酵母双杂交诱饵蛋白LASS1融合表达质粒的构建及鉴定

目的 构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒,为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础.方法 应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段,分别克隆入酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性.利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况.结果 LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag(111 bp)、Slag(109 bp);Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22 kU处特异性反应;重组质粒转化酵母后无自激活作用.结论 重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够在AH109内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用.     

柯萨奇病毒B3型VP1基因在酿酒酵母中的表达

目的在酿酒酵母AH109中表达柯萨奇病毒B3型VP1基因，并检测VP1蛋白对报告基因的转录自激活作用。方法用乙酸锂法将重组柯萨奇B3病毒VP1基因的细菌一酵母菌穿梭载体pGBKT7一VP1转化酵母菌。通过表型鉴定、PCR法验证质粒导入宿主菌后，Western blotting验证VP1蛋白的表达，最后经营养缺陷培养基和酶底物x—a-Gal反应检测VP1基因对报告基因的转录自激活作用。结果表型鉴定和PCR法均证实pGBKT7-VP1质粒转入酵母菌成功，Western blotting证实AH109能表达VP1蛋白，营养缺陷型培养基和酶底物X-a—Gal反应结果显示VP1蛋白对3种报告基因均无转录自激活作用。结论柯萨奇病毒B3型VP1蛋白可作为酵母双杂交系统的诱饵蛋白，为筛选与其相互作用的宿主细胞蛋白提供了基础。     

禽流感病毒NP基因的酵母双杂交饵载体表达及自激活检测

目的构建H5N1亚型禽流感病毒NP基因的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用。方法以PCR法从pGEMT/H5NP扩增NP基因编码区序列,将其定向克隆到PGBKT7载体,经测序鉴定后,PEG/Li-Ac法转化酵母菌株AH109,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用同时Westernblot验证诱饵蛋白的表达。结果获得NP编码区基因,并成功构建酵母双杂交系统中的诱饵载体pGBKT7-NP,对宿主细胞酵母菌株AH109无毒性和自激活作用,并能在酵母细胞中稳定表达。结论诱饵载体pGBKT7-NP可用于GAL4酵母双杂交系统钓取与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白。     

酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(Middle hepatitis B surface protein,MHBs protein)相互作用的肝细胞蛋白。方法 PCR扩增MHBs编码基因并将S区起始密码子突变,获得目的基因MHBs-mut,克隆于诱饵载体pGBKT7。在证实MHBs-mut蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。结果构建酵母双杂交诱饵载体,获得重组质粒pGBKT7-MHBs-mut。Western blot显示其在酵母中表达MHBs-mut蛋白。酵母双杂交筛选并验证,得到与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白:COP9信号体第五个亚单位(COPS5,又名C-Jun结合蛋白1,c-Jun-activation-domain binding protein 1,JAB1)。结论乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白与COPS5在酵母AH109细胞中具有相互作用。     

细粒棘球蚴TGF—βⅠ型受体全长和胞内域酵母双杂交载体的构建及白激活鉴定

目的构建细粒棘球绦虫（Eg）转化生长因子I型受体（EgTβRI）全长及胞内域酵母双杂交真核表达载体,愉测重组诱饵质粒对酵母菌株的毒性作用及自激活活性。方法采用TRIzol法提取细粒棘球蚴总RNA;采用RT—PCR扩增EgTβRI全长基因及EgTβRI胞内域（EgTβRIintracellulardomain,EgTβRII）基因片段,分别构建pGBKT7-EgTβRI和pGBKT7-EgTβRI—I真核表达载体,经PCR、限制性酶切鉴定及序列测定正确后,PEG／LiAc法转化人酵母菌株,检测诱饵蛋白对酵母菌的毒性作用及其自激活活性。结果成功构建了pGBKT7-EgTβRI及pGBKT7EgTβRI—I真核表达载体,经双酶切,分别得到1662bp和1314bp目的基因片段,大小与预测值相符。两重组质粒转化Y2HGold酵母菌形成的菌落与pGBKT7质粒转化酵母菌菌落大小一致,直径为1．5～2．0mm;两重组质粒转化酵母菌在SD／Trp／X／A平板上无蓝色菌落生长,在SD／-Trp平板上形成直径为2mill的菌落。结论成功构建了pGBKT7-EgTβRI及pGBKT7-EgTβRI—I真核表达载体,其表达蛋白对Y2HGold酵母菌无毒性作刷和无自激活活性;该表达载体可以用于酵母双杂交系统,为进一步研究EgTβRI与其配体之间的交互作用奠定了基础。     

