src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF-α

目的 探讨src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响.方法 体外培养Wistar大鼠PMVEC,按随机数字表法分组(n=4),10 mg/L LPS刺激1h、3h、6h、12h、24 h或0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L LPS刺激24 h;蛋白激酶C抑制剂(BIM)预处理0.5h或50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC 48 h后再加入10 mg/L LPS孵育24 h,酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清TNF-α量(ng/L).采用SPSS10.0软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,以P＜ 0.05为差异具有统计学意义.结果 0.1、1、10 mg/L LPS刺激PMVEC 24 h后的,TNF-α分泌量分别为(253.70±23.55)、(327.88±37.25)、(403.20±36.22) ng/L,均高于未刺激组(82.28±22.56) ng/L(均P =0.000);10 mg/L LPS刺激PMVEC后,TNF-α分泌量于1h升高(170.11±49.22) ng/L,6h达峰值(404.82±13.78) ng/L,刺激24 h后仍维持高水平(395.67±36.23) ng/L,分别与未刺激组(84.60±23.61) ng,/L比较:P=0.001,0.000,0.000;BIM预处理PMVEC后再给予LPS刺激,TNF-α分泌量(200.44±27.39) ng/L较LPS单独刺激(402.28±31.07) ng/L显著较少(P=0.000);与LPS单独刺激比较(407.28±32.64) ng/L,SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS表达后,LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应(195.20±13.28)ng/L也显著下降(P=0.000).结论 下调SSeCKS表达和蛋白激酶C活性可抑制LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应,从而减轻PMVEC的炎症反应.     

间充质干细胞对巨噬细胞活化及其功能影响的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞活化的影响.方法 采用贴壁筛选法分离、纯化小鼠骨髓MSC,巯基乙酸钠腹腔注射刺激后收集小鼠腹腔巨噬细胞(MPM).实验分为四组(A组:MPM;B组:MPM+LPS;C组:MPM+LPS+MSC;D组:MPM+LPS+MSC上清),建立共培养体系.在LPS(终浓度1 μg/ml)刺激巨噬细胞18 h后收集细胞培养上清,检测TNF-α、TGF-β和一氧化氮(NO)等细胞因子分泌量的变化,同时在体系中加入大肠杆菌标准菌株ATCC25922,共孵育24 h后瑞特染色检查巨噬细胞吞噬功能的变化.结果 巨噬细胞活化后培养上清中TNF-α和NO的含量明显上升[分别为(147.4±37.1)pg/ml,(59.9±8.7)μmol/L];而MSC存在时,TNF-α显著减少[(97.6±30.3)pg/ml,P=0.032],NO降到(50.9±29.5)μmol/L(P＞0.05);当有MSC上清存在时,TNF-α和NO进一步减少为(58.3±31.5)pg/ml,(-3.4±2.3)μmol/L(P＜0.01).MSC对巨噬细胞活化后的吞噬率及吞噬指数没有影响.结论 MSC可抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的活化,而对其吞噬功能没有影响.     

谷氨酰胺在体内/外对巨噬细胞炎症因子分泌的影响

目的 观察谷氨酰胺(Gln)在体内/外条件下对巨噬细胞炎症反应及热休克蛋白(HSP)表达的影响,探讨Gin在脓毒症时抑制体内炎症反应的机制.方法 实验 1:将培养的腹腔巨噬细胞株RAW264.7分为Gln 0、0.5和8 mmol/L 3组,分别于内毒素脂多糖(LPS)刺激后0、1、4、12和24 h收集细胞及上清液.实验2:45只昆明小鼠被随机均分为假手术(Sham)组、模型组、Gin组;采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备小鼠脓毒症模型,术后即刻从尾静脉注射Gin 0.75 g/kg(Gln组)或等量生理盐水(Sham组和模型组).6 h后采血,腹腔灌洗分离巨噬细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液、血清、巨噬细胞裂解液中肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10浓度;用蛋白质免疫印迹法检测巨噬细胞HSP72蛋白表达.结果 体外条件下Gin可显著促进RAW264.7细胞释放TNF-a,IL-6和IL-10,呈剂量和时间依赖性(P＜0.05或P＜0.01),LPS刺激4 h后,Gln 8 mmol/L组RAW264.7细胞HSP72表达显著增加(P均＜0.01).体内条件下,Gin组腹腔巨噬细胞TNF-a、IL-6含量均明显低于模型组(P＜0.01和P＜0.05),3组间IL-10含量比较差异无统计学意义;Gln组血清TNF-a浓度明显低于模型组(P＜0.05),两组血清IL-6、IL-10浓度差异无统计学意义;Gin组巨噬细胞HSP72表达较模型组和Sham组均显著升高(P均＜0.01).结论 Gin体外作用时可显著促进巨噬细胞释放TNF-a和IL-6,且该作用不能被HSP72表达所抑制.体内作用条件下Gln抑制腹腔巨噬细胞合成TNF-a和IL-6.体外和体内条件下Gln都可诱导巨噬细胞表达HSP72,提示HSP72表达可能不是Gln在脓毒症时抑制机体炎症反应的主要机制.     

