抗基因及反义寡脱氧核苷酸抑制N—ras表达及对肝癌细胞增殖的影响

目的 探讨抗基因及反义寡核苷酸对肝癌的潜在治疗作用。方法 合成了针对Ｎ－ｒａｓ转录，翻译起始区的１２ｍｅｒ硫代磷酸抗基因寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＯＤＮａｎ），１９ｍｅｒ硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＯＤＮＡａｓ）采用ＥＬＩＳＡ，斑点杂交法分别检测寡脱氧核苷酸处理的肝癌ＢＥＬ７４０２细胞内ｐ２１，Ｎ－ｒａｓｍＲＮＡ水平，观察了ＢＥＬ７４０２肝癌细胞生长的影响。结果 处理细胞内Ｎ－ｒａｓｍＲＮＡ水平低于对照     

靶向反义硫代寡脱氧核苷酸抗病毒疗效的实验研究

目的 探讨靶向反义硫代寡脱氧核苷酸（asODN)在乙型肝炎（HBV）病毒转基因小鼠体内抗病毒疗效。方法 设计合成针对HBV pre-C/C基因的反义硫代寡脱氧核苷酸：5'-CATGCCCCAAAGCCAC-3'，并以半乳糖－多聚赖氨酸（Gal15-PLL)作肝靶向载体。将12只血清HBsAg,HBV DNA阳性的转基因小鼠等分为Gal15-PLL-asODN治疗组及生理盐水对照组。靶向反义硫代寡脱氧核苷酸以每天每克体重15μg剂量，尾静脉注射给药，共12d，对照组用同样体积生理盐水同样方法给药。结果 注射Gal15-PLL-asODN 6d后，血清HBsAg已有下降（P＜0．05）；12d时显著下降（P＜0．01），且血清HBV DNA转阴率为66．7％（4／6），肝组织免疫组织化学HBsAg,HBcAg阳性肝细胞数较对照组明显下降（P＜0．05）；而生理盐水对照组无明显变化。结论 靶向反义硫代寡脱氧核苷酸在转基因小鼠体内能抑制HBV复制与抗原表达。     

碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸抑制胰岛素诱导动脉平滑肌细胞增殖

为研究胰岛素诱导的动脉平滑肌细胞增殖作用和碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷对培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠主动脉平滑肌细胞生长的影响。采用胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸处理培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠主动脉平滑肌细胞,Ｎｏｒｔｈｅｎｂｌｏｔ检测碱性成纤维细胞生长因子基因ｍＲＮＡ表达,并测定氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入和细胞计数。结果发现胰岛素能明显诱导平滑肌细胞碱性成纤维细胞生长因子ｍＲＮＡ表达和增殖,且呈浓度依赖性。胰岛素浓度由０．００１ｍｇ／Ｌ增加到１．０ｍｇ／Ｌ,平滑肌细胞增殖率由１０％增加到５３％。碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸（５μｍｏｌ／Ｌ）能明显抑制胰岛素诱导的平滑肌细胞碱性成纤维细胞生长因子ｍＲＮＡ表达和增殖,氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入被抑制４１．１％（与对照组比较,Ｐ＜０．０１）,细胞计数被抑制３０．２％（与对照组比较,Ｐ＜０．０１）。提示胰岛素可通过诱导平滑肌细胞碱性成纤维细胞生长因子的表达而促进动脉平滑肌细胞增殖,碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸能有效抑制胰岛素诱导的平滑肌细胞的ＤＮＡ合成及其增殖。     

碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸抑制胰岛素诱导动 …

为研究胰岛素诱导的动脉平滑肌细胞增殖作用和碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷对培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠主动脉平滑肌细胞生长的影响。采用胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子反义寡脱氧核苷酸处理培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠主动脉平滑肌细胞,Ｎｏｒｔｈｅｎｂｌｏｔ检测碱性成纤维细胞生长因子基因ｍＲＮＡ表达,并测定氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入和细胞计数。结果发现胰岛素能明显诱导平滑肌细胞碱性成纤维细胞生长因子ｍＲＮＡ表     

反义寡脱氧核苷酸对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

为了解丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因调控方式、探索反义寡脱氧核苷酸对丙型肝炎病毒基因表达的体外抑制作用。构建了由ＨＣＶ５′非翻译区（５′ＵＴＲ）翻译启动报道基因－虫荧光素酶（ｌｕｃ）基因的真核表达载体；人工合成了针对ＨＣＶ５′ＵＴＲ及非结构蛋白５（ＮＳ５）区的反义寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）。借助脂质体将ＯＤＮ分别与所构建的载体一同转染人癌细胞系，短期培养后制备细胞提取液，以荧光发光法检测ｌｕｃ基因的表达．     

