少突胶质前体细胞分离培养方法及其谱系限定细胞体外分化模型建立的改进

目的：对少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,探讨体外条件下OPCs的增殖与分化特性。方法： 取新生SD大鼠脊髓来源的细胞分离、纯化OPCs行原代培养,用含碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和血小板源性生长因子-aa(platelet-derived growth factor-aa,PDGF-aa)的培养液作扩增培养,MTT法检测OPCs的增殖能力;三碘甲腺原氨酸和睫状神经生长因子诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs),并对分化细胞行形态学及免疫化学染色法鉴定。结果：95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态并表达A2B5;MTT法检测显示OPCs在体外保持良好的增殖能力;细胞最终诱导分化为成熟的OLs并表达髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)。结论：OPCs在体外条件下可继续保持良好的增殖生长及定向分化能力。     

大鼠少突胶质前体细胞纯化及原代培养的新方法

【摘要】目的 建立简单、高效的少突胶质前体细胞（OPCs）分离培养方法。方法 取出生2天的SD大鼠大脑皮层,分离消化皮层细胞为单细胞悬液,采用A2B5免疫磁珠提纯OPCs进行体外培养,倒置显微镜观察细胞生长状况,并在第7天采用免疫荧光检测OPCs特异性标志A2B5和O4;培养7天后换为OPCs分化培养基诱导OPCs分化,分化培养7天后,免疫荧光法检测成熟少突胶质细胞特异性标志骨髓碱性蛋白（MBP）。结果 培养过程中观察发现,95%以上的细胞具有双极或三级突起的典型形态,免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95%以上表达A2B5和O4;分化培养后95%以上的细胞为MBP阳性的少突胶质细胞。结论 采用磁珠法可以获得高纯度的OPCs,并且细胞具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。     

少突胶质前体细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用研究

目的少突胶质细胞是中枢神经系统的重要组成部分。本文探讨获取小鼠高纯度少突胶质前体细胞系的培养及鉴定方法,以及巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对其增殖活性的调节。方法取新生（0-2 d）C57B6小鼠的大脑皮层进行混合胶质细胞培养,在9-10 d时采用振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞,然后用添加了神经营养因子（N2）、血小板衍生生长因子-AA（PDGF-AA）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清培养基培养。倒置显微镜下每天观察细胞的生长情况,免疫荧光法对表面抗原进行细胞鉴定。然后按104个细胞/孔加入96孔板培养,细胞70%-80%融合时用不同浓度MIF处理细胞,48 h后用甲基噻唑基四唑（MTT）检测细胞增殖程度。结果获得纯度90%以上少突胶质前体细胞（OPCs）,少突胶质前体细胞NG2及血小板衍生生长因子受体（PDGFR）抗体阳性;胶质细丝酸性蛋白（GFAP）及髓鞘碱性蛋白（MBP）均为阴性。MTT检测结果显示低剂量的MIF能促进OPCs的增殖,并具有剂量效应关系;高剂量MIF则抑制OPCs的增殖。结论通过振荡及差速贴壁法并结合少突胶质细胞定向培养基可以成功获得高纯度的OPCs,MIF能以剂量效应关系促进OPCs增殖。为进一步深入探讨其相关机制及OPCs移植治疗脊髓损伤奠定基础。     

大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞的生物学特性

目的 探讨大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外条件下的增殖及分化等生物学特性,为进一步研究脊髓脱髓鞘疾病的髓鞘再生奠定基础.方法 采用免疫吸附法原代培养大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞,并用免疫荧光染色鉴定其表面标志物A2B5及NG2;采用Alarm blue法检测其在体外的增殖能力,并绘制生长曲线;诱导原代培养的少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞分化,并用免疫荧光染色鉴定成熟少突胶质细胞表面标志物MBP及GalC的表达情况.结果 免疫吸附法可以对大鼠脊髓组织中的少突胶质前体细胞进行有效的分离纯化,分离获得的少突胶质前体细胞A2B5及NG2表达呈阳性,Alarm blue法检测结果显示少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力,诱导分化实验证实少突胶质前体细胞可以分化为成熟少突胶质细胞并且MBP及GalC表达呈阳性.结论 采用免疫吸附法原代培养的大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力以及分化为成熟少突胶质细胞的能力.     

