动态调控酿酒酵母ERG20基因表达提高单萜化合物的生产北大核心CSCD

单萜类化合物被广泛应用于化妆品、食品、医药、农业等领域。随着合成生物学的发展,利用合成生物学技术创建"微生物细胞工厂"进行单萜类化合物生产被认为是一种非常有潜力的方式。然而,在酿酒酵母中牻牛儿基焦磷酸(GPP)和法尼基焦磷酸(FPP)是由一种双功能酶法尼基焦磷酸合成酶(ERG20基因编码)连续催化产生,而且ERG20更加倾向于合成酵母生长必需的FPP,因此合理控制FPP合成是在酵母细胞工厂中实现单萜高效合成的基础。为了实现酿酒酵母工程菌中生物合成GPP到FPP的动态节流,该研究应用基因编辑技术将底盘菌HP001的ERG20的启动子替换为环氧鲨烯环合酶(ERG1基因编码)启动子pERG1,获得新型单萜底盘菌HP001-pERG1-ERG20。进一步,分别利用以GPP和橙花基焦磷酸(NPP,cis-GPP)为底物的生物合成途径对底盘菌生产能力进行了验证,其中以GPP为前体的芳樟醇产量达到7.6 mg·L^(-1),提升了42.5%;以NPP为前体的橙花醇的产量达到8.3 mg·L^(-1),提升了1436.4%。该研究为微生物发酵法生产单萜化合物提供了基础。     

千里光橙花叔醇合酶SsNES的功能鉴定

通过对千里光转录组数据筛选得到一个较短的萜类合酶基因。对其进行系统进化树和序列比对分析,初步确定为一个橙花叔醇合酶,命名为SsNES (GenBank登录号MH518312)。通过蛋白同源建模表明SsNES虽然序列较短,但具有完整的保守功能域,并且能正确折叠。通过对该基因的克隆,原核表达载体的构建,成功在大肠杆菌中表达出可溶性蛋白;用大肠杆菌代谢工程鉴定SsNES的体外催化功能,结果表明SsNES可以催化反式法尼烯焦磷酸(FPP)生成反式橙花叔醇。在千里光茎叶的提取物中也检测到反式橙花叔醇,表明该基因作为橙花叔醇合酶在千里光中行使功能;通过RT-PCR表达模式的分析,SsNES在茎中表达最高,其次是花、叶,在根中不表达;在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、丙甲菌素(Ala)的处理后该基因均能在6 h时就被诱导表达,表明该基因可能参与到千里光应对胁迫响应的防御过程中。SsNES生化功能的鉴定不仅为倍半萜合酶的研究提供多样性,也解析了千里光中橙花叔醇的生物合成,为千里光萜类化合物介导的病虫害防御提供理论基础。     

千里光橙花叔醇合酶SsNES的功能鉴定北大核心CSCD

通过对千里光转录组数据筛选得到一个较短的萜类合酶基因。对其进行系统进化树和序列比对分析,初步确定为一个橙花叔醇合酶,命名为SsNES (GenBank登录号MH518312)。通过蛋白同源建模表明SsNES虽然序列较短,但具有完整的保守功能域,并且能正确折叠。通过对该基因的克隆,原核表达载体的构建,成功在大肠杆菌中表达出可溶性蛋白;用大肠杆菌代谢工程鉴定SsNES的体外催化功能,结果表明SsNES可以催化反式法尼烯焦磷酸(FPP)生成反式橙花叔醇。在千里光茎叶的提取物中也检测到反式橙花叔醇,表明该基因作为橙花叔醇合酶在千里光中行使功能;通过RT-PCR表达模式的分析,SsNES在茎中表达最高,其次是花、叶,在根中不表达;在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、丙甲菌素(Ala)的处理后该基因均能在6 h时就被诱导表达,表明该基因可能参与到千里光应对胁迫响应的防御过程中。SsNES生化功能的鉴定不仅为倍半萜合酶的研究提供多样性,也解析了千里光中橙花叔醇的生物合成,为千里光萜类化合物介导的病虫害防御提供理论基础。     

高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创建

橙花叔醇为萜类精油成分,具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性。为了实现在酿酒酵母中异源生产橙花叔醇,该研究首先将猕猴桃Actinidia chinensis来源的橙花叔醇合酶(NES)基因通过密码子优化、人工合成后转入底盘菌株FPP-001中获得工程菌株NES-001,其橙花叔醇产量达到2.71 mg·L~(-1)。在进一步工作中,橙花叔醇合酶的N端通过连接肽GGGS融合法尼烯合酶(FPS)后得到橙花叔醇产量显著提高的工程菌NES-002,其产量是NES-001的59.80倍,达到162.07 mg·L~(-1)。最终,通过恢复NES-002中色氨酸生物合成缺陷基因TRP1得到工程菌NES-003,该菌在高密度发酵体系中橙花叔醇产量能达到1 711.53 mg·L~(-1)。该研究为微生物发酵法生产橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基础。     