抗基因及反义寡脱氧核苷酸抑制N－ras表达及对肝癌细胞增殖的影响

探讨抗基因及反义寡核苷酸对肝癌的潜在治疗作用。方法合成了针对Ｎ－ｒａｓ转录、翻译起始区的１２ｍｅｒ硫代磷酸抗基因寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＯＤＨａｎ）、１９ｍｅｒ硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＯＤＮＡａｓ）。采用ＥＬＩＳＡ、斑点杂交法分别检测了寡脱氧核苷酸处理的肝癌ＢＥＬ７４０２细胞内ｐ２１、Ｎ－ｒａｓｍＲＮＡ水平，观察了对ＢＥＬ７４０２肝癌细胞生长的影响。结果处理细胞内Ｎ－ｒａｓｍＲＮＡ水平低于对照组，以Ｓ－ＯＤＮａｎ组更明显。两者对ｐ２１合成的抑制率达８０％，６７．５％。两者的细胞生长抑制率达８８％、７７％，并呈剂量依赖性。两者处理的细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入降低为对照组的２１．８％、３０．５５％；ＡＦＰ水平明显低于对照组（Ｐ直＜０．００１）。结论Ｓ－ＯＤＮａｎ．Ｓ－ＤＤＮａｓ能有效抑制Ｎ－ｒａｓ表达及相关肝癌细胞增殖；也进一步说明Ｎ－ｒａｓ在肝癌发生中起作重要作用。     

反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌抑制作用的研究

目的研究反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌生长的抑制作用,探讨其潜在的抗结核作用。方法在7H9培养基中接种5×10^5耻垢分枝杆菌MC^2 155,同时加入20μmol／L针对结核分枝杆菌中必须基因RV3806c在耻垢分枝杆菌中的同源基因MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸。以耻垢分枝杆菌MC^2 155单独培养作为对照。观察和绘制细菌生长曲线;测定细胞膜MSMEG_6401编码的磷酸核糖转移酶的生物活性;应用高压气相色谱测定耻垢分枝杆菌细胞壁中糖的含量。结果与对照组相比,试验组耻垢分枝杆菌增殖速度平均降低0.45 OD（P〈0.01）;CFU计数平均延缓0．67Log;在应用等量的膜蛋白的情况下,实验组磷酸核糖转移酶的生物活性降低约40％,试验组和对照组细菌反应细胞壁的糖含量的指标甘露糖-半乳糖,阿拉伯糖比率没有明显差异（2组实验组分别为63％和69．4％;2组对照组分别为66．6％和69．1％）。结论针对MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌的增殖有一定程度的抑制作用,推测反义寡脱氧核苷酸技术有一定抗结核价值;结核分枝杆菌的RV3806c基因或者是其编码产物可能是一个好的抗结核药物作用靶位。     

半乳糖糖基转移酶反义核酸对卵巢癌细胞凋亡的诱导作用及机理探讨

采用脂质体介导的基因转染方法将人工合成α1,4半乳糖糖基转移酶(α1,4 Gal-T)基因反义寡脱氧核苷酸转入卵巢癌细胞株(COC1)中.用流式细胞仪检测其红细胞三糖基神经酰胺(Gb3)、Bcl-2和Bax蛋白表达及COC1细胞凋亡率.结果与对照组及无义核酸组比较,反义核酸组COC1细胞Gb3、Bcl-2表达下降、Bax蛋白表达升高,COC1细胞凋亡率升高(P<0.05、<0.01).提示α1,4 Gal-T基因反义核酸能够诱导COC1凋亡,其机理可能与其降低Bcl-2蛋白表达,升高Bax蛋白表达有关.     

C-sis反义寡脱氧核苷酸抑制兔主动脉平滑肌细胞增殖的时效关系

为观察局部处理C-sis反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞增殖及新生内膜肥厚的抑制作用、球囊导管损伤60只新西兰白兔胸主动脉后。经导管局部处理每只兔1mg（2mL）C-sis反义或正义寡脱氧核苷酸或2mL生理盐水,于损伤后第3、7、14天和第28天，用免疫组织化学方法结合图象分析，评价损伤动脉内膜平滑肌细胞增殖及新生内膜改变。结果发现．C-sis反义寡脱氧核苷酸明显抑制内膜平滑肌细胞增殖，最高抑制作用出现于损伤后第3天；抑制百分率达69．8％，第7、14天和第28天的抑制率依次降低，分别为59％、51.9％和47.8％；而新生内膜面积的抑制百分率分别是48．9％、77．8％、72．6％和70．8％，与生理盐水处理组相比，平滑肌细胞数及新生内膜面积均有明显降低。研究结果表明，局部处理C-sis反义寡脱氧核苷酸，通过反义途径，可明显抑制球囊损伤主动脉内膜平滑肌细胞增殖，其抑制作用随时间而降低，同时，对新生内膜面积肥厚的最大抑制出现于第7天，随后降低，提示局部处理C-sis反义寡脱氧核苷醚，有可能降低再狭窄的发生。     