细粒棘球蚴14-3-3与MKK2酵母双杂交载体的构建及自激活鉴定

目的构建细粒棘球幼(Eg)14-3-3与MKK2酵母双杂交系统,并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测。方法从Eg cDNA中扩增Eg14-3-3基因和EgMKK2编码序列,将其克隆入酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7中,经PCR、限制性酶切鉴定及序列测定正确后,PEG/LiAc法转化酵母菌株,检测融合蛋白对酵母菌生长的影响和自激活活性。结果扩增Eg14-3-3和EgMKK2基因编码区全长分别为749bp和1 572bp。构建的pGBKT7-Eg14-3-3及pGADT7-EgMKK2重组质粒转化到酵母细胞Y2HGold中,检测表达蛋白对Y2HGold无毒性及自激活作用。结论 Eg14-3-3基因和EgMKK2编码序列表达的蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性和自激活作用,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。     

应用酵母双杂交技术筛选转录因子MEOX2的相互作用蛋白

目的研究同源盒基因Meox2所编码的转录因子MEOX2在心肌细胞内与哪些蛋白质存在相互作用。方法应用酵母双杂交技术对人心脏cDNA文库进行筛选。（1）通过PCR方法扩增编码组氨酸／谷氨酸（H／Q）富含区缺失的MEOX2蛋白质（Meox2△HQ）的DNA片断，并克隆进入pGBKT7载体，从而构建“诱饵”质粒pGBKT7-Meox2△HQ；（2）将“诱饵”质粒pGBKT7-Meox2△HQ转化酵母菌AH109，然后从被转化的酵母菌中提取蛋白质，应用抗C-Myc单克隆抗体进行免疫印迹分析，检测“诱饵”蛋白的表达；（3）将被“诱饵”质粒转化的AH109分别涂布于SD／-Trp、SD／-Trp／-His、SD／-Trp／-Ade和SD／-Trp／X-α-GAL平板上，以观察“诱饵”蛋白自我激活报告基因与否；（4）将已被“诱饵”质粒转化的AH109与人心脏cDNA文库进行杂交，筛选阳性克隆，分离阳性克隆中的cDNA，并测序。结果Meox2△HQ与pGBKT7中的Gal4 DNA结合域及C-myc在同一读框，并稳定表达融合蛋白“Gal4 DNA结合域．C-myc-Meox2△HQ”，“诱饵”蛋白不会自我激活报告基因，筛选得到11个准阳性克隆。结论同源盒基因Meox2所编码的转录因子MEOX2可能与心肌细胞中的多种蛋白质存在相互作用，并参与这些蛋白质表达的调控。     