唇形科植物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因及其氨基酸序列的生物信息学分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)是二萜类物质合成途径中的一个关键酶。该文采用生物信息学方法对9种唇形科植物的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的核苷酸及其编码的氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性和亚细胞定位特征、二级结构、蛋白质功能域、三级结构和进化关系进行了初步预测和分析,并构建了牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶蛋白家族的系统进化树。结果表明,9种唇形科植物的GGPS氨基酸序列理化性质基本一致,主要表现为亲水性蛋白,有叶绿体转运肽,不存在信号肽,没有跨膜结构域;大多数定位于叶绿体,少数定位于线粒体。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,含有多聚异戊二烯基合成酶的活性结构域、2个天冬氨酸富集区结构域、活性位点残基盖结构域和镁离子结合位点结构域。研究结果将为GGPS的酶学特性及二萜类生物合成的分子机制研究提供理论参考。     

阳春砂龙脑基二磷酸合酶关键氨基酸位点筛选及突变体的构建

目的 对阳春砂萜类合成关键酶龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS)催化生成龙脑基二磷酸(bornyl diphosphate,BPP)的关键氨基酸位点解析,为阳春砂BPPS的功能优化并且促进其在代谢工程中的应用奠定基础.方法 比较阳春砂、海南砂的BPPS (AvBPPS、A...     

一个紫芝多产物倍半萜合酶的功能鉴定

目的:紫芝是我国最著名的药用真菌之一,作为担子菌亚门的模式药用真菌,其倍半萜合酶的功能鉴定对真菌倍半萜的生物合成与调控研究具有重要意义。方法:通过挖掘紫芝基因组数据发现一个灵芝倍半萜合酶基因,将其与已经鉴定的两个紫芝倍半萜合酶和非冗余蛋白数据库(Nr数据库)中与其同源性最高的3个萜类合酶进行多重序列比对分析其保守结构域。然后,在大肠埃希菌中进行异源表达,通过SDS-PAGE对其蛋白表达情况进行检测。利用固相微萃取收集挥发性物质,并通过GC-MS对其产物进行检测。结果:该酶含有倍半萜保守基序DDXXDE和NSE/DTE,可在大肠埃希菌中可溶性表达,GC-MS分析发现,该酶可以内源性法尼基焦磷酸(FPP)为底物合成11种倍半萜类化合物,出峰时间为18. 6 min的产物α-cadinol是主要产物,已有研究表明α-cadinol具有明显的抗癌活性。通过与对照品比对进一步确定其中3个产物分别是γ-muurlene,α-muurolene和δ-cadinene。结论:紫芝多产物倍半萜合酶的功能鉴定可推动其产物多样性的形成机制研究,为通过酶工程技术改良酶的催化活性生产稀有或新型倍半萜类化合物奠定基础。     

濒危药用植物茅苍术法呢基焦磷酸合酶基因克隆及其表达分析

目的克隆茅苍术Atractylodes lancea倍半萜类成分生物合成关键酶法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因全长并分析其表达规律。方法以茅苍术总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆茅苍术FPPS基因(Al FPPS)的c DNA全长,并进行生物信息学分析;用q RT-PCR和GC-MS分析不同生长阶段FPPS在茅苍术根茎中的表达及倍半萜类成分量变化,并分析二者的相关性。结果获得Al FPPS基因全长c DNA为1 320 bp(Gen Bank accession no.KX443242),含一个长1 029 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸,包含5个保守功能域,其中2个富含天冬氨酸(DXXDD)。q RT-PCR及GC-MS结果显示不同时期茅苍术Al FPPS基因表达量与倍半萜类成分量呈显著正相关。结论首次克隆获得Al FPPS基因的全长c DNA,初步证明Al FPPS基因是茅苍术倍半萜类成分生物合成途径中的重要调控位点,为茅苍术倍半萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据。     

