太子参14种真菌毒素同步检测方法的建立及污染状况研究

建立太子参药材中14种真菌毒素的同步分析方法,分析真菌毒素的污染状况,为监测中药材质量和用药安全提供技术指导。以80%乙腈作为提取溶剂,振荡提取1 h,经改良QuEChERS净化剂(0.1 g PSA+0.3 g C₁₈+0.3 g无水MgSO₄)净化;采用Waters HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.8μm)分离,以0.1%甲酸水和乙腈梯度洗脱,多反应监测模式(MRM)扫描,分析26份太子参样品中真菌毒素污染状况。所建方法回收率在82.17%～113.6%,RSD<7%,定量限为0.019～0.976μg·kg^-1;26批药材中14种真菌毒素的检出率为53.85%,其中杂色曲霉素(ST)检出率最高、其次为玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素G₂(AFG₂)、伏马毒素B₁(FB₁)、HT-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇(NIV),检出率分别为38.46%、26.92%、23.08%、11.54%、11.54%、7.6...     

柏子仁采收、加工过程中黄曲霉毒素及其真菌群落分布

为分析柏子仁采收、加工过程中黄曲霉毒素含量及真菌群落分布,寻找影响柏子仁黄曲霉毒素污染问题的关键环节。该研究收集不同成熟时期(球果未破裂时期、破裂初期、完全破裂时期)、不同加工时期(晾晒前、晾晒2 d、晾晒7 d、脱种鳞前后、去皮前后、色选后1 d、色选后7 d)的相关样品,采用ITS扩增子测序方法鉴定样本表面真菌群落多样性组成;采用HPLC-MS/MS测定黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂含量。结果表明,柏子仁采收阶段,从球果未破裂至完全破裂,仅种鳞、种皮2个部位检出黄曲霉毒素且种鳞只包含黄曲霉毒素G₂,种皮只检测出黄曲霉毒素B₁。晾晒阶段,随着晾晒时间延长,种鳞开始同时检出黄曲霉毒素B₁、G₂,种皮检出黄曲霉毒素B₁,种仁开始检出低含量的黄曲霉毒素B₁。后续加工过程种仁黄曲霉毒素含量上升幅度较小。真菌检测方面,采收期种仁没有检测到黄曲霉菌,晾晒期、加工期均鉴定出黄曲霉...     

LC-MS/MS法同时测定活血止痛胶囊/片中16种真菌毒素及污染状况分析

目的 建立LC-MS/MS法同时测定活血止痛胶囊/片中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂,伏马毒素B₁、B₂、B₃,赭曲霉毒素A,玉米赤霉烯酮,脱氧雪腐镰刀菌烯醇,T-2毒素,HT-2毒素,桔青霉毒素,杂色曲霉毒素的含量,并对其污染状况进行分析。方法 以亲水-亲脂HLB固相萃取柱净化作为前处理方式,分析采用Agilent RRHD Eclipse Plus C₁₈色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.8μm);流动相乙腈-水(0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸铵),梯度洗脱;体积流量0.3 mL/min;柱温35℃;电喷雾电离源(ESI),正负离子模式,动态多反应离子检测(DMRM)模式。结果 16种真菌毒素在各自范围内线性关系良好(R²>0.999 2),平均加样回收率81.7%～118.0%,RSD 0.9%～13.1%。40...     

免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中4种黄曲霉毒素

目的:建立免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的含量。方法:样品采用70%甲醇作为提取溶剂，经免疫亲和柱净化、高效液相色谱分离、光化学柱后衍生后，通过荧光检测器测定其中黄曲霉毒素的含量。结果:黄曲霉毒素B₁的线性范围为0.0104～0.0520 ng(r=0.999 9)、黄曲霉毒素B₂的线性范围为0.0038～0.0190 ng(r=0.999 8)、黄曲霉毒素G₁的线性范围为0.0108～0.0540 ng(r=0.999 8)、黄曲霉毒素G₂的线性范围为0.0038～0.0190 ng(r=0.9998),线性关系良好，回收率在89.68%～101.44%之间，RSD≤3.5%。结论:该方法操作简便，灵敏度高、重复性好、结果准确，可用于制马肾中黄曲霉毒素的测定。     

