ATRA诱导神经母细胞瘤细胞分化的实验研究

目的 观察不同浓度全反式维甲酸(ATRA)体外对自建神经母细胞瘤(NB)细胞系细胞增殖抑制和形态分化的影响。方法 取住院手术的NB患儿的新鲜标本，进行原代细胞培养，并对培养的细胞进行分离与纯化，建立细胞系，作为细胞模型。通过台盼蓝拒染计数活细胞，用倒置相差显微镜观察加药处理前后细胞形态学变化。结果 5μm／L、20／μm／L，ATRA作用NB细胞后，细胞形态发生显著变化，并对体外增殖有抑制作用。结论 所建立的NB细胞系为可诱导分化型(即N型)，ATRA能抑制细胞增殖并诱导其分化，而且有剂量依赖关系；5μm／L，ATRA对NB细胞体外增殖有抑制作用并诱导其分化。     

神经母细胞瘤细胞生物学检测和荷瘤鼠模型的建立

目的用新鲜肿瘤组织,建立原发瘤的神经母细胞瘤体外细胞系和不同浓度的细胞悬液,制作荷瘤鼠模型,并建立起鼠神经母细胞瘤体外细胞系。方法取新鲜肿瘤标本,用酶消化法,建立体外细胞系和细胞悬液,进行生物学检测,接种于裸鼠(n=14)和SCID小鼠(n=3)后肢前下方的皮下及腹膜后。结果人神经母细胞瘤原发瘤体外细胞系建立成功。裸鼠(5／11)和SCID小鼠(n=2／3)荷瘤成功。结论建立神经母细胞瘤细胞系和动物模型对于研究其转基因诱导分化、神经母细胞瘤的分子生物学特征及其肿瘤自消机制打下了良好的基础。     

三种原代小胶质细胞纯化培养方法的对比及分析

目的寻找简捷、高效的原代小胶质细胞纯化培养方法。方法以小胶质细胞原代培养的经典培养方法为基础，通过提高初次接种密度、减少细胞离心过滤、进行营养丧失培养等改进，培养后期分别采用经典机械分离法、低浓度胰酶消化法和利多卡因分离纯化法行细胞分离与纯化，记录形态变化并采用同倍数视野动态计数，借助CD68及OX42抗体间接免疫荧光标记进行鉴定、计算纯度。结果三种分离方法均获得了较高纯度和产量的小胶质细胞，其中利多卡因分离纯化法获得细胞数及纯度明显高于其他分离方法，低浓度胰酶消化法次之。结论小胶质原代细胞培养过程中，利多卡因分离纯化法及低浓度胰酶消化法均可有效提高培养产量及纯度，以利多卡因分离纯化法最佳。     

类风湿性关节炎细胞水平建模四种方法比较

目的 比较四种方法 在培养类风湿性关节炎(RA)滑膜细胞(FLS)中的异同,为研究RA提供较好的体外实验模型建模方法 .方法 20例滑膜组织标本均用组织块法、单胶原酶消化法、单胰酶温消化法和双酶消化法四种方法 分离、培养RA FLS,均取培养第7日细胞计数,取第4代细胞鉴定,免疫组化鉴定细胞,测定分离细胞的数量和纯度.结果 四种培养方法 的培养时间比较,单胶原酶法>双酶消化法>组织块法>单胰酶法(P＜0.05).组织块法及双酶消化法所得细胞数较单胶原酶法及双酶消化法少(P＜0.05).第4代细胞均以FLS为主(>95%).结论 四种方法 体外培养可获得生物学特性稳定的RA FLS细胞系,其中组织块法是细胞水平建立RA体外实验模型成功率较高的方法 ,单纯胰酶法是较快速的方法 .     

