基于基因组和转录组的丹参酮生物合成相关基因SmCYP71AU66 的筛选

目的：以丹参基因组及全长转录组数据库为基础,对丹参酮生物合成关键酶基因进行预测,进一步推进丹参酮生物合成途径的解析。方法：结合丹参中CYP450s的系统发育鉴定丹参CYP71clan成员,采用生物信息技术分析其差异表达、基因结构和保守基序等;克隆候选基因并进行理化特性和蛋白结构等分析。结果：从丹参基因组注释到161个CYP71clan成员,分为16个家族,其中CYP71家族成员有64个,数量最多且结构域保守。转录组表达分析显示CYP71clan中36%的基因高表达（FPKM > 10）。克隆到基因SmCYP71AU66 全长1503bp,编码500个氨基酸,在丹参根的周皮部位显著高表达,符合丹参酮在丹参体内的分布规律,预测该基因是丹参酮生物合成途径中的关键酶基因。结论：本研究为丹参酮合成相关基因的挖掘以及生物合成途径的解析提供参考。     

丹参酮生物合成途径CYP76AH1基因RNA干扰体系的建立及干扰效果研究

丹参酮类化合物多属于二萜类化合物,是药用植物丹参的主要活性成分之一,在植物体内的生物合成需要多个基因的参与.CYP76AH1是丹参酮生物合成途径的第一个P450基因,前期的酵母表达以及体外酶促反应已经验证了其体外功能.为了对该基因的功能进行进一步研究,该文构建了该基因的丹参毛状根RNA干扰体系:通过Gateway技术构建能形成具有目标基因发卡结构的RNA干扰载体,转化发根农杆菌,转染丹参叶片,将干扰片段整合至丹参基因组中,获得了高效干扰的CYP76AH1干扰型丹参毛状根.     

丹参酮合成相关的候选基因CYP76AK5克隆及生物信息学分析

目的:基于丹参基因组和转录组筛选、克隆及分析丹参酮合成途径候选的CYP450编码基因。方法:设计引物克隆SmCYP76AK5编码基因,通过MEGA软件构建系统进化树并结合实时定量PCR分析其在根不同组织(周皮、韧皮部、木质部)、根、茎、叶、花中的差异表达;最后利用在线生物信息学工具分析其理化性质,预测其二级结构、保守结构域等。结果:系统进化树分析表明SmCYP76AK5属于CYP71clan;基因差异表达显示SmCYP76AK5在根周皮中表达最高,与丹参酮的合成和积累相一致。结论:预测丹参SmCYP76AK5参与丹参酮的生物合成。     

丹参酮ⅡA对大鼠细胞色素P450酶的诱导作用

目的 研究丹参酮ⅡA对大鼠细胞色素P450酶的诱导作用.方法 丹参酮ⅡA 7、20、60、180 mg/(kg·d)4个剂量组,雄性SD大鼠连续ig 7 d,取肝脏组织,应用体外"coclctail"方法 ,反转录-聚合酶链反应,免疫印迹杂交方法 分别检测CYP450酶活性、基因表达和蛋白表达的变化.结果 丹参百同ⅡA能显著诱导CYP1A2及CYP2E1的活性以及基因、蛋白表达,且呈剂量依赖性;高剂量组能增强CYP2C19的活性,但对基因、蛋白表达没有影响;对包括CYP3A1在内的其他亚型没有影响.结论 丹参酮ⅡA对大鼠多种CYP450亚型有诱导作用.     

丹参酮生物合成途径CYP450基因相关长链非编码RNA的筛选

丹参酮是中药丹参的主要有效成分,其生物合成途径表明细胞色素CYP450酶在丹参酮生物合成途径结构后修饰过程中发挥着重要作用。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200 nt的核苷酸,对药用植物的生长发育、次生代谢等具有重要调控作用。该研究通过对丹参毛状根进行诱导,利用高通量测序构建其长链非编码RNA文库,共获得8 942个差异lncRNA,其中6 755个基因间lncRNA,并鉴定出1 115 814个lncRNA-靶基因对,包括122个lncRNA-靶基因顺式对。对差异lncRNA与CYP450进行相关性分析,共鉴定出16 249个lncRNA-CYP450靶基因对。将其与丹参酮生物合成途径CYP76AH1,CYP76AH3,CYP76AK1基因进行靶向相关性分析,得到216个靶基因,这些候选基因为丹参酮生物合成途径下游调控机制研究奠定基础。     