快速液相色谱-串联质谱法测定果实类药材中的黄曲霉毒素

目的 建立中药材中4种黄曲霉毒素测定的快速液相色谱-串联质谱方法。方法 样品经体积分数70%甲醇提取、免疫亲和柱净化,岛津Shim-pack XR-ODS色谱柱,用甲醇-乙腈（1∶1）和水为流动相,梯度洗脱,ESI扫描,多反应监测（MRM）。结果 黄曲霉毒素B₁在0.102 1~10.21 ng·mL内、黄曲霉毒素B₂在0.061 2~7.65 ng·mL内、黄曲霉毒素G₁在0.193~9.65 ng·mL内、黄曲霉毒素G₂在0.121~7.55 ng·mL内,线性关系均良好,r＞0.999 8;4种黄曲霉毒素回收率在77.0％~102.4％之间。结论 本方法准确可靠,适合中药材中4种黄曲霉毒素含量的测定。     

真菌毒素限量标准及其在中药中的研究进展

对人类健康影响较大的黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等7种真菌毒素及其药理毒性进行介绍,并综述了近年来一些主要国际组织和我国等地区现行的真菌毒素限量标准情况。这些限量标准主要针对食品中的真菌毒素和中药材中的黄曲霉毒素,而研究表明药用植物及其产品也有被其他真菌毒素污染的情况。为此,讨论了在我国建立中药材中真菌毒素限量标准的紧迫性和重要性,以期为我国建立中药材中真菌毒素限量标准提供参考。     

基于酶联免疫分析的中药薏苡仁玉米赤霉烯酮残留快速检测技术研究

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是由黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、三线镰刀菌等真菌产生的有毒代谢产物，具雌激素性特征。接触或摄入ZEN会导致生殖机能异常，妊娠期还会引起流产、死胎和畸胎，严重危害人类生命健康安全。《中国药典》2020年版中ZEN的检测方法为液相色谱(LC)和液相色谱-串联质谱(LC-MS),且规定每1 000 g薏苡仁含ZEN不得过500μg。仪器检测方法虽可以实现薏苡仁中ZEN的定性和定量分析，但因其检测成本高、周期长，而无法满足大批量样本的快速筛查需求。该研究将ZEN半抗原通过与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联后获得ZEN的完全抗原。利用抗体制备技术，制备得到ZEN单克隆抗体4F6,该抗体与ZEN结构类似物玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇的交叉反应率分别为177.5%、137.1%、109.7%,与黄曲霉毒素等其他真菌毒素无交叉反应。通过方法学考察，建立了基于ZEN单克隆抗体4F6的薏苡仁中ZEN的直接竞争酶联免疫检测方法(direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay, dc...     

超高效液相色谱-串联质谱法快速测定沙棘药材及食品制品中10种真菌毒素

该研究建立了沙棘药材及食品制品中10种真菌毒素的分析方法，对其真菌毒素的污染情况进行分析。首先选取黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等10种真菌毒素的混合对照品溶液作为对照，并对沙棘药材及其食品制品进行制备；其次基于超高效液相色谱-串联质谱法(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)对沙棘药材及食品制品中10种真菌毒素做定量方法学考察并对其含量进行测定；最后对真菌毒素的污染情况进行分析评价。分析结果确定了最佳分析条件，且方法学考察结果表明10种真菌毒素建立的线性关系良好(r>0.99),方法重复性，供试品专属性、稳定性，仪器精密度均良好；10种真菌毒素在沙棘药材、沙棘食品制品固体和沙棘食品制品液体3种基质中的平均加样回收率分别为90.31%～109.4%、87.86%～107.8%、85.61%～109.1%;RSD分别为0.22%～10%、0.75%～13%、0.84%～8.5%。说明该研究基于UPLC-MS/MS技术建立的10种真菌毒素限度的...     

不同储藏条件下薏苡仁中真菌毒素含量变化的研究

目的:探讨不同储藏条件对薏苡仁真菌毒素含量的影响。方法:取新鲜薏苡仁与中药房处理后薏苡仁2批薏苡仁为观察对象,模拟低温密封、高温高湿以及通风干燥3种储藏条件,在储藏0、30、90天,运用免疫亲和柱净化-在线柱后光化学衍生-高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)对其黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)与玉米赤霉烯酮(ZON)7种真菌毒素含量变化进行检测。结果:在通风干燥的条件下,AFB1与AFB2含量增加幅度最大;在高温高湿的储藏条件下,AF含量未出现明显变化;在低温密封的储藏条件下,薏苡仁中AF含量表现为缓慢增长。在高温高湿以及通风干燥的环境下,薏苡仁中ZON会迅速增加;在通风干燥的环境下,薏苡仁ZON含量增加的幅度更大;在低温密封的环境下,短时间内可对ZON含量进行抑制。结论:不同的储藏条件下,薏苡仁中真菌毒素的含量会发生不同的改变,但还需进行大样本验证,具体机理也需要作进一步的研究。     