谷氨酰胺对白细胞介素-1β刺激下大鼠肝细胞一氧化氮的产生及线粒体膜电位的影响

目的 利用原代培养的大鼠肝细胞,观察不同浓度的谷氨酰胺(Glutamine,Gin)在体外对白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)刺激下肝细胞一氧化氮(Nitric oxide,NO)过度产生和线粒体膜电位降低的影响.方法 选用6周龄SD大鼠,采用原位胶原酶循环灌注消化法获取高纯度原代大鼠肝细胞,培养48 h后分别用生理盐水、IL-1β(1 nmol/L)以及IL-1β(1 nmol/L)联合不同浓度的Gln(2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L)刺激肝细胞24 h,留取细胞和上清液,采用生化法测定上清液丙氨酸转移酶(lanine aminotransfemse ALT)和NO的水平,采用荧光探针Jc-1结合流式细胞仪检测肝细胞线粒体膜电位的变化.对各组数据之间进行方差分析,明确是否具有统计学意义.结果 IL-1β刺激后肝细胞培养液ALT平均浓度为38.2 U/L、N0的平均浓度为72.7 umol/L,均显著高于生理盐水组(分别为7.4U/L和41.7 mnol/L,P<0.01),而肝细胞线粒体膜电位水平却明显低于生理盐水组(强红色荧光细胞比例分别为30.0%和62.8%,P<0.01);同时给与Gln能够抑制IL-1β刺激下肝细胞N0的产生,减轻ALT的升高以及线粒体膜电位的降低,并且这些作用随着Gln浓度的增加而增强.结论 谷氨酰胺对炎症应激导致的肝细胞损伤具有保护作用,这种保护作用可能与抑制肝细胞NO的过度产生改善线粒体呼吸功能有关.     

老年患者开胸术后肠黏膜屏障损害及丙胺酰-谷氨酰胺的保护作用研究

目的 观察老年患者开胸术后早期肠黏膜屏障功能变化,并探讨丙胺酰-谷氨酰胺(Aln-Gln)对肠屏障功能的保护作用.方法 采取前瞻性随机对照研究,选取20例开胸非消化道手术老年患者,分为研究组和对照组,每组10例,从术后第1天起,研究组静脉应用Aln-Gln双肽0.5 g/kg,连续4d;对照组用同等量的生理盐水替代.收集分析临床指标(体温、心率、呼吸和白细胞计数等),并分别检测手术前、后血浆Gln浓度、血浆中D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度.结果 两组患者一般病例资料,如年龄、性别比例及体质量等方面差异均无统计学意义.研究组术后第5天Gln水平明显高于手术前[(478.32 ±47.42) μmol/L与(372.67 ±29.14) μmol/L,P=0.021].对照组术后第5天Gln浓度明显低于手术前[(386.29±19.73) μmol/L与(431.12 ±42.27) μmol/L,P=0.017].研究组术后Gln浓度显著高于对照组术后Gln浓度[(478.32±47.42) μmol/L与(386.29±19.73)μmol/L,P=0.012].两组患者术前血浆D-乳酸和DAO浓度比较差异均无统计学意义(P均＞0.05).术后第5天对照组显著高于术前[DAO:(2.53±0.47) U/ml与(1.66±0.32) U/ml,P=0.003; D-乳酸:(6.82±1.91) mg/L与(4.92±1.57) mg/L,P=0.024],研究组术后显著低于对照组术后[DAO:(1.10±0.23) U/ml与(2.53±0.47) U/ml,P=0.013; D-乳酸:(4.87±1.33) mg/L与(6.82±1.91)mg/L,P=0.019].两组患者术后第1天TNF-α均显著升高,术后第3天开始下降,研究组TNF-α术后第5天显著低于对照组[(6.89±5.21) pg/L与(13.04±4.46) pg/L,P=0.003].研究组患者术后全身炎症反应综合征评分显著低于对照组(P＜0.01).结论 老年患者开胸术后肠黏膜屏障功能受损,术后静脉给予Aln-Gln双肽能有效保护肠黏膜屏障功能,减轻全身炎症反应,有利于术后恢复.     