C-sis反义寡脱氧核苷酸抑制兔主动脉平滑肌细胞增殖的时效关系

为观察局部处理Ｃ－ｓｉｓ反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞增殖及新生内膜肥厚的抑制作用，球囊导管损伤６０只新西兰白兔胸主动脉后，经导管局部处理每只兔１ｍｇ（２ｍＬ）Ｃ－ｓｉｓ反义或正义寡脱氧核苷酸或２ｍＬ生理盐水，于损伤后第３、７、１４天和第２８天，用免疫组织化学方法结合图象分析，评价损伤动脉内膜平滑肌细胞增殖及新生内膜改变。结果发现，Ｃ－ｓｉｓ反义寡脱氧核苷酸明显抑制内膜平滑肌细胞增殖，最高抑制作用出     

缬沙坦对不同时期高血压大鼠血浆和心肌肾素-血管紧张素系统及左心室重塑的影响

为了了解反义ｃ－ｍｙｃ基因在平滑肌细胞中持续、稳定表达对细胞凋亡的影响,将分别载有ｃ－ｍｙｃ第１、第２和第３外显子反义片段的三种重组逆转录现毒表达载体ａＭ１、ａＭ２、ａＭ３,导入体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞,并于持续筛选１个月后进行稳定表达检测。结果表明,ａＭ３的导入和稳定表达使平滑肌的细胞的凋亡率达到对组织３．６倍,并拦有明显的细胞体积缩小,而ａＭ１、ａＭ２的凋亡诱导作用则明显弱于ａＭ３。另外     

反义c-myc RNA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

构建一个含1．53kb反义c－myc片段的逆转录病毒载体PAS-c-myc，将其通过Lipofectin导入PA317细胞并经G418筛选获得分泌病毒上清液的阳性克隆。病毒上清波感染血管平滑肌细胞（SMC）经G418筛选获得抗性克区。DNA印迹杂交证实了反义c-myc片段整合于SMC基因组中。RNA印迹杂交证实了反义c－mycRNA在SMC中得到了表达，且显著降低了SMC中c－mycmRNA的水平。蛋白印迹杂交证实了反义c－mycRNA抑制了c－myc蛋白的翻译。提示：c－myc基因表达在SMC增殖中起重要作用。     

c—myc反义寡核苷酸对缺氧内皮细胞条件培养液刺激的肺血？…

探讨ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸对缺氧内皮细胞条件培养液刺激的肺血管平滑肌细胞的增殖的影响。方法 制备ＨＥＣＣＭ，用其刺激肺动脉ＳＭＣ后，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析ｃ－ｍｙｃ基因表达，＾３Ｈ－胸腺嘧啶核苷掺入试验及细胞生长计数分析ＳＭＣ增殖情况。     

Inhibitory effects of antisense oligodeoxynucleotides targeting c-myc mRNA on smooth muscle cell proliferation and migration.

Smooth muscle cell (SMC) proliferation and migration play pivotal roles in restenosis following angioplasty. c-myc is an immediate early response gene induced by various mitogens, and several lines of evidence derived from experiments using transformed or hematopoietic cell lines, or transgenic mice, suggest its protein product plays a role in numerous signaling transduction pathways, including those modulating cell division. We therefore reasoned that a strategy employing oligodeoxynucleotides (ODNs) complementary to c-myc mRNA (antisense ODNs) might be potent inhibitors of SMC proliferation and, perhaps, of SMC migration. To evaluate this concept, we tested several antisense ODNs targeted to c-myc mRNA (15- or 18-mer ODNs complementary to different c-myc mRNA sequences) by introducing them individually into the medium of cultured rat aortic SMCs. Phosphoroamidate-modified ODNs were employed to retard degradation. Antisense ODNs inhibited, in a concentration-dependent manner, SMC proliferation and SMC migration. Maximal inhibitory effect was 50% for proliferation and > 90% for migration. These effects were associated with decreased SMC expression of c-myc-encoded protein by Western immunoblotting and immunocytochemical staining. ODNs with the same nucleotides but a scrambled sequence caused no effect. These results indicate that the c-myc gene product is involved in the signal transduction pathways mediating SMC proliferation and migration in the in vitro model we employed. The results also suggest a potential role of antisense strategies designed to inhibit c-myc expression for the prevention of coronary restenosis.     