应用酵母双杂交技术筛选HERG钾通道相互作用蛋白

目的筛选心肌细胞内哪些蛋白质与HERG钾通道存在相互作用。方法 (1)通过PCR方法扩增编码心脏herg基因N端的cDNA片段(HERG-NT,aa 1-403)和C端的cDNA片段(HERG-CT,aa 669-1159),分别克隆进入pGBKT7载体,构建pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT诱饵质粒;(2)将被诱饵质粒转化的AH109分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/X-α-Gal平板上,以观察诱饵蛋白是否自我激活报告基因;(3)将已被诱饵质粒转化的AH109分别与预转染于Y187的人类心脏cDNA文库进行酵母双杂交,分离阳性克隆中的cDNA,并测序。结果 (1)成功构建诱饵载体pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT,测序结果表明herg-NT和herg-CT都和"GAL4 DNA-BD-C-Myc"在同一读框,没有PCR引起的突变;(2)"诱饵"蛋白HERG-NT和HERG-CT均未能自我激化报告基因Ade2、Mel1和LacZ,弱激活报告基因His3,应用5mmol/L的3-AT可以有效抑制HERG-NT或HERG-CT所引起的组氨酸表达;(4)经过严格筛选后,发现Caveolin-1、FHL2和PTPN12等15种蛋白与HERG-NT存在相互作用,Myotrophin等8种蛋白与HERG-CT相互作用。结论成功应用酵母双杂交技术,以HERG钾通道蛋白的氨基端或羧基端为诱饵蛋白,筛选HERG钾通道的相互作用蛋白(Caveolin-1、FHL2、PTPN12、Myotrophin等),这些蛋白质可能与HERG存在相互作用。     

HBsAg诱饵载体的构建、表达及人胰腺cDNA文库的扩增、纯化和转化

目的构建HBsAg诱饵真核表达载体,并在AH109酵母菌中进行表达,同时扩增、纯化、鉴定及转化人胰腺cDNA文库。方法通过PCR扩增HBsAg基因,克隆到pGEM-T载体,测序正确后酶切并连接至表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp/Kana)上筛选阳性菌落,提取重组蛋白,经SDS-PAGE电泳后进行Western blot分析。扩增、纯化人胰腺cDNA文库并进行酶切鉴定及生物信息学分析,醋酸锂法将其转入Y187酵母菌。结果成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBsAg、SDS-PAGE和Western blot显示重组蛋白在酵母细胞中正确表达;成功构建人胰腺cDNA文库,其容量为4×109 CFU/L,插入片段大小为0.5～2.0kb,长度不均,重组率为100%。结论成功构建HBsAg真核载体并在AH109酵母菌中表达,同时获得高质量的胰腺cDNA文库并转化入Y187酵母菌,为通过酵母双杂交筛选与HBsAg相互作用蛋白基因奠定了基础。     

弓形虫ROP21诱饵质粒的构建与自激活鉴定

目的筛选与弓形虫ROP21相互作用的宿主蛋白。方法构建弓形虫ROP21基因的三个诱饵载体,通过酵母双杂交技术分别对其在Y2H Gold酵母菌中的毒性和自激活进行鉴定。提取弓形虫RNA并进行反转录,采用RT-PCR方法扩增得到弓形虫ROP21全长序列,根据其不同功能区构建全长或部分序列诱饵质粒,测序后分别命名为pGBKT7-ROP21、pGBKT7-LC和pGBKT7-ST。将重组的诱饵载体转化到Y2H酿酒酵母菌,在营养缺陷型培养基上观察该重组诱饵载体的毒性和自激活现象。结果发现三个质粒转化酵母菌后,pGBKT7-ROP21和pGBKT7-ST存在自激活现象,而pGBKT7-LC转化酵母菌不存在,因此其可以作为酵母双杂交筛选的诱饵质粒。结论为进一步运用酵母双杂交技术筛选与弓形虫ROP21互作的宿主蛋白奠定了基础。     