固相萃取-液质联用法测定土鳖虫中12种真菌毒素

目的 建立动物药土鳖虫中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、伏马毒素B1、B2、桔青霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素、赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮等12种真菌毒素的高效液相色谱-串联质谱同时测定方法。方法 土鳖虫样品加入80%乙腈溶液匀浆提取,用水稀释上清浓缩液后使用HLB固相萃取柱净化富集;以乙腈-5mM醋酸铵（pH=3.0）为流动相经C18色谱柱梯度洗脱分离,采用电喷雾（ESI）离子源、多反应监测（MRM）及正负离子模式采集数据。结果12种真菌毒素的线性良好,低、中、高3个水平的加标回收率在68%-110%之间,RSDs为1.5%-13%。抽查4批市售土鳖虫样品,结果 有3批土鳖虫样品黄曲霉毒素有检出,并且超出限量标准。而赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素类均对土鳖虫有不同程度的污染,其中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的污染较为严重,分别超出限量的30%和60%。结论 土鳖虫易受黄曲霉毒素、伏马毒素以及玉米赤霉烯酮等真菌毒素的污染,本研究以土鳖虫为例建立的检测方法,以期为动物类中药的真菌毒素污染的含量测定提供技术支持及理论依据。     

储藏条件对柏子仁污染黄曲霉毒素的影响及脱除方法探讨

目的:了解不同储藏条件对柏子仁药材黄曲霉毒素污染的影响,并探讨洗脱方法对柏子仁中黄曲霉毒素的脱除效果,为确定柏子仁药材的合理储藏条件及脱毒技术提供参考。方法:HPLC方法测定10个批次柏子仁黄曲霉毒素的污染程度,并设计2个温度及2种包装进行储藏试验,对比不同储藏条件下柏子仁黄曲霉毒素B1(AFB1)及黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2之和(AFs)的污染量。采用乙醇洗、水洗两种方法对柏子仁中黄曲霉毒素进行脱除。结果:有9个批次柏子仁存在黄曲霉毒素污染,其中5个批次的污染程度超出2015版《中国药典》限量标准。在10℃和25℃两个储藏温度下,AFB1和AFs均随储藏时间的延长而逐渐增加,储藏2个月时,AFB1的最大增加量达到起始的8.3倍,AFs的最大增加量达到7.8倍。真空包装与普通塑料袋相比,并不能显著降低毒素的增加量。乙醇洗对柏子仁中AFB1和AFs脱除率达到90%以上,水洗可以达到87%以上。结论:柏子仁在10℃、25℃时采用塑料袋及真空包装储藏期不宜超过1个月,两种清洗方法可部分脱除柏子仁中黄曲霉毒素。     

HPLC法同时测定21种中药饮片中4种黄曲霉毒素的含量

目的:对21种中药饮片中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2进行含量测定,了解中药饮片的质量状况。方法:采用高效液相色谱(HPLC)-柱后碘衍生法进行含量测定,Waters Sunfire C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱温35℃,以甲醇-乙腈-水(33∶12∶55)为流动相,流速1.0 mL/min。荧光检测器激发波长λex=360 nm,发射波长λem=450 nm。以0.05%碘溶液为衍生溶液,衍生化泵流速为0.3 mL/min,衍生化温度为70℃。结果:21种中药饮片中,只有胖大海、酸枣仁、大枣、全蝎、淡豆豉、牛蒡子、千金子7个品种未检出黄曲霉毒素;4批柏子仁、6批薏苡仁全部检出黄曲霉毒素,检出率均为100%,其中3批柏子仁的黄曲霉毒素含量超出法定标准限量,不合格率75%;2批薏苡仁的黄曲霉毒素含量超出法定标准限量,不合格率33%。桃仁、陈皮等其余12个品种亦检出黄曲霉毒素,但含量未超出法定标准限度。结论:虽然黄曲霉毒素检测成本较高,但为保证用药安全、减少用药风险,对中药饮片进行合理的黄曲霉毒素监督检测具有必要性。     