丹参CYP76AH1转基因毛状根的建立及其蛋白的分离

蛋白质复合物参与植物多种次生代谢物的合成,其分离对阐明植物次生代谢及提高体外催化效率至关重要。该研究构建了过表达丹参酮合成途径关键酶CYP76AH1的转基因毛状根株系,通过Western杂交筛选得到高表达CYP76AH1蛋白的丹参转基因毛状根,并以此作为后续提取丹参酮合成途径中蛋白质复合物的组培材料。通过优化蛋白提取缓冲液中的去污剂种类和浓度,筛选出含0.5%Triton X-100的缓冲液为最佳提取缓冲液,并分离得到相对大量的可溶性CYP76AH1蛋白质。该研究为后续进一步分离纯化与CYP76AH1相互作用的蛋白质复合物奠定了基础,也为深度解析丹参酮合成代谢通路提供思路。     

丹参酮合成相关的SmCYP81C16基因克隆和功能研究

目的:丹参(Salvia miltiorrhiza)根中所含的丹参酮为二萜醌类化合物,而鉴定参与丹参酮合成的CYP450基因成为解析丹参酮生物合成途径分子机制的关键步骤。方法:本实验从丹参基因组和转录组数据中筛选到SmCYP81C16基因,采用RT-PCR方法克隆获得基因cDNA全长序列,利用生物信息学分析方法分析其所编码蛋白质的理化性质,预测该蛋白质二级结构、保守结构域等,建立系统发育进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测了该基因的组织/器官表达特异性;通过遗传转化方法获得了该基因的过表达转基因毛状根株系,通过化学检测及代谢组学分析丹参酮类化合物在对照株系和过表达株系中的含量变化。利用实时荧光定量PCR方法检测了毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因中的相对表达量。结果:SmCYP81C16基因全长1497 bp,编码498个氨基酸残基,该蛋白质相对分子质量为55.8 kDa;SmCYP81C16在丹参茎和根的周皮部高表达;通过化学检测及代谢组学分析发现,与对照株系比较,在SmCYP81C16过表达阳性株系中,丹参酮类化合物的含量升高;过表达毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因的表达量显著上升。结论:本研究结果表明SmCYP81C16具有正向调控丹参酮生物合成的功能。本研究为利用生物技术方法提高丹参酮类化合物含量奠定基础。     

基于丹参酮类化合物生源途径的丹参质量标志物研究思路探讨

该研究基于中药质量标志物(Q-marker)理论以丹参为研究对象,对丹参毛状根进行诱导实验,采用实时荧光定量PCR检测毛状根中SmCPS,SmKSL,CYP76AH1 3条基因的相对表达量;分别采用UPLC和GC-MS技术检测毛状根与药材中丹参酮Ⅱ_A、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参酮、铁锈醇以及次丹参酮二烯的含量;统计学分析表明:丹参毛状根中次丹参酮二烯与铁锈醇的含量与下游丹参酮类化合物的含量存在正相关,且丹参酮类化合物生源途径上重要基因的相对表达量可在一定程度上反映丹参酮类化合物的含量;在多省份丹参药材中,初步发现铁锈醇与丹参酮类化合物的含量也存在正相关。该研究从丹参毛状根体系可控实验入手,结合丹参药材,以丹参中特有指标性成分丹参酮类化合物的生源途径为研究基础,突出了生源途径上游基因、中游中间体化合物与下游丹参酮类化合物含量之间的重要关系,进而为从生源途径方面理解和研究丹参质量标志物(Q-marker)提供了可能的研究思路,以期建立多元、完整的中药丹参的质量控制体系。     