低浓度混合酶改良消化法体外培养SD大鼠面颌肌细胞

目的观察低浓度混合酶改良消化法体外培养SD大鼠面颌肌细胞的结果。方法分离SD大鼠颌面部咬肌区肌肉组织,先用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化后再用0.1%的Ⅰ型胶原酶和0.125%的胰蛋白酶(1∶1)低浓度混合酶消化法分离细胞,差速贴壁法纯化,所得细胞进行结蛋白(Desmin)免疫组化染色。结果体外培养所得细胞Desmin胞质阳性率达95%。结论采用低浓度混合酶消化和差速贴壁法体外培养SD大鼠面颌肌细胞可获得纯度高、产量高、活性强、稳定性好的面颌肌细胞。     

应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞

目的探讨应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞的方法.方法应用结合组织块法和Ⅳ胶原酶消化法的改良的组织块酶消化法体外原代培养人大肠癌细胞,通过对培养条件、促进贴壁、控制污染、细胞纯化等方面的探索得到了大肠癌细胞,并最终用形态学方法(瑞姬氏染色)、和免疫学方法(免疫细胞化学)鉴定所得细胞.结果经改良的组织块酶消化法体外培养的人大肠癌原代细胞,瑞姬氏染色进行细胞形态学鉴定,结果显示胞核呈紫红色,核质比明显增大,符合肿瘤细胞特征;细胞胃肠癌相关糖链抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,C A19-9)进行细胞免疫学鉴定,结果显示胞浆呈棕色,细胞CA19-9阳性.结论改良的组织块酶消化法在培养方法改良、促进贴壁、控制污染和去除杂细胞四方面进行了改进,既可快速获得游离细胞,又充分利用了未彻底消化的组织块.采用该改良的组织块酶消化法原代培养细胞成功率高,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.     

猪RPE细胞原代培养及其透射电镜观察

目的建立视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium RPE）细胞体外培养及其超微结构研究方法，为在细胞和分子水平上对RPE细胞进行研究奠定基础。方法采用酶消化法对RPE细胞进行取材和培养，利用光镜和透射电镜观察及分析培养的RPE细胞。结果建立了可获得大量RPE细胞的培养方法，对培养的细胞进行了系统的观察和分析：培养的细胞贴壁生长，细胞内可见大景黑色素颗粒。结论成功的进行了RPE细胞培养，为各种损伤致RPE细胞形态学改变的研究奠定了基础。     

小鼠主动脉平滑肌细胞培养及钙化模型的优化

目的 通过改良后的酶消化法进行小鼠主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）原代培养，提高VSMCs原代培养效率及质量，进而建立更快速有效的体外钙化模型。方法 剥离小鼠主动脉中膜并将其剪碎，分别采用改良组织贴块法及改良酶消化法进行小鼠VSMCs原代培养，免疫荧光染色鉴定细胞纯度后，分组（经典钙化组、改良钙化组）进行体外钙化诱导，采用vonKossa染色法评估各组钙化差异。结果 与改良组织贴块法相比，改良后的酶消化法培养原代VSMCs可在短时间内获得大量细胞，鉴定VSMCs纯度>98%，且细胞不易老化，传代存活率高。与传统体外钙化方法比，改良组的钙化更容易且稳定。结论 本研究通过改良的酶消化法提高了原代平滑肌细胞的存活率及培养效率，同时通过改良体外钙化诱导液配方，建立了良好的体外钙化模型。     

lncRNA SNHG8负调控miR-411-5p影响神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的机制研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)、小核仁RNA宿主基因子8(SNHG8)对神经母细胞瘤(NB)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法:实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测31例NB病人NB组织和瘤旁组织中SNHG8和miR-411-5p表达水平。体外培养NB细胞系SK-N-SH,双荧光素酶报告基因实验验证SNHG8和miR-411-5p调控关系。将SK-N-SH细胞分为对照组、si-NC组、si-SNHG8组、si-SNHG8+anti-miR-NC组和si-SNHG8+anti-miR-411-5p组,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell检测细胞迁移和侵袭,蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测Ki67、活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-Caspases-3)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达水平。结果:与瘤旁组织比较,NB组织中SNHG8表达水平升高(P<0.05),miR-411-5p表达水平降低(P<0.05)。SNHG8在S...     