脂多糖对间充质干细胞Toll样受体4基因的表达水平及活性的影响

目的 探讨脂多糖(LPS)对骨髓间充质干细胞(MSC)Toll样受体4(TLR-4)基因的表达及其功能的影响.方法 采用贴壁培养和密度梯度离心法从大鼠骨髓分离MSC,通过细胞形态、成骨分化潜能及流式细胞术检测表型以鉴定其纯度;半定量RT-PCR和流式细胞术分别检测MSC在不同浓度(1、10、100 μg/ml)LPS存在条件下培养24 h的TLR-4 mRNA相对表达量和共刺激分子(CD80、CD86、MHC-Ⅱ)的表达水平;ELISA法定量检测TNF-α的分泌水平.结果 骨髓MSC低表达TLR-4mRNA(相对表达量0.61±0.10),同时表达CD80[(9.56±0.69)%]、CD86[(22.03±2.03)%]、MHC-Ⅱ[(2.51±0.97)%],少量分泌TNF-α[(4.97±2.98)pg/ml].MSC经LPS处理后,其TLR-4mRNA、共刺激分子表达和TNF-oα分泌水平均升高,其中10 μg/ml LPS培养组升高显著,TLR-4 mRNA相对表达水平为1.55±0.02;CD80、CD86、MHC-Ⅱ阳性细胞率分别为(41.70±2.92)%、(59.72±2.00)%、(24.56±2.19)%;TNF-α分泌水平为(213.12±69.08)pg/ml,与对照组比较,P值均＜0.01.100μg/ml LPS处理组与10 μg/mlLPS处理组相比,各项检测指标均降低,但MHC-Ⅱ和TNF-α的降低水平无统计学意义(P＞0.05).结论 骨髓MSC低表达TLR-4,体外LPS可促进骨髓MSCTLR-4的表达,且与浓度相关.伴随TLR-4表达水平的升高,CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达水平及TNF-α水平同时升高.     

谷氨酰胺对脓毒症大鼠血清免疫刺激性的影响

目的 观察脓毒症大鼠血清对RAW264.7细胞的免疫刺激作用及谷氨酰胺(Gln)的影响,并探讨其保护作用的机制.方法 SD大鼠18只,随机分为假手术组(sham组)、脓毒症组、Gln处理组(GLN组).采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备大鼠脓毒症模型,术后即刻从尾静脉注射Gln 0.75 g/kg(GLN组)或等量生理盐水(sham和脓毒症组).3组均于术后6 h采血并取肺组织,并将血清与RAW264.7细胞孵育4 h后收集上清液.鲎试剂法定量测定血浆内毒素浓度;比色法检测血浆D-乳酸和血清Gln水平;酶联免疫吸附法(ELISA)测定肺组织及血清作用于RAW264.7细胞后上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平.结果 3组血清Gln浓度无明显差异.GLN组血浆D-乳酸和内毒素水平明显低于脓毒症组(D-乳酸:(2.04±0.13)mg/L比(5.08±0.47)mg/L;内毒素:(0.011±0.003)mg/L比(5.085±1.647)mg/L,P均<0.01].脓毒症组血清刺激内毒素激活的RAW264.7细胞释放炎症因子明显高于sham组,GLN组明显低于脓毒症组(P<0.05或P<0.01),而GLN组与sham组比较差异无统计学意义.GLN组肺组织匀浆中TNF-α浓度明显低于脓毒症组((31.01±14.23)μg/L比(80.18±26.27)μg/L,P<0.01].结论 脓毒症大鼠血清对巨噬细胞释放炎症因子有明显的促进作用,而Gln可抑制脓毒症血清的该作用,这可能与Gln改变肠道通透性有关.     

高原缺氧腹泻大鼠血清内毒素、肿瘤坏死因子α变化与肝功能改变的相关性研究及谷氨酰胺的治疗观察

目的 探讨急进高原缺氧环境中腹泻大鼠血清内毒素(LPS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平的变化及与肝功能损害的相关性,观察谷氨酰胺对肠黏膜屏障的保护作用.方法 将45只雄性Wistar大鼠分为高原缺氧组、高原腹泻组及谷氨酰胺(glutamine,GLN)治疗组,每组15只.大鼠在平原饲养1个月后于24小时内急运至海拔4 767 m高原,建立高原缺氧模型,分别于到达高原后7天取门静脉血,比较各组间脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肝功能丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)的变化.结果 与高原缺氧组比较,高原腹泻组LPS(0.224±0.035)μg/L和TNF-α(128.6±20.1) ng/L水平明显升高(P均＜0.01);与高原腹泻组比较,GLN治疗组血浆LPS(0.185±0.035)μg/L和TNF-α(108.8±16.9)ng/L水平明显降低(P均＜0.05);与高原缺氧组比较,高原腹泻组血血浆中ALT(68.4±20.4)U/L vs (49.5±18.9) U/L、AST (59.6±22.9) U/L vs(42.9±20.2)U/L、TBil(37.4±18.0) μmol/L vs (24.3±13.1) μmol/L均有明显升高(均P＜0.01);高原腹泻组LPS升高与ALT、AST、TBil水平呈显著正相关(均P＜0.05).结论 高原缺氧环境中,腹泻可加重肠黏膜屏障破坏,可导致肠源性内毒素血症,吸收入血的内毒素可能参与高原缺氧环境肝功能损害过程,GLN治疗能够减轻小肠黏膜屏障损害,维持肠道正常功能.     

