衰老真皮成纤维细胞胶原基因调控研究

目的 针对衰老真皮成纤维细胞胶原基因表达减少的特点，应用胎儿皮肤源性活性蛋白（ＳＣＦ）进行调控，以增加胶原基因的表达。方法 应用真皮成纤维细胞增养、胶原基因ｍＲＮＡ裂隙杂交和图像分析技术，观察胎儿皮肤源性活性蛋白对真皮胶原基因的调控作用。结果 以Ａｃｔｉｎ作为对照，ＳＣＦ对老年人成纤维细胞胶原基因有明显的调控作用，可以使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达增加，处理后，Ⅰ型胶原基因表达增加１５０％，Ⅲ型胶原基因增     

真皮及脂肪组织创伤后愈合差异性观察

目的观察真皮和脂肪组织创伤愈合的差异性,探讨脂肪组织创伤在瘢痕形成中的作用。方法以杜洛克母猪为实验动物,用滚轴取皮刀在同一个体背部制作真皮及脂肪组织切割（n=6）或缺损（n=1）创面,采用自身配对观察比较创伤后1、2、4及12周的大体愈合情况。对于真皮及脂肪组织切割伤创面,于创伤后1、2、3周在创面中央取材,观察创伤处组织学改变,免疫组化法观察创面修复细胞表面分子I型胶原α2、瘦素及α平滑肌肌动蛋白的表达。结果从创面中央看,瘢痕只出现在真皮组织切割伤和真皮组织缺损模型。真皮及脂肪组织切割伤同体配对比较结果显示,前者切缘处新生胶原沉积量要多于后者,且胶原类型存在差异;但两者创伤处修复细胞均以成纤维样细胞为主,细胞表面分子I型胶原α2、瘦素及α平滑肌肌动蛋白呈阳性表达。结论真皮组织损伤或缺失是形成瘢痕的主要因素,而脂肪组织损伤或缺失与瘢痕的形成并无直接相关性。与真皮组织切割伤相比,脂肪组织切割伤的创伤处纤维化的程度较轻。     

真皮及脂肪组织创伤后愈合差异性观察

目的 观察真皮和脂肪组织创伤愈合的差异性,探讨脂肪组织创伤在瘢痕形成中的作用.方法 以杜洛克母猪为实验动物,用滚轴取皮刀在同一个体背部制作真皮及脂肪组织切割(n=6)或缺损(n=1)创面,采用自身配对观察比较创伤后1、2、4及12周的大体愈合情况.对于真皮及脂肪组织切割伤创面,于创伤后1、2、3周在创面中央取材,观察创伤处组织学改变,免疫组化法观察创面修复细胞表面分子Ⅰ型胶原α2、瘦素及α平滑肌肌动蛋白的表达.结果 从创面中央看,瘢痕只出现在真皮组织切割伤和真皮组织缺损模型.真皮及脂肪组织切割伤同体配对比较结果显示,前者切缘处新生胶原沉积量要多于后者,且胶原类型存在差异;但两者创伤处修复细胞均以成纤维样细胞为主,细胞表面分子Ⅰ型胶原α2、瘦素及α平滑肌肌动蛋白呈阳性表达.结论 真皮组织损伤或缺失是形成瘢痕的主要因素,而脂肪组织损伤或缺失与瘢痕的形成并无直接相关性.与真皮组织切割伤相比,脂肪组织切割伤的创伤处纤维化的程度较轻.     

成纤维细胞胶原凝胶培养研究

目的建立一种成纤维细胞的三维培养方法.方法:将胶原、成纤维细胞、血清和培养基在正确的比例下混合,便可形成凝胶.结果:在凝胶中成纤维细胞具有良好的活力,使之形成有一定弹性和抗拉伸能力的凝胶块.结论:真皮替代物培养是研究成纤维细胞与细胞外基质间相互作用的良好模型.     