新生大鼠大脑皮质O-2A祖细胞的体外诱导分化

目的 :探索新生大鼠大脑皮质O -2A祖细胞的体外分离纯化的培养条件 ,并观察其在体外增殖、分化的规律 ;鉴定体外培养的O -2A祖细胞、2型星形胶质细胞及少突胶质细胞。方法 :根据 1型星形胶质细胞、O -2A祖细胞的生长时间差异及细胞的粘附特性不同 ,采用振荡法和差速贴壁法 ,并结合使用生长因子 (PDGF ,bFGF )刺激O -2A祖细胞增殖 ,从而分离纯化、扩增O -2A祖细胞 ;观察O -2A祖细胞在有血清 (D/F + 2 0 %FCS)和无血清 (CDM )培养条件下的分化情况。免疫细胞化学法鉴定O -2A祖细胞(A2B5 )和分化成熟的 2型星形胶质细胞 (GFAP ,A2B5 )及少突胶质细胞 (CNPase)。结果 :①分离纯化的O -2A祖细胞胞体呈椭圆形 ,具有典型的双极或三极突起 ;经免疫细胞化学染色鉴定 ,A2B5抗体标记阳性 ,细胞纯度达 95 % ;②应用有血清的培养基诱导O -2A祖细胞定向分化为 2型星形胶质细胞 ,2型星形胶质细胞的胞体较大 ,突起多而细长 ,GFAP和A2B5抗体标记均为阳性 ;③应用无血清的化学条件培养基诱导O -2A祖细胞定向分化为少突胶质细胞 ,少突胶质细胞的胞体小 ,突起短而细 ,相互交织呈“蜘蛛网”样 ,CNPase抗体标记阳性。结论 :①采用振荡法和差速贴壁法 ,并结合使用生长因子 ,建立了分离纯化O -2A祖细胞的方法 ;②分离纯化的O -2A     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

Aβ1-42抑制少突胶质前体细胞增殖与分化的实验研究

目的 探讨在离体细胞培养条件下,Aβ1-42对SD乳鼠少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)增殖与分化的影响.方法 采用条件培养液原代培养获得高纯度SD乳鼠OPCs,分为正常组、加入无菌水的对照组、加入Aβ1-42的实验组,采用CCK-8检测存活细胞数量和增殖水平,Western blot检测细胞凋亡蛋白含量,免疫细胞化学染色观察细胞形态变化及分化情况.结果 与对照组相比,实验组OPCs存活率显著降低(P＜0.01),具体表现为:Aβ1-42作用OPCs 1 h后,细胞增殖明显受到抑制(P＜0.01);药物浓度1 moL/L作用于OPCs时,增殖也受到影响(P＜0.05),当Aβ1-42剂量增加至2.5 mol/L时,细胞增殖明显受到抑制(P＜0.01),而对照组与正常组无显著差异(P＞0.05).对凋亡蛋白Caspase-3的检测发现,它们在对照组与正常组的表达水平基本相当(P＞0.05),而在实验组明显升高(P＜0.01),且呈现时间和浓度依赖性,具体表现为:Aβ1-42作用OPCs 2 h后,Caspase-3表达水平明显上调(P＜0.01);药物浓度2.5 mol/L作用于OPCs时,蛋白表达水平有所升高(P＜0.05),当Aβ1-42剂量增加至5 mol/L时,Caspase-3表达水平明显上调(P＜0.01).对成熟少突胶质细胞标记物髓鞘碱性蛋白的免疫染色发现,与对照组相比,实验组的细胞体积明显变小,突起明显减少.结论 Aβ1-42可能通过促使细胞凋亡而抑制OPCs增殖,并抑制了OPCs向成熟少突胶质细胞分化,从而影响中枢神经系统的髓鞘形成.     

