmol／L的洛伐他汀与对照组相比HUVECs增殖活性无明显差异,10μmol／L的洛伐他汀表现出明显的增殖抑制作用。培养24h和120h,各浓度组洛伐他汀对VSMCs的增殖无显著调节作用;培养72h,0．001、0．01、1、10μmol／L的洛伐他汀对VSMCs的增殖存在部分抑制作用,未发现剂量相关规律性。结论洛伐他汀对人血管内皮细胞增殖存在双向调节作用,与浓度相关。体外浓度0.1、1μmol／L时可以表现出明显的促进增殖作用,浓度达10μmol／L时则表现出抑制作用。相同浓度下,洛伐他汀无促进VSMCs增殖的作用,并且存在部分抑制VSMCs增殖的作用。     

灯盏花素对凝血酶诱导内皮细胞基质金属蛋白酶-2表达的影响

目的探讨不同浓度的灯盏花素对凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达及活性的影响。方法体外培养HUVECs,待细胞生长到融合状态时加不同浓度的灯盏花素（17.5、35.0、70.0μg/mL）,1 h后加入凝血酶（4 kU/L）,作用24 h后采用明胶酶谱法检测MMP-2的活性,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定MMP-2 mRNA的表达。结果凝血酶可诱导HUVECs MMP-2的表达;不同浓度的灯盏花素可抑制凝血酶诱导的MMP-2的表达（P〈0.01）。结论灯盏花素可抑制凝血酶诱导的HUVECs MMP-2的表达;可能对抗动脉粥样硬化,稳定硬化斑块、防治斑块破裂和预防急性冠状动脉综合征的发生产生有益的作用。     

高糖条件下血管内皮细胞的增殖与凋亡

目的：研究高糖对血管内皮细胞增殖、凋亡的影响.方法：用高糖（10、20、30、40、50mmol/L）作用培养的人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）,第2、4、6、8、10、12、14天,用氚-标记的脱氧胸腺嘧啶核苷（tritium-labelled thymidine deoxyribose,3H-TdR）掺入法测定每分钟计数（counts per minute,cpm）,流式细胞仪检测技术测定内皮细胞的增殖指数、凋亡指数和细胞周期的变化.结果：在高糖作用下,HUVEC cpm值显著低于对照组（P＜0.001）增殖指数低于对照组（P＜0.05）,凋亡指数高于对照组（P＜0.05）呈明显的剂量依赖关系,随作用浓度增大时间延长更为明显.各高糖组G1期百分率均升高（P＜0.01）,S期百分率均降低（P＜0.05）.结论：高糖使培养的人脐静脉血管内皮细胞凋亡加速,同时抑制了内皮细胞的增殖.根据G1期细胞百分率升高,S期细胞百分率下降的结果,高糖导致部分内皮细胞可能被阻滞在G1/S转变期.     

高糖环境对人脐静脉内皮细胞分泌血栓调节蛋白的影响

目的探讨葡萄糖对人脐静脉内皮细胞分泌可溶性血栓调节蛋白（sTM）的影响,阐明内皮功能损伤与糖尿病血栓形成的机制。方法将体外培养的人脐静脉内皮细胞分为不同浓度的葡萄糖组（5．5、20和40mmol／L）和对照组（不含葡萄糖）,于培养0、6、24、48和72h不同时间点收集细胞上清液,采用ELISA双抗体夹心法检测sTM水平,同时将各时间的细胞上清液与正常血浆等比例混合后,测定凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）并进行比较。结果与对照组比较,5．5mmol／L和20mmol／L葡萄糖组不同培养时间对内皮细胞分泌sTM的水平没有影响,差异无统计学意义（P〉0．05）;而40mmol／L葡萄糖组内皮细胞在培养48h内,随着培养时间的延长,内皮细胞分泌sTM的水平逐渐升高且均高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;但在培养72h时内皮细胞分泌sTM的水平下降,与48h不同浓度葡萄糖组及对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。5．5mmol／L和20mmol／L葡萄糖组不同培养时间测定APTT值与对照组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;40mmol／L葡萄糖组内皮细胞在培养48h内,随培养时间的延长,APTT逐渐缩短,与其他3组比较差异有统计学意义（P〈0．01）;培养72h与48h比较,APTT不再缩短反而略有延长,但差异无统计学意义（P〉0．05）。4组间PT值差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论高浓度葡萄糖可导致内皮细胞损伤,使血液凝固活性增强而诱发高凝状态。