高卢蜜环菌PCR-RFLP快速鉴别方法研究

蜜环菌是名贵中药天麻、猪苓栽培过程中必备的共生菌,蜜环菌的菌索侵入天麻块茎或猪苓菌核后被后者消化利用,成为它们重要的营养源。不同性质的蜜环菌影响天麻、猪苓的生长。作者收集了13个地区的市售蜜环菌,经过IGS鉴定均为高卢蜜环菌。在基因水平和代谢水平上筛选出了蔗糖含量具有显著差异的2种高卢蜜环菌,命名为A型和B型,并建立了简单、准确的高卢蜜环菌DNA分子标记鉴定方法。通过比较高卢蜜环菌A型和B型蔗糖酶基因序列差异,根据差异片段设计聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态(PCR-RFLP)鉴别方法,即引物ZTM.F/ZTM.R可扩增高卢蜜环菌A型和B型,产生约304 bp长度条带,限制性内切酶EcoR V可以识别高卢蜜环菌A型和B型的差异序列,仅高卢蜜环菌B型可以被酶切形成2个片段,从而特异性鉴别高卢蜜环菌为B型。该实验建立的PCR-RFLP可以作为高卢蜜环菌A型和B型的DNA鉴别方法。在天麻和猪苓的栽培过程中,可根据品种、生长阶段、生态环境等不同需要,选择合适的菌株,因地制宜提升它们的产量和品质。     

高温胁迫对蜜环菌生长特性的影响

目的:探究高温胁迫对不同蜜环菌生长特性的影响,为筛选耐高温的优良蜜环菌菌株提供指导。方法:以14株不同天麻产区的蜜环菌为实验材料,观察各蜜环菌菌株的生长特性并进行表型分类;采用rDNA-IGS序列分析进行分子鉴定,进一步确定供试菌株的亲缘关系;以23℃条件为对照(CK),30℃为高温胁迫,记录各菌株生长速度,生物量,菌索长度等指标。结果:14株蜜环菌均与高卢蜜环菌Armillaria gallica相似性最高,亲缘关系最相近;但不同天麻产区的蜜环菌菌株生长特性存在明显差异,将14株蜜环菌分为Ⅳ个类群,其中生长状态:第Ⅰ类群第Ⅱ类群第Ⅲ类群第Ⅳ类群;高温胁迫后,各菌株对高温的耐受性也存在明显差异,表现在菌索平均生长速度GZ16SX1GZ1;相对菌索长度GZ16SX1GZ3;相对生物量GZ16SX4GZ1HB1AH2;生长状态GZ16SX1GZ1。结论:高温胁迫下,GZ16在生长速度,相对菌索长度,相对生物量及生长状态等均最优,SX1,GZ1菌株次之。表明菌株GZ16,SX1,GZ1耐高温能力较强,且这3个菌株在正常温度下生长特性也优良,适宜全国主要天麻产区生产。     

蜜环菌耐低温菌株的筛选及生理机制探讨

目的：探究低温胁迫对不同蜜环菌生长的影响,为高海拔地区天麻种植选育耐低温的优良蜜环菌菌株提供科学依据。方法：以不同天麻产区的24株蜜环菌为实验材料,采用rDNA-基因间隔区（IGS）序列进行分析鉴定,确定供试菌株的亲缘关系;以23℃为对照（CK）、15℃为低温胁迫,利用赋值法综合评价各菌株生长速率、生物量、菌索长度,筛选耐低温的优良菌株,采用蒽酮硫酸法检测可溶性糖含量,利用SPSS 26.0分析低温胁迫可溶性糖含量与生长特性的相关性。结果：24株蜜环菌均与高卢蜜环菌Armillaria gallica亲缘关系较相近。低温胁迫后,各菌株的生物量、菌索长度、生长速率均受到不同程度的抑制,根据赋值法综合评价,有4株菌株的耐低温能力较强、可溶性糖含量均增加,而对于低温较为敏感的菌株可溶性糖含量均降低。相关性分析结果表明,可溶性糖含量与生物量、菌索长度、生长速率呈强正相关。结论：高卢蜜环菌为天麻生产中常用伴生菌种,YN4、GZ7、GZ17、SX2菌株的耐低温能力较强,推测蜜环菌通过累积可溶性糖抵御低温胁迫。     