穿心莲中1个新NADPH-细胞色素P450还原酶的克隆及功能鉴定

穿心莲内酯为传统中药穿心莲中的主要有效成分,具有多种药理活性,广泛运用于临床,但其生物合成途径尚未被解析。细胞色素P450还原酶为CYP450提供电子,在CYP450的催化过程中起重要作用。该研究通过同源比对筛选并克隆了穿心莲CPR的编码序列,命名为ApCPR4。原核表达ApCPR4蛋白,分离纯化后进行体外酶活鉴定,发现ApCPR4能够以NADPH依赖性方式还原细胞色素c和铁氰化物。为了验证其体内功能,将ApCPR4与CYP76 AH1共转化入酵母工程菌,结果表明,ApCPR4在酵母体内能够协助CYP76AH1催化生成铁锈醇。实时定量PCR结果显示,在茉莉酸甲酯(Me JA)处理的叶片中,ApCPR4的表达量逐渐增加。该表达模式与穿心莲内酯受Me JA诱导积累的趋势一致,推测ApCPR4与穿心莲内酯的生物合成相关。     

丹参酚酸A对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系的影响

目的:研究丹参酚酸A对大鼠肝微粒体细胞色素P450和细胞色素b_5含量以及CYP1A2和CYP2E1活性的影响.方法:将大鼠分成溶剂对照组和丹参酚酸A给药组,每组10只,雌雄各半,丹参酚酸A给药组尾静脉注射给予丹参酚酸A 20 mg·kg~(-1)·d~(-1),连续给药5 d;溶剂对照组给予相同剂量的溶剂,紫外分光光度法测定大鼠肝微粒体细胞色素P450和细胞色素b_5含量;探针底物法评价CYP1A2和CYP2E1的活性.结果:丹参酚酸A尾静脉注射连续给药5 d后,大鼠细胞色素P450和细胞色素b_5含量与对照组比较均无显著性差异;CYP1A2和CYP2E1的活性与对照组比较也无显著性差异.结论:丹参酚酸A对CYP1A2和CYP2E1没有诱导或抑制作用,与经过CYP1A2和CYP2E1代谢的药物发生相互作用的可能性较小.     

复方丹参滴丸对大鼠肝微粒体细胞色素P450含量的影响

复方丹参滴丸是在复方丹参片基础上制成的一种滴丸剂,由丹参、三七、冰片3味药组成,具活血化瘀之功效,在治疗冠心病、心绞痛方面疗效确切.杨秋慧等[1,2]研究发现复方丹参片能诱导大鼠肝微粒体P450中CYP1A2,CYP2B1活性的增高,而CYP1A家族特别是CYP1A1、CYP1A2对于催化各种内外源物质致癌有重要作用.因此复方丹参诱导CYP1A2、CYP2B1活性增加具有使致癌物质活化的潜在危险性.     

青蒿素生物合成关键酶CYP71AV1的表达纯化和晶体培养

疟疾是一种严重危害人类健康的世界性流行疾病,在青蒿素广泛应用之前,全世界每年约4亿人次感染疟疾,至少有100万人的死亡病例。因此疟疾被世界卫生组织列为世界三大死亡疾病之一。青蒿素的发现,开创了疟疾治疗新方法,全球数亿人因这种"中国神药"而受益。紫穗槐-4,11-二烯氧化酶是一种植物细胞色素P450蛋白(CYP71AV1),参与催化紫穗槐-4,11-二烯生成青蒿酸的三步氧化反应,是青蒿素生物合成途径上的关键酶。作者拟通过p CW Ori(+)-CYP71AV1重组质粒在原核表达系统中的可溶性表达及蛋白纯化,采用一氧化碳差式光谱分析和基于血红素辅基的生物活性测定,验证CYP71AV1蛋白的活性,培养该蛋白的晶体。结果表明,构建的重组基因p CW Ori(+)-CYP71AV1在大肠杆菌中得以功能性表达,经过亲和层析和凝胶过滤层析纯化得到了毫克级、有活性的目的蛋白,筛选出了重组CYP71AV1蛋白的晶体生长条件。这些研究为解析青蒿素生物合成关键酶CYP71AV1的晶体结构,以及通过合成生物学方法批量生产青蒿素奠定了基础,同时为其他植物来源的P450蛋白的表达纯化与结晶提供参考。     