大肠杆菌组合生物合成紫杉烯的研究

 目的在大肠杆菌中建立一个能够生物合成紫杉烯(紫杉醇生物合成的第一个重要中间体)的代谢途径。方法利用PCR方法克隆编码大肠杆菌1-脱氧-5-磷酸木酮糖(D-1-deoxyxylulose 5-phosphate,DXP)合酶和异戊烯二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)的基因,以及编码辣椒(Capsicum annuum)牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate,GGDP) 合酶的基因。分别构建含DXP合酶基因的表达载体pSLB208/DXP和含GGDP合酶与IDI异构酶基因的融合表达载体pAIG。将含紫杉烯合酶的表达载体pETB3和本研究构建的这2个表达栽体共转化大肠杆菌,诱导4个基因在大肠杆菌中共表达;并通过GC-MS分析大肠杆菌工程菌的代谢产物。结果在大肠杆菌中构建了一个合成紫杉烯的途径,通过GC-MS分析检测到紫杉烯的合成。结论利用代谢途径工程合成紫杉醇中间体是可行的,可为其他萜类化合物中间体代谢工程研究提供坚实的物质基础。     

建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究

泽泻鲨烯合酶(Ao SS)催化法呢基焦磷酸[(farnesyl diphosphate,FPP)]合成鲨烯,是碳源流向原萜烷型三萜生物合成的关键调节酶。为深入研究Ao SS基因的功能及表达,课题组将前期克隆获得的建泽泻鲨烯合酶基因(accession No.JX866770)的开放阅读框(ORF)构建到原核表达载体p Czn1上,并在大肠杆菌BL21(Roseta)中进行诱导表达,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经纯化获得高纯度的目的蛋白;以此目的蛋白进行体外酶促反应验证其功能,其结果显示该目的蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鲨烯的活性;为进一步研究其表达规律,在此基础上,利用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体并纯化,ELISA检测抗体效价大于1∶51 200,Western blotting检测表明其具有较好的特异性;用制备得到的抗体免疫检测建泽泻Ao SS在不同组织中的表达情况,结果显示建泽泻块茎中Ao SS表达最高,其次为叶,根中表达甚微。原核表达载体的成功构建、基因功能的进一步验证及快速免疫检测方法的建立,为进一步开展Ao SS基因功能及其调控的研究奠定基础,为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的合成生物学应用提供科学依据。     

肥料配施对北苍术3种倍半萜类成分及2种生物合成关键酶基因表达的影响

目的 探讨不同肥料配施对北苍术Atractylodes chinensis (DC.) Koidz. 3种倍半萜成分苍术酮、白术内酯II和β-桉叶醇含量及2种生物合成关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutarate monoacylase A reductase,HMGR）和法呢基焦磷酸合酶基因（farnesylpyrophosphatesynthase,FPPS）活性及基因表达的影响。方法 在不同的肥料配施下,采用高效液相色谱法测定北苍术3种倍半萜类成分的含量,采用试剂盒法（双抗体夹心法）测定北苍术根茎中HMGR和FPPS的活性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定北苍术HMGR和FPPS的表达量;采用SPSS软件对生物合成关键酶活性和基因表达量进行相关性分析。结果 适宜的氮磷钾配施,可促进北苍术倍半萜类成分的积累,并显著提高其生物合成关键酶活性及基因表达。该试验区所代表的土壤肥力状况下有利于倍半萜类成分积累的最优施肥方案为氮肥（N）180kg/hm2,磷肥（P2O5）225kg/hm2,钾肥（K2O）105kg/hm2...     

中草药重要功能成分α-法尼烯检测方法建立

目的 α-法尼烯在一系列中草药中发挥着重要作用.本研究将利用生物合成法合成α-法尼烯,并建立一种灵敏、快速检测细胞提取物中α-法尼烯成分的方法.方法 通过构建表达α-法尼烯合酶质粒,将其转入大肠杆菌,诱导该酶在细菌内进行表达并利用大肠杆菌MEP途径的代谢产物法尼基焦磷酸(FPP)作为底物,生产α-法尼烯;经正十二烷萃取...     

岗梅转录组及其乌索烷型三萜皂苷生物合成相关酶基因的发掘

目的：发掘与岗梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。方法：利用Illumina 测序平台对岗梅根进行转录组测序,通过基因注释、同源分析、系统发生分析等生物信息学手段,发掘可能参与合成的单基因簇（Unigenes）。结果：在岗梅根转录组中发现了272 条与萜类生物合成相关的Unigenes。这其中包括72 条可能参与萜类生物合成上游途径的Unigenes,以及26 条可能与三萜合成途径下游母核合成、氧化和糖基化相关的Unigenes。对其中部分Unigenes 进行系统发生分析,进一步揭示了这些Unigenes 与同源基因间的进化关系。利用酵母表达系统,鉴定了两个香树酯醇合酶IaAS1 和IaAS2,其中IaAS1 为少数以α-香树脂醇为主要产物的香树酯醇合酶之一。结论：本文从岗梅根转录组数据库中发掘到一系列可能与岗 梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。对这些基因的进一步研究,有助于从分子水平揭示岗梅中乌索烷型三萜皂苷的生物合成途径。     

广藿香转录因子PcFBA-1的克隆及与FPPS启动子的互作调控分析

法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPPS)是倍半萜生物合成途径分支点的关键酶,但目前尚未有广藿香FPPS启动子的转录调控研究相关报道.该研究前期挖掘获得广藿香FPPS基因启动子的结合蛋白PcFBA-1,为了探究PcFBA-1参与调控广藿香醇生物合成的可能机制,对PcFBA-...     