蜜环菌菌株对天麻素含量的影响

目的:研究蜜环菌对天麻素含量的影响,为蜜环菌菌株选育提供科学依据。方法:采用蜜环菌不同菌株与天麻不同品种伴栽试验。结果:天麻品种和蜜环菌都能影响天麻素含量,杂交种F1的天麻素含量优势明显,与采自韩国的蜜环菌B1伴栽的天麻素含量最高。     

高卢蜜环菌几丁质酶基因的生物信息学分析与表达

高卢蜜环菌是一种兼性寄生真菌,在天麻栽培过程中作为天麻的唯一营养源。几丁质酶作为一种糖苷水解酶,在高卢蜜环菌的生长发育及其与天麻的共生过程中发挥重要作用。高卢蜜环菌几丁质酶基因共有22条,对这些几丁质酶基因的氨基酸序列进行生物信息分析,发现有12条几丁质酶基因均含有糖苷水解酶18家族(GH18)结构域。对高卢蜜环菌、奥氏蜜环菌、天麻、酿酒酵母和哈茨木霉的几丁质酶氨基酸序列进行系统进化分析,进一步预测高卢蜜环菌中几丁质酶基因功能。利用独角金内酯类似物GR24诱导高卢蜜环菌分枝,并分析22条几丁质酶基因的表达模式,发现8条基因可能参与蜜环菌分枝、细胞壁降解和重塑等生理过程。     

滇西南地区不同道地树种对蜜环菌生长的影响

目的:筛选滇西南地区最适合天麻蜜环菌生长的道地树种。方法:选用滇西南地区32种常见阔叶树种,制作蜜环菌三级种培养基培养蜜环菌,比较蜜环菌在不同树种中的生长速度及菌索生长状况。结果:白檀培养基中,蜜环菌的生长速度快,菌索发生变异,呈扇形,生长状况良好;蜜环菌在欧洲山毛榉等20种树种配制的培养基中,菌索的生长速度和菌索外部形态特征都正常;紫丁香、木通、木莲、厚皮香、金叶子、辣木树、化香树、团香果、白杜鹃和多花含笑,这11种树种的蜜环菌生长速度和生长状况不理想。结论:白檀是培养蜜环菌三级种的优良树种;欧洲山毛榉等20种树种也可做为蜜环菌三级种培养的培养基成分;紫丁香等11种树不适合蜜环菌的生长,不能作为蜜环菌培养的培养基成分。     

蜜环菌菌材高效培养体系的建立

目的:建立蜜环菌菌材的高效培养体系。方法:在不同母种培养基、pH、温度、原种培养料、菌材培养料、坡向等条件下对蜜环菌进行培养,测定蜜环菌菌索的长度、干重及桦木段和猪苓苓种接菌率。结果:松针培养基中蜜环菌菌索长度比玉米浆培养基、牛肉膏培养基、松香培养基分别高出45.2%、8.0%、43.2%,干重分别高出121.5%、33.7%、211.2%;pH5、pH6和pH7条件下蜜环菌菌索长度和干重差异不显著,但显著高于pH4;20℃和25℃条件下蜜环菌菌索长度和干重显著高于15℃和30℃;桦木屑培养料中蜜环菌菌索生长最快,菌索干重最大;0.25%NH_4NO_3溶液浸泡桦木段和湿树叶伴栽可显著提高桦木段和苓种接菌率;桦木段和苓种在半阴半阳坡的接菌率显著高于阳坡和阴坡。结论:蜜环菌菌材高效培养体系:以松针培养基做为母种培养基,pH为5~7;以桦木屑培养料做为原种培养料;以"桦木段(0.25%NH_4NO_3溶液浸泡)+湿树叶+腐殖土"做为菌材培养料;室内培养温度为20~25℃,室外培养宜在半阴半阳坡选址。     

不同树种树枝对蜜环菌生长的影响

选用北方常见树种的树枝,接种培养蜜环菌,比较蜜环菌的生长速度、胞外漆酶酶活力及菌索的生长状况.结果显示:除了槐树、紫穗槐外,蜜环菌在桃树、梨树等多种树枝上均能正常生长,有希望用于栽培天麻的菌枝、菌棒.     