弓形虫ROP2酵母双杂交诱饵表达载体构建及毒性和自激活活性检测

目的为筛选弓形虫分泌毒性因子-棒状体蛋白2(ROP2)在终末宿主细胞内的互作因子,构建ROP2的酵母双杂交诱饵表达载体,并检测其表达蛋白对酵母菌生长的毒性作用及自激活活性。方法根据ROP2蛋白的特性选取1~561氨基酸、25~241氨基酸、242~561氨基酸作为目的片段,PCR扩增弓形虫基因组获得3片段,定向克隆到酵母表达载体pGBKT 7上,经测序正确后,将其转化到酵母菌Y187感受态细胞,在缺陷性培养基上观察3个诱饵表达载体在Y187中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。结果成功扩增出ROP2基因的3个目的片段,并将其克隆到诱饵表达载体pGBKT7中,经测序及酶切鉴定结果正确,转化到酵母Y187细胞中的诱饵表达载体无毒性和自激活作用。结论成功获得了对宿主酵母细胞无毒性且未自主激活活性的诱饵表达载体pG-BKT7-ROP2_(1-561)、pGBKT7-ROP2_(242-561)、pGBKT7-ROP2_(25-241),可作为酵母双杂合系统中的"诱饵",为下一步利用酵母双杂交系统筛选ROP2在终末宿主细胞内的相互作用蛋白创造了条件。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5在酵母细胞中的表达

目的：在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5（PS1TP5）。方法：以HepG2细胞来源的mRNA为模板，经RT-PCR法扩增PS1TP5基因，克隆到pGEM-T载体中，并测序鉴定，酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中，并转化酵母AH109，色氨酸缺陷型培养基（SD／-Trp）上筛选阳性菌落，提取酵母蛋白质，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western免疫印迹分析，以明确PS1TP5是否可在其中表达。结果：成功扩增出PS1TP5，测序鉴定符合基因库报告序列，酶切回收的PS1TP5基因片段成功克隆人酵母表达载体pGBKT7，并转化人酵母细胞AH109中，Western免疫印迹显示该基因在酵母细胞中成功表达，表达产物相对分子质量为36950。结论：成功构建了PS1TP5酵母表达载体，并在酵母细胞中表达。     

细粒棘球蚴TGF-βⅡ型受体不同结构域酵母双杂交载体的构建和自激活鉴定

目的构建细粒棘球蚴转化生长因子βⅡ型受体全长(EgTβRⅡ)、受体结合域(EgTβRⅡ-A)和激酶域(EgTβRⅡ-K)的酵母双杂交真核表达载体,检测重组融合蛋白对酵母Y2HGold菌株的毒性作用和自激活活性。方法采用Trizol法提取细粒棘球绦虫总RNA,反转录合成cDNA;PCR扩增EgTβRⅡ-A、EgTβRⅡ-K和EgTβRⅡ基因,分别克隆入pGADT7、pGBKT7载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定及序列测定正确后,采用PEG/LiAc法转入酵母菌,检测重组融合蛋白对酵母菌毒性和自激活活性。结果构建EgTβRⅡ-A、EgTβRⅡ-K和EgTβRⅡ的pGADT7、pGBKT7重组质粒,经双酶切和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到长度为406bp、1 023bp和1 824bp的目的基因片段,与预期结果一致;重组质粒转化酵母菌后形成的菌落与对照质粒pGBKT7转化菌的菌落生长状况一致,直径1.5~2.0mm,而在SD/-Leu/X/AbA、SD/-Trp/X/AbA平板上无菌落生长。结论成功构建EgTβRⅡ-A、EgTβRⅡ-K和EgTβRⅡ基因的pGADT7、pGBKT7真核表达载体,其表达蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性作用和自激活活性,重组质粒载体可用于酵母双杂交系统,为鉴定EgTβRⅡ在TGF-β/Smad通路中的生物学功能奠定了理论基础。     