常春藤皂苷元生物合成解析及酵母细胞工厂的构建

常春藤皂苷元为威灵仙等药用植物的有效成分,在抗肿瘤、抗炎、抗抑郁、保肝、抑菌等方面有较好的药理活性。为获得高效生产常春藤皂苷元的酿酒酵母细胞工厂,该研究首先利用即插即用生物合成途径解析平台,在蔷薇科植物苹果Malus×domestica中成功筛选获得能催化齐墩果酸C-23位氧化的P450氧化酶基因Md MA02,其氨基酸同源性仅为已知活性的CYP72A68v2基因的32%。工程菌BY-OA-Md MA02经高密度发酵优化,其生产常春藤皂苷元产量能达到101 mg·L~(-1),是摇瓶发酵的337倍。该研究为推动齐墩果烷型五环三萜生物合成途径解析及常春藤皂苷元高效细胞工厂的创建提供了基础。     

雷公藤TwCYP88A1基因全长cDNA克隆与表达分析

目的:研究雷公藤萜类成分的生物合成相关基因,在雷公藤转录组信息数据的基础上,以雷公藤悬浮细胞为研究材料,克隆Tw CYP88A1基因。方法:采用c DNA末端快速扩增技术(RACE)克隆雷公藤Tw CYP88A1基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析其组织表达谱。结果:Tw CYP88A1 c DNA全长1 594 bp,编码491个氨基酸,等电点9.16,相对分子质量55.957 k Da,具有半胱氨酸铁血红素配体信号活性催化位点。植物组织表达分析表明Tw CYP88A1基因在雷公藤叶中的表达量最高,根中最低。结论:从雷公藤悬浮细胞中克隆得到Tw CYP88A1基因全长c DNA,对其进行生物信息学分析,揭示其组织表达谱,为深入分析雷公藤细胞色素P450酶、解析雷公藤萜类化合物的生物合成下游途径奠定基础。     

滇重楼甾体糖基转移酶的克隆及功能表征北大核心CSCD

该研究从滇重楼中克隆得到糖基转移酶基因PpUGT2,该基因ORF长度为1773 bp,编码蛋白质的氨基酸为590个。系统进化树分析显示,该糖基转移酶归为UGT80A亚家族,经国际糖基转移酶命名委员会命名为UGT80A49。构建原核表达载体pET28a-PpUGT2,通过诱导蛋白表达及蛋白提取,进行体外酶促实验,以UDP-葡萄糖为糖基供体,薯蓣皂素和偏诺皂素为底物,鉴定了其具有催化薯蓣皂素及偏诺皂素C-3羟基β糖基化的功能,为进一步研究其催化特性,对其进行了底物宽泛性研究,以UDP-葡萄糖为糖基供体,共选取了包括甾体及三萜类化合物在内的15个底物,发现其具有催化甾体类化合物睾酮C-17羟基糖基化的功能。通过同源建模及分子对接,预测了PpUGT2与底物薯蓣皂素及偏诺皂素之间相互作用的关键识别位点。并且通过对配体与多肽的氨基酸扫描,模拟突变,根据复合物的结合亲和力变化,在以底物为中心的5Å范围内,寻找到了最佳突变体,对突变体的设计具有参考意义。该研究为完整解析重楼皂苷生物合成途径以及甾体类糖基转移酶的结构研究奠定了基础。     

基于细胞色素P450酶的丹参代谢及其药物相互作用的研究进展

近年来,丹参被广泛应用于心脑血管疾病的治疗,因此,丹参活性成分的体内代谢及其药物间相互作用越来越受关注。就丹参提取物、主要单体成分和丹参复方基于细胞色素P450酶(CYP450s)的代谢及药物间相互作用的研究进展进行综述,为丹参及其活性成分的应用和研究提供参考。     