天麻无棒代料高产栽培技术

天麻(Gastrodia elata)传统栽培方法是利用蜜环菌(Armillaria mellea)菌索和木材培养菌材,进行菌材伴栽。这不仅消耗大量木材,而且,由于菌材培养和天麻栽培过程中发菌缓慢、易遭杂菌污染,缩短了天麻生长时对土壤温度有效期(10cm土温15～25℃)的利用和水热条件的有效控制。特别是低海拔地区     

SmartRoot在蜜环菌菌索表型谱分析中的应用

目的:建立获取精确的表型谱数据研究平台,是目前中药资源研究亟待解决的技术难点。如传统的蜜环菌菌索表型表征方式多为描述性文字,存在较大的主观性和经验性,亟需一种客观并准确的方法进行蜜环菌菌索表型的表征。方法:基于图像处理软件Image J和根系识别插件SmartRoot与Synbiosis ProtoCol 3影像分析仪相结合,对蜜环菌平板生长图片进行分析,测定蜜环菌菌索长度、生长速度、分枝情况、新生菌索夹角等,建立蜜环菌菌索表型谱分析测量体系。结果:基于该文开发的方法,可以在不影响蜜环菌生长情况下,实时分析蜜环菌菌索的生长长度、生长速度、分枝数、新生菌索夹角等表型谱变化,继代后9～12 d的蜜环菌生长最为迅速,新生菌索与母体菌索之间夹角接近垂直。该方法与传统的蜜环菌生物量表型参数干重呈现一定的相关性,具有较好的实际应用价值。结论:该研究建立了一套客观、准确、快捷和实时的蜜环菌菌索表型谱分析测量体系,拓展了SmartRoot的应用范围,可用于受控实验条件下中药资源的表型谱分析。     

不同来源蜜环菌对天麻产量影响的研究

目的：研究不同来源的11个蜜环菌菌株对天麻产量的影响。方法：有性繁殖,采用菌枝加新材的播种方法,一年半收获,结果：蜜环菌A9,A10伴栽的天麻产量最高,为16．14和15．23kg/m^2。结论：不同来源蜜环菌对天麻产量具有不同的作用。     

野生、退化、复壮蜜环菌对天麻产量及天麻素量的影响

目的 通过复壮已退化的蜜环菌,恢复其促进天麻生长及天麻素积累的作用.方法 将相同来源的蜜环菌Arrmillearia mellea野生菌种、该野生菌种连续无性繁殖退化的后代菌种以及退化后复壮的黹种接种到同一品种的天麻Gastrodia elata上进行栽培试验,测定大麻的生物产量和天麻素质量分数.结果 野生菌种组与退化菌种组相比较、复壮菌种组与退化菌种组相比较在天麻产量、天麻素质量分数上有显著性差异(P<0.01).结论 采用诱导子实体方法可以使退化的蜜环菌复壮,其促进天麻生长、天麻素积累的作用也得以恢复.     

猪苓培养条件的确立及其与蜜环菌共同培养的研究

目的确立猪苓母种和原种的培养条件,揭示猪苓菌丝和蜜环菌菌索共同培养条件下的生长特性。方法采用培养皿固体培养法,定期测定分析猪苓菌丝和蜜环菌菌索的形态特征及生长指标。结果黄豆饼粉培养基以麸皮做碳源较好,C∶N以4∶1为佳。在母种培养基上,猪苓菌丝的长速显著高于蜜环菌菌索,蜜环菌菌索可穿透猪苓菌丝而继续生长。在原种培养基上猪苓菌丝可正常生长,蜜环菌菌索生长受抑制。结论明确了猪苓母种和原种的最佳培养条件及其与蜜环菌共培养的生长特性。     