应用酵母双杂交技术筛选与pGBKT7-CT813编码产物相互作用蛋白的研究

目的以pGBKT7-CT813作为诱饵质粒与HeLa细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库进行酵母双杂交试验,以进一步探讨沙眼衣原体包涵体膜蛋白的生物学功能。方法根据STD基因库提供信息设计引物,用PCR法获取目的基因片段CT813,经酶切处理的CT813和pGBKT7质粒,在T4连接酶作用下连接,连接产物转入感受态细胞BL-21,培养后进行菌落PCR验证,对阳性质粒进行测序分析。质粒转化入酵母菌株Y187和AH109中,检测其有无自激活及毒性作用。阳性重组酵母菌株AH109与cDNA文库菌株Y187进行配合,待三叶草（或米奇）形状合子形成后涂布于腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸缺陷型培养基和铺有X-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上初筛,再经过2次筛选,收集阳性菌落。将阳性菌液点种在滤纸上,在液氮中反复冻融2次,然后浸泡在Z缓冲液-β巯基乙醇-X-Gal混合液中室温温育8h。对筛选出的显色阳性菌液进行PCR验证。选取22个PCR阳性菌液提取酵母质粒,将22个质粒再转入感受态细胞E.coli,BL-21,对阳性菌落提取质粒,进行回交试验,对验证阳性的菌落对应的质粒进行测序。结果成功构建了pGBKT7-CT813诱饵质粒,该质粒的表达产物对AH109和Y187均无自激活和毒性作用。将回交试验筛选的阳性菌落对应的质粒进行测序,对测序结果做BLAST检索分析,确定筛选出与pGBKT7-CT813特异性相互作用的基因可能编码的蛋白是：半乳糖凝集素-1（LGALS1）、环腺苷酸应答原件结合蛋白3（CREB3）、核糖体核糖体蛋白L10a（RPL10a）和微管蛋白37E-16（RP1-37E16）。结论筛选出的4种蛋白可能与沙眼衣原体的致病机制相关,但仍需要进一步验证。pGBKT7-CT813编码产物与多种蛋白有相互作用,为进一步研究其生物学功能打下了基础。     

乙型肝炎病毒前S2基因酵母表达载体的构建及表达

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白的功能。方法：以质粒pCP10 (含有HBV ayw亚型全长序列)为模板，多聚酶链反应（PCR）扩增HBV前S2基因，克隆到pGEM-T载休整 ，测序鉴定、酶切后回收，与酵母表达质粒pGBKT7连接。将重组载体转化酵母细胞AH109，提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HBV前S2基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示HBV前S2蛋白在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，分子量24kD左右。结论：HBV前S2蛋白在酵母细胞中表达成功。     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒NS4B结合蛋白基因的筛选

目的应用酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞cDNA文库中与HCV包膜糖蛋白NS4B相互作用的结合蛋白的编码基因。方法扩增人胰腺细胞cDNA文库进行纯化鉴定,并将文库质粒转化酵母菌株Y187。诱饵质粒pGBKT7-NS4B转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基（SD/-Trp）上筛选阳性菌落。应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基（SD/-Trp/-Leu/-H is/-Ade）和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序。测序结果进行序列比对。结果成功构建人胰腺cDNA文库以及pGBKT7-HCV NS4B重组质粒,筛选出7种与HCV NS4B蛋白相结合的蛋白基因。结论筛选出的与HCV NS4B蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关。     

酵母双杂交筛选与CVB3 VP3相互作用的人心脏蛋白

目的 从人心脏cDNA文库中筛选与B3型柯萨奇病毒(coxsackievirus group B type 3,CVB3)结构蛋白VP3相互作用的蛋白,为进一步研究CVB3分子致病机制提供新的线索。方法 构建酵母双杂交重组质粒(pGBKT7-VP3),转化至感受态酵母菌AH109,检测BD-cMyc-VP3融合蛋白自激活,应用酵母双杂交筛选与CVB3 VP3相互作用的人心脏蛋白。对阳性候选克隆进行测序和同源性比对分析;α-半乳糖苷酶活性定量分析VP3与各阳性蛋白之间相互作用的强弱。结果 诱饵质粒pGBKT7-VP3构建成功,检测到BD-cMyc-VP3融合蛋白在AH109中表达,且诱饵蛋白VP3在酵母中不存在自激活,从人心脏cDNA文库中筛选到10个与CVB3 VP3相互作用的蛋白:真核翻译起始因子4A2、羟酰辅酶A脱氢酶三官能蛋白转录变体3、肌钙蛋白I3型、平滑肌蛋白3、线粒体乙醛脱氢酶2等。结论 本研究成功应用酵母双杂交技术筛选出与CVB3 VP3相互作用的10个蛋白。为研究CVB3引起心肌炎和心肌疾病的分子致病机制提供了一些新的线索。     