成纤维细胞胶质凝胶培养研究

建立一种成纤维细胞的三维培养方法。方法将胶原，成纤维细胞、血清和培养基在正确的比例下混合，使可形成凝胶。结果：在凝胶中成纤维细胞具有良好的活力，使之形成有一定弹性和抗拉伸能力的凝胶块。结论：真皮替代物培养是研究成纤维细胞与细胞外基质间相互作用的良好模型。     

人工真皮成纤维细胞的分离培养与鉴定

目的:建立人工真皮成纤维细胞分离培养及鉴定方法.方法:取出生24 h内的Wistar大白鼠背部皮肤,分别用组织块法及酶消化法分离纯化、传代培养,用免疫组织化学方法进行鉴定.结果:用组织块法和酶消化法培养的成纤维细胞呈梭形,属纤维型细胞,免疫组织化学染色95%以上细胞中间丝波形蛋白呈棕色颗粒或棕色着染(阳性);结蛋白抗体和第Ⅷ因子相关抗原均无棕色颗粒或棕色着染(阴性),表明所培养的细胞为比较纯净的成纤维细胞.结论:该培养方法可提供较纯净的足够量的成纤维细胞.     

肺间质纤维化中肌成纤维细胞的来源及调控因素

肺间质纤维化(PF)的病理生理过程及病因尚不十分清楚。已有研究表明多种细胞因子能够激活成纤维细胞(FB),使之转化为肌成纤维细胞(MB),MB合成释放大量细胞外基质(ECM)等成分,从而导致PF形成。目前对于PF中MB的来源主要有:肺部原有FB转化成为MB、肺泡上皮细胞(AEC)转化为MB、血液中的纤维细胞转化为肺MB等,其转化的主要调控因素包括:转化生长因子-β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)、内皮素(ET)、白介素(IL)、磷酸酶基因(PTEN)、端粒酶等。MB可造成ECM的异常沉积、肺顺应性下降、分泌多种炎性介质加重肺泡上皮损伤。     

毛囊真皮鞘成纤维细胞的培养

目的：为了解真皮鞘成纤维细胞的生物学特征。方法：采用酶消化法、组织块法分别进行毛囊真皮鞘成纤维细胞培养。结果：２种方法均获成功,培养的真皮鞘成纤维细胞具有聚集生长的特征,胞体较大,一般有２个突起;酶消化培养法操作简便、省时,但容易混 有其它成纤维细胞;组织块法培养的细胞虽然培养速度较慢,但纯度较高。结论：组织块法是进行毛囊真皮鞘成纤维细胞研究较理想的培养方法。     

心脏成纤维细胞的来源及其对心肌纤维化的作用

成纤维细胞作为主要作用细胞,通过多种来源、多种途径聚集在心脏,表型转化为肌成纤维细胞、分泌细胞外基质及生物活性因子从而引起心肌纤维化。本篇综述了生长发育过程和心肌纤维化过程中心脏成纤维细胞的来源及各型心脏相关疾病所致心肌纤维化的成纤维细胞的主要起源。     

猪胶原基真皮支架成纤维细胞生长特性的观察

目的：观察成纤维细胞在一种新型的猪胶原基真皮支架（PCDM）上的粘附生长特性,探讨提高异种真皮支架细胞相容性的方法。方法:分别在PCDM乳头层面和网状层面种植人皮肤成纤维细胞,于接种后1、7、14d通过HE染色,扫描和透射电镜下观察成纤维细胞在PCDM上的生长情况。结果:人皮肤成纤维细胞早期在乳头层真皮面的粘附优于网状真皮面,而晚期更多的网状真皮面可见到细胞形成复层并长入基质内部。结论:PCDM具有良好的细胞相容性,是与异体真皮最为接近的天然真皮支架,改良生产工艺以及去除基底膜和真皮乳头层可提高其细胞相容性。     

生长因子在人肌腱细胞和皮肤成纤维细胞中的表达差异

目的 对几种重要的生长因子在正常人体皮肤、肌腱中的表达差异进行研究。方法 体外培养人肌腱细胞和人皮肤成纤维细胞，观察细胞的形态特点；用基因芯片、免疫组化、免疫细胞化学、RT-PCR的方法对肌腱细胞和成纤维细胞的几种生长因子进行检测及比较。结果 所测生长因子中除转化生长因子-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)、类胰岛素生长因子-结合蛋白3(IGF-BP3)外，其余在肌腱细胞和成纤维细胞中的表达均无明显的差异。结论 人成纤维细胞与人肌腱细胞的生长因子表达基本相似，通过对皮肤成纤维细胞的某些特性的改造，可以使其成为构建组织工程化肌腱的种子细胞。     