云南省腾冲县八种树材用于培养蜜环菌栽培菌棒的研究

目的:合理利用当地林木资源,寻找更多适合天麻蜜环菌栽培生长的树材;方法:通过前期的三级种培养筛选试验之后,有目的性地选取云南腾冲县八种当地常见树种制成菌棒,每种菌棒种1 m2,三个重复,培养蜜环菌栽培种,观察不同树材的接菌速度、接菌率、蜜环菌菌索生长速度以及树材特性;结果:欧洲山毛榉和酸角树接菌速度快,接菌率高,菌索生长速度也较快;金叶子、厚皮香、桤木、西南桦的综合情况也较好;结论:实验结果证明,八种树材中除了白杜娟和南烛综合情况不理想之外,其他六种树材都适合作为培养蜜环菌的菌材,其中豆科、山茶科和杜鹃花科属于以前没有用于生产过蜜环菌栽培种的的树种。     

蜜环菌胞外酶和多糖含量变化规律研究

目的:比较高卢蜜环菌M1、M2两菌株胞外酶活性、菌丝多糖变化规律及菌株生长量,初步筛选出优良菌株。方法:利用改良PDA固体培养基培养菌株M1和M2,采用十字交叉法测定生长量,ABTS法及DNS显色法检测胞外酶活性,用浓硫酸-苯酚法对二者多糖含量进行测定。结果:M1菌株生长速度快,菌索粗壮,分支较多,长势较好。木聚糖酶是蜜环菌主要作用的胞外酶,其活力远高于纤维素酶、漆酶和果胶酶,M1菌株的木聚糖酶活力更高。M1和M2菌丝体多糖含量最高分别为38.958 mg/g和32.717 mg/g,多糖的累积与其分泌的胞外酶漆酶、木聚糖酶活力呈现显著相关性。结论:通过对M1、M2两菌株生长量、胞外酶活力及菌丝体多糖的比较和分析,初步认为M1为优势菌株。     

5种土壤改良剂对连作天麻和蜜环菌生长及土壤微生物的影响北大核心

目的:探究5种不同土壤改良剂对连作天麻和蜜环菌生长及根际微生物群落结构的影响,筛选缓解天麻连作障碍的土壤改良剂。方法:采用随机抽样调查法,统计各处理天麻和蜜环菌的生长情况,利用Illumina MiSeq测序平台,分析各处理土壤微生物真菌群落结构。结果:5种土壤改良剂(A.石灰;B.腐殖酸肥;C.枯草芽孢杆菌剂;D.哈茨木霉菌剂;E.抗重茬菌剂)均能降低母麻腐烂指数9.07%~63.60%,其中改良剂B、C、D和E能够提高天麻产量59.71%~424.83%,降低天麻感病指数34.29%~82.86%。改良剂B和D能促进蜜环菌的健壮程度和菌索粗度,5种改良剂能增加蜜环菌干重4.49%~83.06%,提升蜜环菌侵染指数4.90%~24.82%。5种改良剂对连作天麻生长的改善效果为D>E>C>B>A,促进连作天麻窝穴中蜜环菌生长由强到弱的顺序为D>B>C>A>E。天麻根际微生物研究中,改良剂A和E施用后土壤中真菌多样性增加,改良剂A、B和D可以增加真菌的丰富度,改良剂D和E与天麻正茬的真菌群落结构相似度高,改良剂C和E能降低天麻根际土壤中致病菌的丰富度,5种改良剂对天麻根际土壤真菌群落结构的改善效果为D>E>B>C>A。结论:5种土壤改良剂中,哈茨木霉菌剂对缓解天麻连作障碍效果最佳,其次是抗重茬菌剂,石灰效果最差。     

蜜环菌对天麻生长的影响(简报)

<正> 我所在1968年利用蜜环菌材伴栽天麻首次获得成功后,于1978和1979年进行了室内利用高山野生蜜环菌材伴栽天麻试验,获得了下种量的12.9倍和13.5倍的增产效果。但在1980和1981年我们又发现,采用经过10年低海拔(600米)人工培养的原高山野生蜜环菌菌材伴栽天麻,收获量却只有下种量的74%和10%。为了搞清造成这种现象的原因,我们在1982和1983年进行了此项研究,现将获得的初步结果报道如下:     