人胚胎皮层神经前体细胞的分离培养及鉴定

目的 从20周人胚皮层中分离神经前体细胞并鉴定其增殖及分化能力。方法 应用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清限制培养基从20周自然流产人胚胎皮层组织中分离神经前体细胞,通过神经球形成法使其不断增殖,利用BrdU检测细胞的增殖能力,去除生长因子后诱导神经前体细胞分化。利用流式细胞仪检测神经球内细胞的增殖细胞周期。结果 人胚胎皮层存在神经前体细胞,这些细胞于EGF及bFGF作用下可不断增殖形成神经球,并能自我更新和结合BrdU,于生长因子去除后能够分化成熟的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。反复传代后这些细胞可保持其增殖及分化能力。细胞周期结果显示神经球内细胞增殖较为活跃。结论 从人胚胎中分离的细胞能于体外自我更新和分化为成熟的细胞,证实为神经前体细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎端脑皮层在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体———巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。结果获得了大量自我增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。结论成功分离并获得了大鼠胚胎端脑皮层神经干细胞,并连续稳定传代,具有多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

少突胶质祖细胞的体外分离、培养和定向分化

目的探索体外培养获得高纯度少突胶质祖细胞的方法,观察少突胶质祖细胞的形态学特点以及增殖和分化规律。方法选取新生1～2 d SD大鼠,应用选择性分离程序,根据细胞的不同贴壁特性,通过2次细胞选择性贴壁培养和2次不同频率的振荡,分离纯化少突胶质祖细胞。应用物理振荡方法进行细胞传代,进一步纯化细胞。传代细胞分别用无血清和有血清的培养基培养,应用免疫荧光法进行细胞鉴定。结果纯化后的少突胶质祖细胞达95%。在无血清的情况下,少突胶质祖细胞定向分化为少突胶质细胞;在有血清的情况下,定向分化为2-型星形胶质细胞,并且细胞骨形态形成性蛋白质4(BMP4)表达增加。结论应用选择性分离程序,通过振荡分离的方法可以获得高纯度的少突胶质祖细胞。少突胶质祖细胞具有增殖和双向分化的潜能。BMP4参与了祖细胞定向分化的调控。     

Differentiation of rat oligodendrocyte precursor cells in chemical conditional medium in vitro

Objective： To investigate in vitro differentiation of oligodendrocyte precursor cells （OPCs） into mature oligodendrocytes in chemical conditional medium. Methods： The mixed glial cells from cerebral cortices of 48-hour-old Sprague-Dawley （SD） rats were cultured in vitro. The OPCs were separated by shaking procedure around 9-10 d in the primary culture. Then the isolated OPCs were further transferred into the chemical conditional medium for cell differentiation. The pattern of OPCs maturation in vitro was continuously observed with contrast phase microscopy and mature oligodendrocytes were further identified by immunocytochemical assays. Results： OPCs grew well when co-cultured with glial cells and distinct cellular stratification formed about 9-10 d in the primary culture, which indicated the appropriate opportunity for the separation of OPCs. Following cultured in the chemical conditional medium, the OPCs progressively differentiated into the mature oligodendrocytes. These mature oligodendrocytes were also immunostained with the oligodendrocyte lineage-specific antibody, Oligo2. Conclusion： The OPCs isolated from the cerebral cortices of neonatal SD rats can progressively differentiate into mature oligodendrocytes in the chemical conditional medium in vitro.     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞（OPCs）。方法新生1～2d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的 对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞(OPCs)。方法 新生1~2 d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8 d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2 d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果 光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论 通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

新生大鼠少突胶质前体细胞的培养与鉴定

目的 在体外培养条件下获取纯度较高的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs).方法 原代混合胶质培养,利用振荡法和差速贴壁法分离纯化少突胶质前体细胞,再用无血清化学条件培养基培养.免疫荧光法及膜片钳记录细胞电生理特性进行鉴定.结果 振荡分离后超过90%细胞为NG2阳性OPCs:OPCs电生理特性:输入阻抗Ra相对较高;电压依赖的K 电流具有外向整流特性;对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的小的内向Na 流,不能产生动作电位.结论 振荡法结合差速贴壁可以获得纯度较高的OPCs;OPCs具有区别于神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞的独有电生理特性.     