药用植物甾体皂苷生物合成途径研究进展

甾体皂苷是药用植物中普遍存在的一类功效物质,由糖基和甾体皂苷元缩合而成,甾体皂苷的生物合成途径主要包括细胞质甲羟戊酸(MVA)途径和质体2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)两条途径,并以MVA途径为主。在生物合成途径中涉及一系列关键酶,包括3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR),1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS),1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR),法尼基焦磷酸合酶(FPS),鲨烯合酶(SS),鲨烯环氧酶(SE),环阿屯醇合酶(CAS),细胞色素P450酶(CYP450),糖基转移酶(SGTase)等。在综合前人研究的基础上,该文对甾体皂苷生物合成途径路线图进行了补充和细化,而对近5年来有关药用植物甾体皂苷生物合成关键酶(基因)生物学信息研究报道整理发现,药用植物中HMGR,SS,CYP450,UGT基因研究相对较多,而对FPS,SE,CAS的报道则较少。整体来看,目前对甾体皂苷生物合成途径研究尚处于初级阶段,对于关键酶功能研究缺乏强有力的直接证据。可为甾体皂苷的后续研究提供参考和理论支撑。     

雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析

根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1,TwGPPS2全长cDNA,并进行生物信息学分析和蛋白表达研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp,编码425个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.68,相对分子质量为47.189 kDa;TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp,编码422个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.71,相对分子质量为46.774 kDa;进一步构建了原核重组表达载体pET-32a-TwGPPS1,pET-32a-TwGPPS2,并成功诱导出TwGPPS1,TwGPPS2重组蛋白,为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

阳春砂3个萜类合酶基因启动子的克隆及其参与萜类调控的分析

目的获得药用植物阳春砂Amomum villosum萜类合酶基因Av BPPS(bornyl diphosphate synthase)、AvLIS(linalool synthase)和AvHUS(humulene synthase)的启动子,探究其顺式作用调控元件参与萜类合成的调控。方法从阳春砂叶片基因组DNA(genomic DNA,gDNA)中分别克隆获得AvBPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA序列,据此设计特异引物,再通过FPNI-PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)方法分别克隆其启动子并进行生物信息学分析,结合转录组及对应萜类含量数据,分析其较为关键的顺式作用调控元件与萜类调控的关系。结果获得Av BPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA长度分别为2374、2295、2362 bp,均包含相应基因的完整编码区和7个外显子。进一步克隆获得470、934、762 bp的启动子。AvBPPS启动子含有参与胚乳表达的顺式作用调控元件GCN4-motif,结合基因表达量的分析,该顺式作用调控元件调控了AvBPPS在阳春砂药用部位种子中的特异表达,进而影响了主要药效萜类成分龙脑、乙酸龙脑酯等在种子中的积累。AvLIS和AvHUS启动子均含有参与茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)反应的顺式作用调控元件,转录组和萜类含量的分析显示AvLIS响应高浓度MeJA的诱导,而AvHUS没有表现出对MeJA的响应。结论首次从药用植物阳春砂的启动子中发现了参与胚乳表达和MeJA反应的调控元件,为深入探究萜类合成关键酶的种子表达特异性和对MeJA响应的机制提供了基础,为萜类代谢的调控提供了操作元件。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

茅苍术DXS基因的克隆与分析

目的:克隆茅苍术萜类化合物生物合成关键酶1-脱氧木糖-5-磷酸合酶(DXS)基因,并进行序列特征分析和组织特异性表达分析。方法:根据转录组测序所得的DXS基因片段,克隆出全长c DNA序列。运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),以tublin为内参基因,检测DXS基因在不同组织中的表达量。结果:克隆得到的DXS基因全长c DNA序列为2 151 bp,编码716个氨基酸,并在Gen Bank注册(登录号KY659208)。氨基酸序列系统发育分析表明,该序列与甜叶菊等菊科植物DXS基因有较高的同源性。Real-time PCR法检测发现茅苍术DXS在叶片中表达量最高,其次为花,而在根茎和根中表达很低。结论:获得了茅苍术DXS基因的全长c DNA序列,对其进行了初步生物信息学分析,揭示了其组织差异性表达特征,为进一步阐述该基因在茅苍术萜类成分生物合成途径中的功能奠定了基础。