天麻褐腐病病原菌的分离鉴定及致病性研究北大核心CSCD

褐腐病是天麻种植生产上的高发病害,但其病原菌尚不明确。该文从77份感染褐腐病天麻块茎中分离纯化病原菌,通过致病性试验、形态和分子鉴定明确病原菌,比较了各病原菌的致病力及其对天麻营养菌的抑制作用。结果显示,在褐腐病害天麻块茎样本中共分离获得119株真菌,其中,土赤壳属真菌的分离频率最高,为42.01%。经致病性验证表明有6株真菌的致病特征与田间自然发病症状一致。形态和分子鉴定结果显示,该6株真菌分属于粪壳菌纲丛赤壳科土赤壳属真菌Ilyonectria cyclaminicola和I.robusta;2类真菌均能产色素、分生孢子和厚垣孢子,其中I.cyclaminicola的生长速度显著高于I.robusta。致病力比较结果显示,接种I.cyclaminicola所形成的病斑显著大于I.robusta接种组,提示I.cyclaminicola对乌天麻的致病力高于I.robusta。对峙培养结果显示,I.cyclaminicola和I.robusta均能够显著抑制蜜环菌的萌发及菌索的生长;蜜环菌亦能抑制病原菌的生长,且I.cyclaminicola受抑制程度小于I.robusta。该研究首次揭示了I.cyclaminicola和I.robusta是天麻褐腐病的致病菌。     

药用真菌猪苓共生的蜜环菌种类研究

 目的 对国内猪苓产区与猪苓共生的蜜环菌种类进行探究。方法 经PDA平板培养后长出健壮的蜜环菌根状菌索。运用IGS测序技术对分离的22株蜜环菌菌株的纯培养菌种进行分子鉴定,并基于蜜环菌的IGS序列进行核酸序列数据库GenBank同源序列比对、构建系统发育树。结果 本实验获得的猪苓菌核组织分离的22株蜜环菌菌株为其纯培养菌种。基于IGS的系统发育分析表明,与猪苓菌核共生的蜜环菌分别属于Armillaria cepistipes, A.gallica, A. ostoyae以及A. mellea 4个种,其中A.cepistipes, A. gallica分别分离得到10株,为优势种。结论 猪苓共生对蜜环菌物种专一性较低,与相关书籍及文献报道的与猪苓共生蜜环菌为单一A. mellea种的结论不符。与猪苓共生的蜜环菌多样性及不同种类蜜环菌对猪苓菌核生长发育的影响需进一步研究。     

天麻-冬荪轮种模式对土壤微生物群落结构的影响

天麻-冬荪轮种模式是贵州产区采用的一种新型种植模式,但是天麻-冬荪的种植对土壤微生物群落结构的影响尚不清楚。因此,该研究采集未种植天麻土壤为对照(CK),分别采集天麻块茎际土壤(GE)、蜜环菌菌索区际土壤(AGE)、天麻-冬荪轮作后的白鬼笔Phallus impudicus菌丝区际土壤(PI),采用ITS和16S rDNA高通量测序技术对土壤真菌和细菌的群落组成进行测定分析。结果表明,通过OTU聚类和主成分(PCA)分析发现,AGE和GE土壤微生物聚为一类,PI和CK土壤微生物聚为一类;与CK相比,AGE和GE土壤微生物的多样性和丰度均显著增加;而与AGE和GE相比,PI土壤微生物的多样性和丰度均降低。物种注释表明,与CK相比,AGE和GE土壤中担子菌门Basidiomycota、酸杆菌门Acidobacteria、绿弯菌门Chloroflexi的丰度明显减少,而子囊菌门Ascomycota、接合菌门Zygomycota、变形菌门Proteobacteria丰度明显增加;与AGE和GE相比,PI则与之相反,PI与CK土壤微生物丰富度较为相似。此外,蜜环菌与冬荪菌共培养表明冬荪菌可以明显抑制蜜环菌的生长。由此推测,冬荪菌对土壤微生物群落结构的影响表现为通过抑制蜜环菌的生长,从而使土壤微生物群落结构得以恢复。