抑制胞浆型磷脂酶A2活性对内毒素诱导人脐静脉内皮细胞分泌瘦素的影响

目的 通过改变胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)的活性,检测细菌脂多糖(LPS)及Ca2+载体A23187诱导的人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)上清液中瘦素(Leptin)水平的变化,探讨在体外炎症状态下cPLA2活性与细胞分泌Leptin的关系.方法 体外培养ECV-304细胞.实验1:将细胞分为空白对照组,LPS 3个浓度5、10、20 μg/ml刺激组,Ca2+载体A23187 3个浓度0.1、 1.0、10.0 μmol/L刺激组共7个组,分别作用6、12、24 h后收集上清液.实验2:根据实验1结果将细胞分为空白对照组,LPS 20 μg/ml刺激组,cPLA2特异性抑制剂AACOCF3 3个浓度0.1、1.0、10.0 μmol/L与LPS合用刺激组,丝裂素活化蛋白激酶上游激酶1/2(MEK1/2)抑制剂 U0126 3个浓度0.1、1.0、5.0 μmol/L与LPS合用刺激组共8个组,在LPS刺激前1 h加入AACOCF3或U0126,LPS刺激24 h后收集上清液.采用放射免疫分析法检测Leptin水平.结果 实验1:随LPS刺激浓度增加和时间延长,细胞释放Leptin浓度逐渐减少,LPS 20 μg/ml组作用24 h后Leptin浓度(ng/ml)较空白对照组显著下降(0.540±0.109比0.823±0.048,P<0.05).但A23187对细胞分泌Leptin并无显著影响.实验2:LPS刺激能使细胞分泌Leptin浓度(ng/ml)明显下降(0.558±0.069比0.825±0.067,P<0.05);而用不同浓度AACOCF3或U0126干预后,细胞分泌Leptin的浓度(ng/ml)有所回升,且呈浓度依赖性(AACOCF3 0.1、1.0、10.0 μmol/L组分别为0.673±0.135、 0.723±0.055、 0.797±0.062;U0126 0.1、 1.0、5.0 μmol/L组分别为0.698±0.112、 0.862±0.184、0.935±0.145),AACOCF3 1.0 μmol/L、10.0 μmol/L组和U0126 1.0 μmol/L、5.0 μmol/L组Leptin浓度均显著高于LPS 20 μg/ml刺激组(均P<0.05).结论 在由LPS诱导的体外炎症状态下,Leptin的分泌与cPLA2的活性具有一定的关系.

Abstract：

Objective To determine Leptin levels in supernatant fluid of culture of human umbilical vein endothelial cells (ECV-304) after being challenged by lipopolysaccharide (LPS) and calcium ion vector A23187, and to explore the possible relation between Leptin release and cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) activity in an inflammatory cell model. Methods ECV-304 cells were cultured in vitro. Experiment 1: the cells were divided into seven groups: blank control group, LPS 5, 10, 20 μg/ml stimulation groups, A23187 0.1, 1.0, 10.0 μmol/L stimulation groups. The supernatants were collected at 6, 12 and 24 hours. Experiment 2: according to the results of experiment 1, the cells were divided into eight groups: blank control group, LPS 20 μg/ml stimulation group, the inhibitor of cPLA2 AACOCF3 0.1, 1.0, 10.0 μmol/L plus LPS stimulation groups, the inhibitor of mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) U0126 0.1, 1.0, 5.0 μmol/L plus LPS stimulation groups, with AACOCF3 or U0126 added 1 hour before the addition of LPS, and the supernatants were collected 24 hours after the addition of LPS. Leptin level was determined by radioimmunoassay. Results Experiment 1: with increase in LPS concentration and prolongation of time, Leptin release was decreased gradually. After 24 hours of interaction the concentration of Leptin (ng/ml) in LPS 20 μg/ml group was decreased significantly compared with the blank control group (0.540±0.109 vs. 0.823±0.048, P<0.05). However, A23187 had no significant effect on Leptin release. Experiment 2: LPS rendered cells to release less Leptin (ng/ml: 0.558±0.069 vs. 0.825±0.067, P<0.05); by adding AACOCF3 or U0126 in different concentration before adding LPS rendered the cells to release more Leptin (ng/ml), and it showed concentration-dependent (the AACOCF3 0.1, 1.0, 10.0 μmol/L groups were 0.673±0.135, 0.723±0.055, 0.797±0.062, respectively; the U0126 0.1, 1.0, 5.0 μmol/L groups were 0.698±0.112, 0.862±0.184, 0.935±0.145, respectively). The release of Leptin in AACOCF3 1.0 μmol/L, 10.0 μmol/L and U0126 1.0 μmol/L, 5.0 μmol/L groups was significantly higher than LPS 20 μg/ml stimulation group (all P<0.05). Conclusion There is a possible relation between Leptin release and cPLA2 activity in inflammatory cells induced by LPS.     