C35基因诱饵表达载体的构建及活性检测

目的C35是一种新型的乳腺癌肿瘤标志基因,在乳腺癌细胞中存在普遍性高表达,可作为乳腺癌早期诊断的标志分子。为了进一步揭示C35基因在乳腺癌的发生和发展中对癌细胞的调控和信号转导机制,本研究拟构建C35基因的酵母双杂交诱饵表达载体,并进行自激活活性和诱饵蛋白毒性检测。方法采用RT-PCR自乳腺癌T47D细胞中克隆C35表达序列,合成3种C35基因片段,连接入诱饵表达载体pGBKT7,采用选择性培养皿和β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)分析检测重组质粒的自激活活性和细胞毒性。结果3种诱饵表达载体经鉴定全部克隆成功,其中C35全长基因的表达产物对酵母细胞具有生长抑制作用,两种截短体C35 1-153和C35 154-348不具有自激活活性和细胞毒性,无需3-AT抑制。结论C35全长基因的诱饵表达载体可能具有抑制酵母细胞自身蛋白表达系统的作用,两种截短体重组载体可应用于乳腺癌T47D cDNA文库双杂交筛选。     

细粒棘球蚴MAPKK样激酶及其下游成员ERK和P38酵母双杂交载体的构建与自激活鉴定

目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)丝裂原活化蛋白激酶激酶(EgMKK1)及其下游成员ERK、P38酵母双杂交载体,并检测融合蛋白对酵母菌生长的毒性作用及自激活活性。方法采集绵羊肝脏感染的Eg原头蚴,生理盐水冲洗5次,TRIzol法提取原头蚴总RNA,取1μg RNA反转录cDNA。以cDNA为模板,PCR分别扩增EgMKK1、EgERK和EgP38基因片段,分别经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,酶切片段连接至酵母双杂交载体pGADT7或pGBKT7,经酶切及测序鉴定正确后,应用PEG/LiAc法将重组载体转化入感受态酵母菌株Y2HGold,利用固体培养基筛选,检测融合蛋白对酵母菌株生长的毒性作用及自激活活性。结果经PCR扩增,分别获得目的基因EgMKK1、EgERK和EgP38。构建的重组酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK及pGBKT7-EgP38经双酶切,分别得到1 017bp、1 086bp和1 107bp目的基因片段,大小与预测值相符。重组酵母双杂交载体转化Y2HGold酵母菌在SD/-Trp平板上形成直径为1.5~2.0mm的菌落,与原始载体pGADT7或pGBKT7转化酵母菌菌落大小一致;重组酵母双杂交载体转化酵母菌在SD/-Trp和SD/-Leu平板均有直径约2mm白色菌落生长,而SDO/X/A和DDO/X/A固体培养基平板上无蓝色菌落生长。结论成功构建了酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK和pGBKT7-EgP38,其表达蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性和自激活作用,为进一步研究EgMKK1与其下游成员EgERK、EgP38之间的相互作用奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞中HCV 1b NS3结合蛋白基因

目的:应用酵母双杂交技术筛选人胰腺cDNA文库中与HCV 1b亚型非结构蛋白NS3相互作用的结合蛋白的编码基因, 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定实验基础.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定, 纯化后的文库质粒转化酵母菌Y187; 构建诱饵质粒PGBKT7-NS3并转化酵母菌AH109, 在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合, 在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选, 提取蓝色酵母菌落质粒, 电转化大肠埃希菌DH5α后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.结果:成功构建人胰腺cDNA文库和pGBKT7-NS3重组质粒; 将pGBKT7-NS3质粒转化AH109酵母菌株后, 并从人胰腺cDNA文库中筛选出11种与HCV NS3蛋白相结合的蛋白基因.结论:筛选出的与HCV NS3蛋白结合的胰腺蛋白基因中, 部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关.