获取SD仔鼠角朊细胞和真皮成纤维细胞6种方法比较

目的 :探讨如何以简便快捷的方法获得大量最佳生长状态的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞 .方法 :用 2 .5 g·L -1 胰酶、35 g·L -1 热溶素和 9.0× 1 0 3 U·L-1 Dispase分别在不同条件下处理皮肤标本 ,观察表皮与真皮的分离情况 ,并分别培养角朊细胞和真皮成纤维细胞 ,观察比较细胞的贴壁率和克隆形成率 ,通过MTT和BrdU检测观察细胞的生长状态 ,并分别用不同方法获得的细胞构建组织工程皮肤 .结果 :在各种条件下 ,Dispase处理组获得的细胞数量、细胞贴壁率和克隆形成率均优于其他消化液处理组 ,细胞纯度高 ,生长状态良好 ;用其他方法获得的细胞生长状态相似 ,都可成功构建组织工程皮肤 .结论 :使用9.0× 1 0 3 U·L-1 Dispase可以简便快捷的获得大量生长状态良好的角朊细胞和真皮成纤维细胞 ,以作为皮肤组织工程的种子细胞 ,合适的消化方法、时间和温度可以最大限度保持原代细胞的活力     

真皮内脂肪组织调控皮肤生理病理过程与机制的研究进展

真皮内脂肪组织(dermal white adipose tissue,dWAT)是位于真皮网状层正下方的一层白色脂肪组织。dWAT在皮肤的生理病理过程中发挥着重要的作用,具有调控毛囊生长周期、促进创面愈合、介导皮肤先天性免疫和对抗皮肤衰老的作用。其最新的研究成果更新并加深了我们对皮肤的认识,并有望成为皮肤损伤修复与疾病治疗的新靶点。本文就dWAT新的研究进展做一综述。     

Cell fragments and collagen structure of cell-free dermal substitutes

The antigenicity of inartificial dermis can be minimized by removing cell components while keeping the intrinsic structures. To minimize the antigenicity, the cell fragments must be wiped off as clearly as possible. Thus, the test of cell fragments is very important for the evaluation of dermal matrix production. And in the process of the production, the structure must be kept integrated to avoid scar formation resulting from breakage. By new methods, we have produced swine acellular dermal matrix （SADM） and goat acellular dermal matrix （GADM） without using glutaraldehyde. In this study, we tested the cell fragments and collagen structure of these two dermal substitutes.[第一段]     

新生牛血清对大鼠脂肪来源细胞生长的影响

目的探索新生牛血清对大鼠脂肪来源细胞生长状态的影响。方法用新生牛血清代替传统的胎牛血清对脂肪来源细胞进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态,与胎牛血清培养条件下的脂肪来源细胞形态进行比较。结果新生牛血清培养条件下的大鼠脂肪来源细胞镜下呈短梭形或多角形,与胎牛血清培养的脂肪来源细胞形态相似,但细胞在P2～P3代即出现了衰老趋势。结论新生牛血清对体外培养的脂肪来源细胞的活力有负面影响,可能不适用于脂肪来源细胞的培养。     

人脂肪基质细胞向胰岛素分泌细胞的分化诱导

目的:体外分离培养人脂肪来源基质细胞（hADSCs）,并定向诱导hADSCs向胰岛样细胞分化,探讨hADSCs分化为胰岛素分泌细胞的潜能。方法:从脂肪抽吸物中分离hADSCs,利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺和exendin-4等因子诱导hADSCs向胰岛样细胞分化。采用RT-PCR检测诱导前后胰岛素、胰十二指肠同源性盒因子(Pdx-1)、葡萄糖转运因子2(Glut-2)和胰高血糖素(glucagon)基因的表达;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团;免疫荧光染色检测诱导后细胞胰岛素和Pdx-1的表达;ELISA检测诱导后细胞在低糖和高糖环境中胰岛素的分泌量。结果:诱导7 d左右细胞由长梭形逐渐变成多边形,并且细胞开始呈岛状聚集,21 d左右形成胰岛样细胞团。双硫腙染色阳性;RT-PCR显示,诱导后细胞表达胰岛素、Pdx-1、Glut-2和glucagon基因;免疫细胞化学显示,诱导后细胞表达胰岛素和Pdx-1;葡萄糖刺激实验显示胰岛素的释放,并且随着葡萄糖浓度增加胰岛素的释放量也增加。结论:体外hADSCs具有分化为胰岛素分泌细胞的潜能,为将来应用于临床移植治疗糖尿病奠定了基础。     