脓毒症大鼠心肌细胞Toll样受体4和炎症因子基因表达的变化及作用机制

目的 观察脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的变化及与Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)基因表达的关系;同时探讨谷氨酰胺(Gln)在脓毒症心肌损伤治疗中的保护作用.方法 采用内毒素脂多糖(LPS)腹腔注射法制备脓毒症大鼠模型.将大鼠随机分为对照组、LPS组及Gln组,再分为术后0、6、12、24 h亚组,每组6只.于相应时间点取心肌组织,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR4、TNF-α及IL-6的mRNA表达,并观察心肌组织病理学改变.结果 LPS组大鼠心肌细胞凋亡程度增高.LPS组、Gln组各时间点心肌细胞TLR4、TNF-α及IL-6的mRNA表达均较对照组明显增加(P均<0.05).而Gln组心肌细胞凋亡程度较LPS组轻,各时间点TLR4 mRNA表达均较LPS组升高幅度明显降低,且于12 h、24 h差异有统计学意义;TNF-α mRNA表达亦降低,于6 h、24 h差异有统计学意义;IL-6 mRNA表达较LPS组升高幅度降低,且于12 h差异有统计学意义(P均<0.05).结论 TLR4信号转导基因及其调控细胞因子TNF-α、IL-6基因表达在脓毒症心肌细胞损伤的发生发展中起重要作用.Gln通过影响相关基因表达干预脓毒症心肌细胞的凋亡.     

丙氨酰谷氨酰胺对急性肺损伤患者的保护作用及其机制初探

目的 观察丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)对急性肺损伤(ALI)患者的保护作用及其机制.方法 110例ALI患者随机分为对照组(50例)和Ala-Gln组(60例).对照组给予常规治疗,Ala-Gln组在常规治疗的基础上,加用Ala-Gln,疗程7天,分别观察两组间治疗前后血清谷氨酰胺(Gln)、热休克蛋白70(HSP70)水平、急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)及机械通气时间的差异.结果 Ala-Gln组治疗后血清HSP70、Gln水平明显增高,与治疗前比较差异有统计学意义,HSP70 (1.99±0.66) μg/L vs (1.34±0.68) μg/L( P＜0.01);Gln (386.15±68.60)μg/L vs (304.72±73.70) μg/L(P＜0.01).与对照组治疗后比较差异亦有统计学意义,Gln (386.15±68.60) μg/L vs (303.74±78.08) μg/L( P＜0.01);HSP70 (1.99±0.66) μg/L vs(1.35±0.48)μg/L(P＜0.01).Ala-Gln组治疗前后Gln浓度比与HSP70浓度比呈明显正相关(r=0.809,P＜0.01),对照组治疗前后血清Gln、HSP70水平差异无统计学意义,对照组治疗前后Gln浓度比与HSP70浓度比无明显相关性(r=0.147,P＞0.05).Ala-Gln组机械通气时间明显低于对照组,(162.20±96.33)小时vs (235.00±107.90)小时(P＜0.05).治疗后APACHEⅡ评分的改善明显优于对照组,(8.40±2.17)分vs (11.10±2.42)分(P＜0.05).结论 Ala-Gln治疗可显著提高ALI患者血清Gln、HSP70水平、缩短机械通气时间,改善APACHEⅡ评分,提示Ala-Gln对ALI患者具有保护作用,其机制可能与提高患者体内Gln、HSP70水平有关.     

辛伐他汀对脂多糖诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞钠通道α亚基的影响

目的 通过体外给药的方式观察辛伐他汀对脂多糖(LPS)诱导的原代培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)钠通道α亚基(α-ENaC)mRNA表达的影响.方法 ATⅡ细胞原代培养,分为空白对照组、LPS损伤组(终浓度1 mg/L)、辛伐他汀低和高剂量组(20μmol/L、30μmol/L)、溶剂对照组.分别于培养1、12、24 h用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-1 β(IL-1β)的浓度,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中α-ENaC mRNA表达.结果 LPS损伤后1、12、24 h时TNF-α、IL-1β浓度均较空白对照组显著升高.辛伐他汀低剂量组1、12、24h TNF-α(ng/L)和IL-1β(ng/L)均较LPS损伤组明显下降(TNF-α 1h:1178.80±127.43比2336.00±170.04,12 h:1003.60±59.61比2479.80±210.41,24 h:695.80±25.24比1167.60±132.72;IL-1β 1 h:285.00±42.60比429.60±27.39,12 h:238.60±24.12比822.20±12.74,24 h:213.40±17.87比637.60±22.96,均P＜0.05),高剂量组较低剂量组下降更明显(TNF-α1h:965.60±24.45比1178.80±127.43,12 h:522.80±16.89比1003.60±59.61,24 h:252.40±17.64比695.80 ±25.24;IL-1β 1 h:225.60±34.44比285.00 ±42.60,12 h:190.60 ±17.64比238.60±24.12,24 h:152.80±14.70比213.40±17.87,均P＜0.05),但仍较空白对照组明显上升.在培养1h时各组α-ENaC mRNA表达差异均无统计学意义.培养12h、24 h时,LPS损伤组α-ENaC mRNA表达(A值)明显低于空白对照组(12 h:0.211±0.021比0.496±0.027,24 h:0.253±0.030比0.482±0.030,均P＜0.05);辛伐他汀低剂量组α-ENaC mRNA表达均较LPS损伤组明显上升(12 h:0.363 ±0.030比0.211±0.021,24 h:0.309±0.024比0.253±0.030,均P＜0.05),高剂量组较低剂量组升高更明显(12h:0.413±0.034比0.363±0.030,24h:0.346±0.024比0.309±0.024,均P＜0.05),但仍较空白对照组明显下降.空白对照组与溶剂对照组各指标差异无统计学意义.结论 大剂量辛伐他汀可上调LPS诱导的大鼠ATⅡ细胞α-ENaC mRNA表达,其机制可能与调节TNF-α、IL-β的分泌有关.     