兔关节滑膜细胞的分离、培养和纯化

目的探讨兔关节滑膜细胞的体外分离、培养和纯化方法。方法无菌条件下,从6月龄新西兰白兔的膝关节囊内剪取滑膜组织,采用组织块培养法和酶消化法分离滑膜细胞。经台盼蓝拒染计数,将细胞按1×106接种于培养瓶,传代培养。结果经反复贴壁和多次消化达到形态学上的纯化要求,活性率为96%,纯度达95%以上,培养的细胞具有成纤维细胞形态和特征。结论本研究建立了简单易行的滑膜细胞分离、培养和纯化方法。     

三种培养原代支气管成纤维细胞方法的比较

目的 探讨建立适用于SD大鼠支气管成纤维细胞原代培养的方法.方法 取重量为150~180 g的SD雄性大鼠的支气管组织,采用Ⅰ型胶原酶、木瓜蛋白酶联合消化+组织块黏附法、胰酶+胶原酶联合消化(双酶消化法)+组织块黏附法、组织块黏附法进行原代支气管成纤维细胞的培养.利用镜下观察细胞的生长特点;免疫荧光染色法鉴定细胞的类型及纯度;细胞的增殖活性用CCK-8检测并绘制生长曲线.结果 酶消化+组织块黏附法培养使细胞游出速度更快、细胞数量产生更多.组织块黏附法培养的细胞爬出相对缓慢、培养周期更长、获得的细胞数量相对较少.CCK8增殖曲线呈S形.培养48 h,经酶消化法分离得到的成纤维细胞已经游出,约有60%以上细胞已经贴壁,培养6~7 d可传代.组织块贴壁法培养5 d时,细胞开始从组织块边缘缓慢爬出,随后从组织块周围延伸长,14 d左右可传代.使用酶消化法培养的支气管成纤维细胞中可混有杂细胞团,为提高成纤维细胞的纯度可通过差速贴壁法纯化.结论 双酶消化法+组织块黏附法可以更高效、快速的分离和获取支气管成纤维细胞,为研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重塑提供了充足的种子细胞.     

大鼠结肠上皮细胞分离及培养方法的建立

目的:建立大鼠结肠上皮细胞的原代培养方法,为结肠上皮形态及功能研究提供理想的细胞模型.方法:采用6-15日龄乳鼠,取结肠剪碎、反复清洗后,弃上清,加10 mL、0.1%Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶联合配制的消化液,37℃消化25 min,分离上皮细胞团;吹打消化液,取上清,加入培养基重悬反复离心3次后,细胞沉淀接种于含100 mL/L胎牛血清的完全培养基中,37℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养.采用差速贴壁法及相差消化法去除成纤维细胞,细胞贴壁长满瓶80%-90%后用2.5 g/L的胰酶消化液消化并传代.结果:成功分离结肠上皮细胞团且活力较高.24 h后可见部分细胞团贴壁,贴壁细胞为多角形,4-8 d逐渐融合成片,呈现明显的"铺路石"样.细胞经传代处理后成纤维细胞明显减少.免疫荧光染色及透射电镜观察鉴定为上皮细胞.冻存处理复苏后细胞状态较佳.结论:通过该法可建立较稳定的大鼠结肠上皮细胞原代培养体系,为结肠上皮生理、病理及药物作用机制提供了体外研究平台.     

丁型肝炎病毒体外短期细胞培养系统的建立

为建立ＨＤＶ的体外细胞培养系统，采用体外细胞转染技术，用含基因ＨＤＶｃＤＮＡ三聚体的重组质粒ｐＳＶＬＤ３转染ＨＢＶ的体外细胞培养株（２．２．１５细胞株）。结果在转染后３天的转染细胞内和培养上清中检出了１．７ＫｂＨＤＶＲＮＡ和２４０００、２７０００ＨＤＡｇ。初步结果提示，该转染细胞培养上清中有ＨＤＶ病毒的排泌，从而建立了ＨＤＶ的体外短期培养系统。     