活性真皮基质的研制及生物学活性检测

目的构建含有成纤维细胞（Fb）-胶原-猪去细胞真皮基质（PADM）的活性真皮基质。研究培养液中转化生长因子-β1（TGF-β1）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的分泌情况。方法将Fb与胶原混合种植于PADM的表面,收集第2、4、6、8、10d培养液样本,双抗体夹心ELISA法测定其中TGF-β1、bFGF的含量。结果Fb在胶原内结构完整,与PADM形成复合真皮基质。TGF-β1和bFGF浓度培养第4天与第2天比较显著上升（P〈0．01）,并达到稳定水平。结论Fb-胶原-PADM真皮替代物可作为构建组织工程全层皮肤的真皮支架。     

脂肪来源干细胞体外成骨诱导和成脂诱导分化

目的 探讨脂肪组织来源的多能干细胞(adipose tissue-derived stromal ceHs,ADSCs)的多向分化潜能.方法 取小香猪腹部皮下脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等步骤分离培养ADSCs,经过原代培养和传代培养.分别加入成骨诱导剂和成脂诱导培养.经过倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,并通过Gomori改良钙钴法、yon Kossa染色和油红O染色对其成骨细胞和脂肪细胞表型进行鉴定,进一步比较细胞的转化率.结果 ADSCs呈成纤维细胞样贴壁生长,其经成骨、成脂诱导培养2周后形态、体积发生明显改变.Gomori改良钙钴法染色显示其细胞质内富含碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)颗粒,诱导后15 d和19 d,ALP阳性细胞分别为(25.0±7.5)%和(49.7±6.9)%,von Kossa染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节;倒置显微镜,成脂诱导3、7、14 d后脂肪细胞转化率分别为(22.3±12.5)%、(49.6±7.1)%和(89.4±9.3)%.油红O染色可见细胞质内出现橙红色脂滴,14 d油红O染色阳性率高达(92.5±9.1)%.结论 ADSCs经体外诱导培养后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,并具有明显的成骨和成脂表型,表明ADSCs具有多向分化潜能.     

缺氧预处理的脂肪间充质干细胞对小鼠硬皮病模型的治疗作用

目的 观察脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived stromal cells, ADSCs）及缺氧预处理的ADSCs（hypoxia-pretreated ADSCs, hpADSCs）对硬皮病小鼠皮损组织的治疗作用。方法 分离提取小鼠的脂肪间充质干细胞,体外培养至第3代后,部分细胞进行缺氧预处理。使用博来霉素（bleomycin, BLM）对小鼠进行造模,根据处理方式分为PBS处理的空白对照组、BLM模型组、ADSCs治疗组、hpADSCs治疗组。各组皮损样本石蜡切片分别进行H-E染色、Masson染色,检测真皮厚度、羟脯氨酸评估胶原水平,检测H2O2评估氧化应激水平,使用Western印迹法和免疫组化评估α-SMA及TGF-β的表达水平。结果 与空白对照组相比,BLM模型组真皮厚度和组织内H2O2水平明显增加（P<0.05）,α-SMA和TGF-β表达水平也有一定程度的上调。虽然ADSCs治疗能够一定程度上降低真皮厚度,但是差异无统计学意义（P>0.05）,而hpADSCs治疗能够显著降低小鼠真皮厚度（P<0.05）。ADSCs与hpADSCs治疗均能够明显降低组织内H2O2水平（P<0.05）。相比ADSCs治疗,hpADSCs治疗能够更好地降低真皮内TGF-β和α-SMA的表达水平。结论 ADSCs能够降低硬皮病小鼠的胶原沉积并下调氧化应激水平,hpADSCs有更好的治疗效果。