一株玉米赤霉烯酮高效降解细菌的筛选与降解条件研究

玉米赤霉烯酮毒素(zearalenone, ZEN)是由镰刀菌属真菌产生的一种真菌毒素,具有雌激素样效应、致癌性及多种毒性。为寻求更高效、实用的生物脱毒制剂,提高其应用范围。该研究从发病霉变太子参块根中分离获得194株细菌菌株,将分离菌株与ZEN毒素共培养,HPLC检测筛选出1株ZEN高效降解细菌,编号为H4-3-C1,形态观察及分子鉴定为醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus。分别研究了培养基、接种量、培养时间、培养基pH、温度等对H4-3-C1菌株降解ZEN的影响;同时,初步探讨该菌株清除ZEN的机制及其对薏苡仁中ZEN的降解效果。H4-3-C1菌株在pH 6的LB培养基、1%的接种量、28℃、180 r·min~(-1)的条件下振荡培养24 h后,对5μg·mL~(-1 )ZEN的降解率最高可达85.77%;菌株培养上清液对ZEN的降解率远高于菌体胞内液和菌体,由此推测该菌株主要通过分泌胞外酶降解ZEN;且H4-3-C1菌株也能很好地降解中药材薏苡仁中的ZEN,可以将薏苡仁中ZEN初始量由90μg·g~(-1)降解至40.68μg·g~(-1),降解率达54.80%。该研究为食品加工产物及中药材中ZEN的生物脱毒提供了新的菌株资源和应用技术。     

普洱茶、红茶、绿茶中真菌毒素的检测

检测茶叶中黄曲霉毒素(B_1,B_2,G_1和G_2)、伏马霉素(FB_1,FB_2,FB_3)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇,明确茶叶中的真菌毒素含量范围并为茶叶监管提供依据。采用有机溶剂(0.1%甲酸乙腈溶液)以及80℃热水2种方法提取茶叶中的真菌毒素,利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法进行分析测定。黄曲霉毒素B1,G1的线性范围为39.1~5 000 ng·L~(-1),黄曲霉毒素B2,G2的线性范围为117~15 000 ng·L~(-1);伏马霉素(FB1,FB2,FB3)的线性范围为2.44~313 ng·L~(-1);脱氧雪腐镰刀菌烯醇的线性范围为3 125~5 000 ng·L~(-1)。所得8种真菌毒素的回归方程均有良好的线性关系(r≥0.999 0),回收率为85.7%~99.6%,相对标准偏差10%。对20种国际市售茶叶中的8种真菌毒素进行测定,结果显示采用有机溶剂提取法,包括普洱茶、红茶、绿茶在内的多种茶叶产品都不同程度含有微量的真菌毒素,其中黄曲霉毒素B2在6种茶叶产品中被检测到,黄曲霉毒素G_1在3种茶叶中被检测到,伏马霉素FB_1在2种茶叶中被检测到,伏马霉素FB2在一种茶叶中被检测到。而采用热水提取方法,只有一种茶叶产品的茶汤中检测到微量的伏马霉素B_1,B_2,其他各种茶叶的茶汤中均未检出毒素。以上2种方法检出的真菌毒素含量在0.15~7.31μg·kg~(-1),均未超过国际食品安全规定的真菌毒素限量。80℃热水提取模拟实际的饮茶方法,更能准确地检测茶叶中进入茶汤的真菌毒素,适用于茶叶(采用热水冲泡的)饮用产品,而有机溶剂萃取法适用于食用产品中霉菌毒素绝对含量的检测。     

6种动物类药材中黄曲霉毒素污染的液质联用检测

目的:建立一种快速检测动物类药材污染黄曲霉毒素B1(AFB1)和黄曲霉毒素G1(AFG1)的液质联用方法,并用于水蛭等6种动物类中药材污染情况的分析。方法:药材样品加84%乙腈提取,提取液挥干后用甲醇溶解,采用高效液相串联质谱检测方法,C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,3μm),以甲醇-4.0 mmol·L~(-1)乙酸铵-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,质谱使用ESI离子源,正离子扫描模式,选择反应检测(SRM)模式进行定量。结果:6种药材中AFB1,AFG1的基质效应介于82%~119%;以水蛭作为代表性基质,进行加样回收率试验,按低、中、高3个浓度水平添加时,AFB1与AFG1的提取回收率、绝对回收率介于80%~117%。方法学考察精密度RSD 1.8%~7.5%,重复性RSD 5.1%~14%。将该方法应用于55份动物药材样品检测,结果显示包括水蛭和土鳖虫在内的4份样品受到污染,其中土鳖虫污染率达33.3%,污染水平处于1.26~26.3μg·kg~(-1)。结论:土鳖虫等动物类药材受黄曲霉毒素污染的情况应当引起足够的重视。针对药材生产的各个环节,采取恰当的措施降低黄曲霉毒素污染的风险是十分必要的。     