血清炎症因子在急性坏死性胰腺炎大鼠早期肠黏膜屏障损伤中的作用

目的:探讨急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠血清炎症因子水平与肠黏膜屏障损伤的相关性.方法:制备ANP大鼠模型,检测假手术组和造模后6、12、24 h大鼠血清TNF-α、IL-6,血清D-乳酸、小肠组织病理学、肠黏膜含水量.组间数据比较采用单因素方差分析,TNF-α、IL-6与血清D-乳酸、小肠组织学评分之间的相关性采用线性相关分析.结果;模型组造模后,随造模时间的延长,血清TNF-α[6 h:(155.56±12.83)ng/L、12 h:(311.81±14.12) ng/L、24 h:(276.79±11.72) ng/L],血清IL-6[6 h:(183.03-8.56)ng/L、12h:(358.64±11.43) ng/L、24 h:(383.42±20.32)ng/L],血清D-乳酸[6h:(3.30±0.12) μg/mL、12 h:(9.19±0.54) μg/mL、24 h:(16.02±0.82)μg/mL],小肠组织学评分[6h:(1.17±0.23)分、12h:(3.33-0.19)分、24h:(6.61±0.24)分]均升高,各时点与同时点假手术组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05),血清TNF-α、IL-6与血清D-乳酸、小肠组织学评分之间呈明显的正相关(P＜ 0.01).结论:ANP大鼠早期存在肠黏膜屏障损伤,并且与血清TNF-α、IL-6水平升高有关.     

咯利普兰对佐剂关节炎大鼠腹腔巨噬细胞体外释放炎性细胞因子的影响

目的探讨选择性磷酸二酯酶(PDE)4抑制剂咯利普兰对脂多糖(LPS)诱导的佐剂关节炎(AA)大鼠腹腔巨噬细胞(PM)体外释放促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的影响,为选择性PDE4抑制剂治疗类风湿关节炎(RA)提供理论依据。方法制备AA大鼠模型,收集PM,体外给予LPS及不同浓度咯利普兰共同孵育,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1β水平,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定细胞内TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达,并与正常对照相比较。结果 AA大鼠PM培养上清中TNF-α、IL-1β、细胞内TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达均高于对照组大鼠,分别为(386.80±63.24)ng/L vs(48.53±6.47)ng/L(P<0.01)、(317.77±29.33)ng/L vs(77.75±11.60)ng/L(P<0.01)、77.92±12.55vs 15.97±4.37(P<0.01)、49.30±10.06vs 10.15±1.34(P<0.01)。咯利普兰能够剂量依赖性地抑制LPS刺激的AA大鼠PM体外表达TNF-αmRNA、IL-1βmRNA,并抑制TNF-α、IL-1β产生。结论咯利普兰能抑制LPS诱导的AA大鼠PM体外释放促炎性细胞因子,提示其可能通过抑制炎症反应用于RA的治疗。     

血管紧张素Ⅱ对急性肺损伤大鼠肺水通道蛋白1表达的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对急性肺损伤(ALI)大鼠肺水通道蛋白1(AQP1)表达的影响及在肺水肿形成中的作用.方法 按随机数字表法将40只SD大鼠分为假手术组、模型组、AngⅡ受体阻滞剂预处理组及治疗组,每组10只.采用失血性休克-内毒素二次打击建立大鼠ALI模型.预处理组静脉注射脂多糖(LPS)前30 min注射AngⅡ受体阻滞剂30 μg/kg,注射LPS后30 min注射30 μg/kg生理盐水;治疗组注射LPS前30 min注射30 μg/kg生理盐水,注射LPS后30 min再注射AngⅡ受体阻滞剂30 μg/kg;模型组注射LPS前、后均给予30 μg/kg生理盐水.制模后6 h处死大鼠,取下腔静脉血,用放射免疫法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;取肺组织,计算湿/干重(W/D)比值,用放射免疫法测定肺组织AngⅡ表达,用逆转录-聚合酶链反应测定AQP1 mRNA表达.结果 与假手术组相比,ALI大鼠血清TNF-α水平及肺组织W/D比值、AngⅡ表达明显增加,AQP1 mRNA表达明显减少.预处理组及治疗组血清TNF-α水平(μg/L)较模型组明显减少(4.79±0.24、5.55±0.36比6.34±0.31,均P<0.05),肺组织W/D比值减小(4.34±0.23、4.85±0.20比5.41±0.26,均P<0.05),AQP1 mRNA表达明显增加(0.854±0.067、0.727±0.081比0.358±0.071,均P<0.05);而AngⅡ表达(ng/g)有所降低(172.19±15.82、202.82±20.47比245.88±26.31),但差异无统计学意义(均P>0.05).AQP1 mRNA表达与AngⅡ表达和肺组织W/D比值均呈负相关(r1=-0.782,r2=-0.726,均P<0.05).结论 ALI时AngⅡ可能直接或通过炎症介质下调肺脏AQP1 mRNA表达,为肺水肿形成的机制之一.     