Establishment and characterization of an opisthorchiasis-associated cholangiocarcinoma cell line （KKU-100）

AM: To establish and characterize a new cholangiocarcinoma cell line from a patient living in the Opisthorchis viverrini (O. viverrini) endemic area of Northeast Thailand. METHODS: Fresh liver biopsy and bile specimens were obtained from a 65-year-old Thai woman with cholangiocarcinoma of the ports hepatis. After digestion, the cells were cultured in Ham's F12 media. The established cell line was then characterized for growth kinetics, cell morphology, imm-unocytochemistry and cytogenetics. Tumorigenicity of the cell line was determined by heterotransplanting in nude mice. RESULTS: The primary tumor was a poorly differentiated tubular adenocarcinoma. Examination of the bile revealed malignant cells with O. viverrin eggs. The cholangiocarcinoma cell line KKU-100 was established 4 mo after the primary culture-population doubling time was 72 h. KKU-100 possesses compact and polygonal-shaped epithelial cells. Immunocytochemically, this cell line exhibited cytokeratin, EMA, CEA, and CA125, but not a-fetoprotein (AFP), CA19-9, desmin, c-met, or p53. Such protein expressions parallel those of the primary tumor. Cytogenetic analysis identified aneuploidy karyotypes with a modal chromosome number of 78 and marked chromosomal structural changes. Inoculation of KKU-100 cells into nude mice produced a transplantable, poorly differentiated aden-ocarcinoma, similar to the original tumor. CONCLUSION: KKU-100 is the first egg-proven, Opisthorchis- associated cholangiocarcinoma cell line, which should prove useful for further investigations of the tumor biology of this cancer.     

新型乙型肝炎病毒细胞感染模型的建立

目的:建立一新型细胞株,使该细胞株既能自然感染HBV又能传代培养,评价杂交细胞对HBV的自然感染能力.方法:分离培养未携带HBV的人原代肝细胞,与诱导突变的HepG2细胞进行融合得杂交细胞,经HAT培养基筛选,利用胰蛋白酶G显带技术鉴定所得细胞,用含HBV的慢性乙型肝炎患者血清感染杂交细胞(同时感染HepG2作为对照),巢式PCR检测感染后细胞内HBVDNA合成及分泌情况及有无HBV复制中间产物HBV cccDNA,间接免疫荧光检测感染后细胞内HBcAg的表达,电化学发光法检测感染后细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg.结果:成功建立人原代肝细胞与HepG2的杂交细胞,能体外传代培养,染色体核型分析示杂交细胞染色体众数为99条,证实为融合细胞,HBV感染后第4天起,杂交细胞内和培养上清中均能检测到HBV DNA,HBV感染后第3天起,杂交细胞内可以检测到HBV的复制中间产物HBV cccDNA,HBV感染后第4天起,杂交细胞胞质及部分胞核内HBcAg始终是阳性表达,间接免疫荧光染色呈胞质弥漫性着色,电化学发光法检测培养上清中HBsAg及HBeAg持续表达;而感染后的HepG2细胞检测结果均为阴性.结论:成功建立的兼具有人原代肝细胞和HepG2遗传特性的杂交细胞株可以被慢性乙型肝炎患者血清中的HBV病毒自然感染,可进一步用作研究HBV感染的体外细胞模型.     

Regulation of Tyrosine Hydroxylase Activity in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells: Elevation Induced by Analogs of Adenosine 3′:5′-Cyclic Monophosphate

Mouse neuroblastoma cells in culture have been used as a model for the study of the mechanism by which activities of tyrosine hydroxylase (EC 1.14.3.a) are regulated in sympathetic tissue. The activity of tyrosine hydroxylase in cultured cells drops to barely detectable activities after 1 week and remains low for months in culture in the uncloned cell line of neuroblastoma. Activity in an adrenergic clone isolated from the uncloned line has about 20% of the activity of the fresh grated tumor cell. N(6), O(2')-dibutyryl adenosine 3':5'-cyclic monophosphate causes a concentration and time-dependent increase in enzyme activity in both the cloned and uncloned cell lines. Enzyme activity is elevated by other stable analogs of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate, notably the N(6)-monobutyryl, 8-aminomethyl, and 8-methylthio derivatives of the cyclic nucleotide; by the inhibitor of cyclic nucleotide phosphodiesterase, papaverine; and by sodium butyrate. Changes in cell morphology and tyrosine hydroxylase activity are shown not to be necessarily related.     