薏苡仁中呕吐毒素酶联免疫检测方法的建立北大核心CSCD

薏苡仁为药食同源的常用大宗药材,具有利水渗湿、健脾止泻的功效。其原植物薏苡为禾本科植物,在生长过程中由于气候原因易受禾谷镰刀菌Fusarium graminearum和黄色镰刀菌F.culmorum等产生呕吐毒素等多种真菌污染。《中国药典》2351真菌毒素测定法中呕吐毒素检测方法为高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-串联质谱(LC-MS),检测周期长,费时、费力,不能满足药品的现场质量检测要求。通过将呕吐毒素进行化学衍生,与蛋白偶联后获得呕吐毒素的完全抗原。利用抗体制备技术,制备呕吐毒素的单克隆抗体,通过方法学考察,进而建立薏苡仁中呕吐毒素的酶联免疫检测方法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。基于薏苡仁中呕吐毒素ELISA的IC_(50)为3.88μg·L^(-1),加样回收率为77.32%~93.73%,RSD为4.6%~9.7%。利用所建立的ELISA方法,测定了14批薏苡仁样品中的呕吐毒素残留量,并使用LC-MS进行验证,发现2种检测方法测定结果相关性为0.997 8,表明所建立的酶联免疫方法可用于薏苡仁中呕吐毒素残留量的定量检测,可以实现薏苡仁中呕吐毒素残留的快速定量检测。     

高效液相色谱柱后衍生法测定果实类药材中的黄曲霉毒素

目的 检测果实类药材中的黄曲霉毒素,了解其污染情况。方法 样品经70％甲醇提取、免疫亲和柱净化后,用高效液相色谱-柱后衍生-荧光检测器进行分析测定果实类药材中4种黄曲霉毒素(G2、G1、B2、B1)的含量。结果 检测的25批次的药材中,共6个批次样品检出黄曲霉毒素,检出率为24％;桃仁和莲子2个批次样品黄曲霉毒素B1含量超过5 μg·kg-1,阳性率为8％。结论 果实类药材中黄曲霉毒素的含量大部分低于国家关于黄曲霉毒素的含量标准,但尚需要继续研究扩大监测品种。     

酶联吸附免疫法和胶体金免疫色谱技术在中药黄曲霉毒素检测中的应用进展

黄曲霉毒素是中药中较易产生的毒性极强的真菌毒素之一。建立黄曲霉毒素简单、快速、高通量、现场化的检测方法对实现中药黄曲霉毒素限量监控、保障中药安全性具有重要意义。酶联吸附免疫法(ELISA)和胶体金免疫色谱(GICA)技术为中药黄曲霉毒素的大批量快速检测和现场单个或少数样品即时检测提供了有效的技术手段。虽然现在已有较多关于此类检测方法的报道,但没有形成标准方法。对已报道的中药黄曲霉毒素检测方法进行综述,以期为形成方法标准提供参考。     

四种大宗常用中药饮片中黄曲霉毒素污染状况分布比较研究

目的 测定不同来源的4种大宗常用中药饮片中黄曲霉毒素（AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂）的含量，比较不同基质中药饮片中黄曲霉毒素的分布状况。方法 基于免疫亲和柱净化-高效液相色谱分离-荧光检测器（IAC-HPLC-FLD）方法，分析不同产地共75批中药样品。结果 柏子仁、薏苡仁、决明子及党参共计75批中药饮片中，阳性检出：26批柏子仁（AFs 1.22-46.67 μg·kg^-1，AFB₁ 1.22-31.40 μg·kg^-1）、4批薏苡仁（AFs 1.97-41.13 μg·kg^-1，AFB₁ 1.97-36.40 μg·kg^-1）、1批决明子（AFs 13.65 μg·kg^-1，AFB₁ 12.60 μg·kg^-1），阳性率41%，超标率15%。阳性样品经 LC-MS/MS确证，排除假阳性。4种大宗常用中药饮片柏子仁、薏苡仁、决明子、党参中黄曲霉毒素的污染水平依次降低，阳性检出率分别为77%、29%、7%、0%，表明中药材中黄曲霉毒素的污染状况与药材基质密切相关。结论 针对易污染AFs的中药品种，需进一步加强其污染状况的全面检测分析，为黄曲霉毒素的有效防控以及完善中药的质量标准提供科学依据，从而保障中药用药安全。     

云南地区三七和草果上真菌污染的初步分析

目的:了解云南地区主产的中药材三七和草果上污染真菌的主要类群,分析这2种常用药材上潜在的真菌毒素污染的可能性。方法:采集来源于云南不同地区市售的三七、草果药材,使用稀释平板法分离药材表面真菌,依据形态学特征结合分子生物学方法对主要分离菌株进行鉴定。结果:三七污染真菌以淡紫拟青霉和橘青霉为优势菌;草果污染菌中的优势菌为淡紫拟青霉和黄曲霉。结论:根据三七和草果上污染菌的情况,在云南地区三七存在橘青霉毒素污染的风险,草果存在黄曲霉毒素污染的风险。