硫辛酸对大鼠急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征模型的保护机制

目的:探讨代谢性抗氧化剂硫辛酸(LA)对内毒素(LPS)诱发大鼠急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)模型的保护机制,为ALI/ARDS药物治疗提供新的途径.方法:选择Wister雄性大鼠40只,随机分为正常对照组(NS组)、ALI/ARDS模型组(LPS组)、LA干预组(LA组)和谷胱甘肽(GSH)干预组(GSH组),每组各10只.除NS组外,余3组均给予LPS 6 mg/kg尾静脉注射诱发大鼠造成ALI/ABDS模型,LA组和GSH组分别于注射LPS后0.5 h注射LA和GSH各100 mg/kg.注射后1、2、4和6 h观察血清肿瘤坏死因子(TNF-α)水平,6 h后处死大鼠,测定动脉血氧分压(PaO2)、血清脂过氧化物水平(LPO)、肺湿干比(wet/dry weight ratio,W/D)、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白浓度和TNF-α水平.结果:LA组和GSH组PaO2水平较LPS组明显增高(P<0.01);血清LPO水平、W/D、BALF中蛋白浓度明显下降(P<0.01);LA组TNF-α水平呈进行性下降.在注射后各时点与LPS组比较均明显降低(P<0.01).结论:LA对LPS诱发的大鼠ALI/ARDS模型的损伤有一定保护作用.     

还原型谷胱甘肽对脓毒症大鼠肺部超微结构及血中细胞因子水平的影响

目的 探讨还原型谷胱甘肽(GSH)对脓毒症大鼠急性肺损伤保护作用的机制.方法 采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制SD大鼠脓毒症模型.按随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、GSH组、左氧氟沙星(LEV)组;分别于术后3、6、12、24 h各取7只大鼠心脏血检测血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平,电镜下观察术后24 h大鼠肺组织超微结构的改变.结果 与假手术组C(132±9)μg/L]比较,模型组术后6 h血浆TNF-α水平((227±28)μg/L]显著升高(zp<0.01);GSH治疗组((144±28)μg/L]较模型组显著降低,且明显低于LEV组((214±48)μg/L,均P<0.01];各组间术后3、12、24 h TNF-α水平比较均无明显差异.与假手术组((135.43±40.08)μg/L]比较,模型组术后3 h血浆IL-6水平((267.65±72.87)μg/L]显著升高(P<0.01);GSH治疗组[(191.97±62.98)μg/L]较模型组显著降低,且明显低于LEV组[(268.75±74.67)μg/L,均P<0.05];各组间术后6、12、24 h IL-6水平均无明显差异.模型组大鼠肺组织超微结构发生显著变化,尤其是细胞内线粒体出现水肿甚至空泡变性;GSH组大鼠肺组织超微结构的改变轻微.结论 TNF-α和IL-6在脓毒症大鼠肺损伤发生机制中起重要作用,GSH有明显的治疗效果.     

脂氧素A4对脂多糖攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白5的影响

目的 探讨脂氧素A4(LipoxinA4,LXA4)对脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ penumonoeyte,ATⅡ)水通道蛋白(aquaporin,AQP)5的影响.方法 对大鼠ATⅡ细胞进行分离、纯化,以1 μg/mL的LPS刺激ATⅡ 4 h建立LPS攻击ATⅡ细胞模型.将ATⅡ随机分为:空白对照(无血清的培养基不含任何药物)组;溶剂对照(乙醇,0.7μL/mL)组;LPS(1μg/mL)组;LXA4(1×107mol/mL)组;LPS+LXA4组.用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测大鼠ATⅡ中AQP5的信使核糖核酸(mRNA)的变化,免疫组织化学方法(IHC)检测ATⅡ中AQP5蛋白表达.结果 1μg/mL的LPs刺激ATⅡ4 h后,ATⅡ中AQP5的mRNA和蛋白表达较空白组明显减低(P<0.01),而LPS+LXA4组ATⅡ中AQP5的mRNA和蛋白表达较LPS组明显增高(P<0.01),且LXA4组ATⅡ中AQP5的mRNA和蛋白表达较空白组也明显增高(P<0.01).结论 大鼠ATⅡ上表达有AQP5,LXA4能促进AQP5 mRNA和蛋白表达上调,提示LXA4可能通过上调AQP5的表达起到促进肺泡水肿液清除作用.     