大鼠寡突胶质前体细胞的体外培养、鉴定及其生物学特性观察

目的 探讨体外培养条件下寡突胶质前体细胞增殖、迁移及分化特性。方法 取新生1 d SD大鼠大脑皮质混合胶质细胞培养10 d,分离纯化寡突胶质前体细胞。通过BrdU掺入实验对其增殖能力进行测定,采用经典的Transwell模型和重聚球模型对其迁移能力进行检验,并在分化培养基中观察其分化成为成熟寡突胶质细胞的能力。结果 混合培养胶质细胞在培养10 d后出现明显分层现象。初次振荡后,小胶质细胞脱落显示大量聚集成团的寡突胶质前体细胞散布于星形胶质细胞表面。分离的寡突胶质前体细胞NG2、A2B5表达阳性;阿糖胞苷可抑制其增殖(P<0.01);PDGF可明显促进其迁移(P<0.01);在分化培养条件下,MBP阳性的成熟寡突胶质细胞增多(P<0.01)。结论 寡突胶质前体细胞在体外培养条件下可以保持其增殖、迁移和分化的基本特性。     

P2X7受体在OPCs缺氧缺血性损伤中作用的初步研究

目的了解P2X7受体在离体培养的少突胶质前体细胞(OPCs)缺氧缺血性损伤中的作用。方法建立离体OPCs培养模型,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放百分比评估细胞死亡;Western blot分析缺氧缺血前后OPCs P2X7受体表达变化。结果 (1)缺氧缺糖(OGD)后2 h,近40%OPCs死亡。OGD前预先给予P2X7受体拮抗剂BBG起到部分保护作用;OGD条件下,P2X7受体激动剂BzATP加重OPCs缺氧缺血性损伤,并且这种增强的毒性作用不能被BBG拮抗。(2)Western blot显示,OGD后2 h,P2X7受体蛋白表达迅速下调。结论 P2X7受体可能参与了OPCs缺氧缺血性损伤过程。     

少突胶质前体细胞与髓鞘形成及再生的研究进展

脱髓鞘病变可阻碍神经系统电传导,导致功能障碍。髓鞘再生由广泛分布于成体的少突胶质前体细胞(OPC)介导。理解少突胶质细胞生理学,了解髓鞘形成与维稳机制,了解在某些主要神经系统病变(如多发性硬化)CNS髓鞘再生失败与内源性OPC数量、迁移以及形成髓鞘能力的关系,对于改善髓鞘修复策略具有重要意义。     

血管内皮生长因子促进少突胶质前体细胞增殖及其机制的初步研究

目的观察不同浓度血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对少突胶质前体细胞(oli-godendrocyte precursor cells,OPCs)增殖的影响,探索VEGF促进OPCs体外增殖与Notch信号通道上相关蛋白的关系。方法分离纯化培养OPCs,MTT法检测不同浓度VEGF(50、100、200 ng/ml)促进OPCs增殖的作用以及加入Notch通路γ-分泌酶抑制剂DAPT(VEGF 100 ng/ml+DAPT50μmol/ml)后OPCs增殖变化情况,RT-PCR、Western blot技术检测VEGF处理OPCs后Notch信号通道上Notch-1、Hes-1的基因表达和蛋白表达情况。结果 50、100、200 ng/ml VEGF处理组的细胞增殖率分别为(107±2)%、(124±2)%、(142±7)%,与空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);VEGF+DAPT处理组的增殖率下降至(103±4)%(P<0.05)。RT-PCR及Western blot分析显示VEGF处理OPCs后,Notch-1、Hes-1蛋白在基因水平和蛋白水平表达均增加(P<0.05),γ-分泌酶抑制剂DAPT能抑制其表达(P<0.05)。结论 VEGF对OPCs具有促进增殖的作用,其促增殖作用与Nocth信号通路相关蛋白有关。