不同血清浓度及体外培养时间对小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态学的影响

目的 探讨不同实验条件下不同血清浓度及体外培养时间对小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态学变化的影响.方法 采用体外细胞培养技术进行小鼠成纤维细胞L929细胞的培养,并用磺基罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)酶标仪法(A490 nm波长)测量各孔的吸光值(OD值)并转化为小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线.同时,分别采用HE染色法、吖啶橙荧光染色进行小鼠成纤维细胞L929细胞系形态学观察.结果 小鼠成纤维细胞L929细胞系分别在不同浓度的血清中培养2、4、6、8 d,其表现出不同的生长和生存情况及细胞形态学改变.将该细胞系处于相同培养时间和不同血清浓度(0%、20%、40%、60%、80%、100%)时,在20%和40%血清浓度组中,成纤维细胞的生长基本表现为OD值呈现快速增加趋势、且对细胞生长促进作用较强;而血清浓度为0%和100%时对小鼠成纤维细胞L929细胞生长表现出明显抑制作用及OD值呈逐渐减小的趋势.当该细胞系处于不同培养时间、且相同血清浓度时,除0%组OD值呈现减弱趋势,其他浓度组随时间的延长OD值呈增加趋势,在4 d之内OD值增长较快,4~6 d增长趋势减弱,6~8 d增长趋势回升,尤其是100%组.在这种实验条件下,小鼠成纤维细胞L929细胞的形态学也发生了相应改变.结论 不同血清浓度及不同培养时间等体外培养环境对小鼠成纤维细胞L929细胞系生长和生存及细胞学形态均有明显影响,提示利用血清进行体外细胞培养时应充分考虑所添加血清的浓度以及细胞培养的时间.     

Primary Culture of Pancreatic (Human) Acinar Cells

The acinar cell culture plays a very important role in research of pancreatic pathophysiology. The aim of this study was to establish a long-term culture of human (foetal) pancreatic acinar cells in standardized nutrient media with supplements. Acinar cells were prepared from pancreatic tissues obtained from aborted foetus (> or =35 weeks) with no prior pancreatic complications by collagenase digestion and cultured using different media and supplements. The purity and phenotype of acinar cells was confirmed by various staining techniques and FACS. The acinar cell proliferation was determined at different time intervals by Bromo-deoxyuridine (BrdU) incorporation, and metabolic enzyme activity was analysed. The acini could be cultured and maintained in Ham's F-12 K/M199 media in the presence of 5% BSA, 0.1 mg/ml STI, 10 ng/ml EGF, and 10% FCS with the same morphological appearance as that of freshly prepared for 12 days with maximum viability of 80-85% and formation of monolayer without extracellular matrix. A significant BrdU incorporation of acinar cells in primary culture was observed which was maximum (105%) at day four. Higher amylase and lipase activity was seen in freshly isolated acinar cells which decreased with time of the culture. The established human pancreatic acinar cell culture may act as an excellent model to study exocrine dysfunction or pancreatitis in response to acinar cell injury.     

实验性神经细胞老化与DNA和细胞总蛋白的相关性研究

应用流式细胞光度术观察无血清培养对神经母细胞瘤细胞的ＤＮＡ、细胞周期和细胞总蛋白的影响，以建立细胞老化实验研究模型。结果发现：无血清培养１天，多数细胞被阻滞于Ｓ期，细胞总蛋白降低；１０天时多数细胞停止于Ｇ１期，细胞总蛋白升高。