丹参酮ⅡA磺酸钠对小鼠感染人巨细胞病毒肝炎的干预研究

目的:观察丹参酮ⅡA磺酸钠对小鼠感染人巨细胞病毒肝炎的干预作用。方法:选择健康小鼠根据随机原则分为正常对照组、模型对照组以及丹参酮ⅡA磺酸钠组,每组各72只。其中,模型对照组及丹参酮ⅡA磺酸钠组接种后各组大鼠进行配对饲养,观察受精时间并等待各组新生小鼠出生。新生小鼠出生后10日进行治疗,每对小鼠选择生产的新生小鼠1只,共12只;丹参酮ⅡA磺酸钠组予以腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠1.0mL/10g/d,共治疗28日;模型对照组及正常对照组均给予等体积细胞维持液DMEM,使用方法、剂量及使用频率和丹参酮ⅡA磺酸钠组完全相同至实验结束。比较各组小鼠病理学结果、血清肝纤维化指标、肝功能五项以及P450亚型酶活性。结果:与正常对照组相比,模型对照组及丹参酮ⅡA磺酸钠组血清Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原水平较高(P0.05),血清天冬转氨酶、胆汁酸、总胆红素、谷氨酰转移酶、丙氨酸转氨酶水平较高(P0.05),P450亚型酶中CYP2E1、CYPIA2、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4活性较高(P0.05);与模型对照组相比,丹参酮ⅡA磺酸钠组血清Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原水平较低(P0.05),血清天冬转氨酶、胆汁酸、总胆红素、谷氨酰转移酶、丙氨酸转氨酶水平较低(P 0.05),CYP2E1、CYPIA2、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4较低(P0.05)。结论:丹参酮ⅡA磺酸钠能够下调P450亚型酶活性,降低药物代谢时对肝脏的毒性作用,促进肝功能修复,对感染人巨细胞病毒肝炎小鼠有明确的治疗作用,有望为感染人巨细胞病毒肝炎的临床治疗提供新的干预方法。     

丹参中主要活性成分生物合成的研究进展

丹参酮类和丹参酚酸类化合物是丹参中两类主要的活性成分,其含量水平是丹参药效的决定因素,直接体现了药材的品质。为深入解析丹参的品质内涵以提升丹参品质,学者们开展了一系列研究以阐明丹参中活性成分的生物合成机制及累积特征。近年来,随着更高效的基因组、代谢组等研究手段的应用,丹参活性成分的生物合成研究获得了快速发展,本研究对该领域研究进展进行综述,为丹参的活性成分及其药材品质的深入研究提供理论依据。     

茯苓细胞色素P450基因PcCYP的克隆与序列分析

目的 筛选与茯苓Poriacocos生长发育相关的细胞色素P450基因序列,进一步丰富对茯苓生长发育理解。方法通过分子克隆到1个茯苓细胞色素P450基因Pc CYP,并利用在线工具分析其序列,预测蛋白的理化性质、结构域等分子特征;利用MEGA5.0分别对氨基酸进行多序列比对和进化关系分析,并采用q RT-PCR方法检测不同发酵培养时间6、8、10d的相对表达量。结果 从茯苓中克隆到的Pc CYP存在可变性剪切,2个选择性剪切体PcCYP1和Pc CYP2CDS区长度分别为1590、1542bp,分别编码529、513个氨基酸。氨基酸序列分析发现其均具有保守的P450结构域,且具有信号肽和多个磷酸化修饰位点,属于分泌型的不稳定亲水蛋白。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示PcCYP与担子菌Coprinopsis cinerea的CYP502距离最近,推测PcCYP和CYP502具有相似功能,即参与调控茯苓子实体的发育。定量PCR结果显示,选择性剪接变体Pc CYP1的表达量较Pc CYP2低,因此PcCYP2是Pc CYP基因的主要剪接体。结论 Pc CYP与茯苓子实体的生长发育密切相...     

参与植物三萜生物合成的细胞色素P450酶研究进展

三萜是许多药用植物的活性成分,目前已对其生物合成途径进行了大量研究并取得了重大进展。细胞色素P450(CYP450)主要参与三萜的后修饰过程,对三萜的多样性起着关键作用。目前,已从多种植物中克隆得到与三萜生物合成相关的CYP450基因。对参与三萜生物合成的CYP450的功能研究进行综述,为三萜生物合成途径的解析及CYP450的功能研究提供借鉴。