乌司他丁通过p38丝裂原活化蛋白激酶通路治疗大鼠脓毒症急性肝损伤的相关性研究

目的探讨乌司他丁对脂多糖(LPS)诱导的大鼠脓毒症急性肝损伤的治疗作用及相关机制,并与p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路特异性阻断剂SB203580的疗效进行比较。方法通过尾静脉注射5 mg/kg的LPS制造LPS诱导的大鼠脓毒症急性肝损伤模型。将清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠32只分为4组:空白组(尾静脉注射1 m L等渗Na Cl溶液),LPS组(尾静脉注射1 m L的LPS),LPS+乌司他丁(UTI)组(建模后立即腹腔注射1 m L乌司他丁),LPS+p38MAPK通道阻断剂(SB)组(建模后立即腹腔注射1 m L SB203580),每组8只。建模后24 h处死大鼠,取下腔静脉血测定大鼠血清中谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)、胆红素(BIL)和碱性磷酸酶(AKP)的浓度,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,Western-blotting法测定大鼠肝组织磷酸化p38蛋白水平表达,以及通过肝组织病理切片和电镜下观察肝细胞微结构的变化。结果建模后24 h,LPS组有2只大鼠死亡。四组大鼠血清AKP水平无显著性差异(F=1.153,P=0.351);与空白组比较,LPS组大鼠血清ALT[(10.7±1.8)U/L vs.(46.3±5.0)U/L]、BIL[(0.63±0.12)μmol/L vs.(1.55±0.16)μmol/L]、肝组织TNF-α[(4 621±793)ng/L vs.(7 222±773)ng/L]、磷酸化p38蛋白水平[(12 073±172)ng/L vs.(15 515±630)ng/L]均显著升高(P均0.05);病理切片提示LPS组肝细胞水样变性、炎症细胞浸润、肝细胞再生;电镜结果也提示肝细胞核固缩,线粒体嵴肿胀、断裂或者消失,内质网结构不清。而LPS+UTI组和LPS+SB组肝组织TNF-α、磷酸化p38蛋白表达均与空白组无显著差异(P均0.05);病理切片提示两组肝细胞水样变性、炎症细胞浸润、肝细胞再生较LPS组轻,但较空白组仍严重;电镜结果显示肝细胞核、线粒体及内质网结构变化较LPS组减轻。与空白组相比,LPS+SB组血清ALT无显著差异(P0.05),而LPS+UTI组血清ALT明显升高[(10.7±1.8)U/L vs.(29.5±2.5)U/L,P0.05],提示SB203580对血清ALT作用更明显;而与空白组比较,LPS+UTI组血清BIL水平无显著差异(P0.05),而LPS+SB组血清BIL明显升高[(0.63±0.12)μmol/L vs.(1.52±0.20)μmol/L,P0.05],提示乌司他丁对血清BIL作用更明显。结论乌司他丁可减轻LPS引起的大鼠脓毒症急性肝损伤,是通过p38MAPK通路来发挥炎症抑制作用的。与p38MAPK通路特异性阻断剂比较,两者在减轻TNF-α、磷酸化p38蛋白等作用上相似,但是对血清学指标的影响有一定差别。     

异丙酚对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用及机制

目的探讨不同剂量异丙酚对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用和机制。方法 100只出生1~3 d的Wistar大鼠进行心肌成纤维细胞的分离与培养后,将细胞分为对照组(细胞培养基中加入1 mL含体积分数1%小牛血清的DMEM培养基)、AngⅡ组(细胞培养基中加入1 mL 1.0×10-7 mol/L AngⅡ),AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组(细胞培养基中加入1 mL 1.0×10-7 mol/L AngⅡ+0.5 mmol/L异丙酚)、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组(细胞培养基中加入1 mL 1.0×10-7 mol/L AngⅡ+1.0 mmol/L异丙酚)、AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组(细胞培养基中加入1 mL 1.0×10-7 mol/L AngⅡ+1.5 mmol/L异丙酚)。采用MTT法检测各组细胞生长抑制率,采用PCR法检测各组细胞α-SMA mRNA相对表达量,采用Western blot法检测各组细胞总蛋白含量。结果培养48 h,AngⅡ组细胞生长抑制率[(14.23±1.17)%]低于对照组[(23.32±2.15)%]、AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组[(24.19±1.36)%]、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组[(29.25±2.30)%]及AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组[(31.37±2.19)%](P<0.05),AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组、AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组细胞生长抑制率依次降低(P<0.05);AngⅡ组心肌成纤维细胞α-SMA mRNA相对表达量(2.05±0.23)、总蛋白含量(225.06±18.66)均高于对照组(0.98±0.12、150.65±11.23)、AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组(1.78±0.25、197.54±11.56)、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组(1.50±0.11、182.51±10.14)和AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组(1.12±0.05、168.26±11.05)(P<0.05),AngⅡ+异丙酚0.5 mmol/L组、AngⅡ+异丙酚1.0 mmol/L组、AngⅡ+异丙酚1.5 mmol/L组及对照组心肌成纤维细胞α-SMA mRNA相对表达量及总蛋白含量依次降低(P<0.05)。结论异丙酚具有抑制AngⅡ诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖的作用,且随剂量增加,抗心肌成纤维的作用逐渐增强。