腹主动脉瘤血管平滑肌细胞凋亡和自噬研究

目的探讨血管平滑肌细胞(SMC)凋亡和自噬与腹主动脉瘤(AAA)发病的关系。方法采用原位末端DNA标记(TUNEL)技术观察AAA和人正常主动脉组织中SMC凋亡的情况,并用免疫组织化学分析其中LC3的蛋白表达。提取AAA和正常主动脉组织RNA,采用RT-PCR方法检测其中与自噬相关的基因Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34的表达。结果 AAA组织中凋亡的SMC明显高于正常主动脉组织(P0.05);LC3蛋白在AAA中的表达高于正常主动脉组织(P0.05);AAA中Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34表达水平明显高于正常主动脉组织(P0.05)。结论 SMC凋亡和自噬在AAA的发病中起重要作用。     

动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞凋亡及凋亡相关基因的表达

为了揭示动脉粥样硬化发生发展过程中血管平滑肌细胞增殖与凋亡的关系及其调节机制，采用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色法对家兔动脉粥样硬化斑块组织中平滑肌细胞的凋亡情况进行原位检测，并对原癌基因bcl-2、c-myc和P53在斑块组织中的表达活性进行North－ernblot分析。结果发现，在动脉粥样硬化斑块组织中有许多TUNEL染色阳性的平滑肌细胞，提示斑块组织中有平滑肌细胞凋亡发生：其斑块组织的DNA电泳图谱呈梯形状．符合细胞凋亡的特征性改变。Northern印迹分析表明，在动脉粥样硬化斑块组织中，原癌基因bck-2和P53的表达较正常组织增强，C－myc表达减低。提示这些基因的表达对动脉粥样硬化斑块组织中的平滑肌细胞凋亡起着重要的调节作用。     

腺病毒介导RA538及反义c-myc在不同细胞系中作用及其机制

目的比较重组RA538,反义c-myc及LacZ腺病毒(adenovirus,AV)对不同靶细胞的转染效率、生物学特性并探讨其作用的分子机制.方法以人胃癌细胞(SGC7901)、食管癌细胞(EC109)及人胚肺二倍体细胞(2BS)系为靶细胞,采用LacZ基因转染X-gal染色、形态学观察、MTT,RT-PCR等方法,研究重组RA538,反义c-myc及LacZ AV对上述细胞的转染效率,生物学作用及其分子机制.结果 AV-LacZ进行重组腺病毒转导效率检测显示其对SGC7901,2BS细胞具有很高的转导效率,对EC109细胞转导效率较低.AV-RA538及AV-ASc-myc对SGC7901细胞能产生明显的生长抑制效应并诱导凋亡,其生长抑制率分别为76.3%和44.1%.AV-RA538及AV-ASc-myc对SGC7901细胞内源性c-myc,bcl-2基因的表达具有抑制作用.AV-RA538及AV-ASc-myc对EC109细胞及2BS细胞无明显的生长抑制及凋亡诱导作用,AV-RA538对EC109及2BS细胞中内源性c-myc,bcl-2基因的表达无调节作用.结论 AV载体转导效率很高,能实现目的基因在转导细胞中的高水平表达,但对不同靶细胞的转染效率存在差别.AV-RA538,AV-ASc-myc对SGC7901的生长抑制及凋亡诱导作用可能是通过AV的高效转导及抑制c-myc,bcl-2的表达而实现的.AV-RA538,AV-ASc-myc对食管癌、2BS细胞系无类似作用可能与其对上述细胞的转导的作用及内源性基因表达的作用有关.     

Possible mechanism for hepatitis B virus X gene to induce apoptosis of hepatocytes

AIM: To investigate the possible mechanism for HBV X gene to induce apoptosis of hepatocyte HL-7702 cells. METHODS: HBV X gene eukaryon expression vector pcDNA3-X was established and transfected into HL-7702 cells by Iipid-mediated transfection, including transient and stable transfection. Positive clones were screened by incubating in the selective medium with 600 μg/mL G418 and named HL-7702/HBV-encoded X protein (HBx) cells. The expressions of Fas/FasL, Bax/Bcl-2, and c-myc mRNA were measured by semi-quantitative RT-PCR in HL-7702/HBx and control group, respectively. RESULTS: RT-PCR analysis confirmed that HBV X gene was transfected into HL-7702 cells successfully. By semi-quantitative RT-PCR analysis, Bax and c-myc mRNA levels in HL-7702/HBx cells of transient transfection were significantly higher than those in control, FasL and c-myc mRNA levels in HL-7702/HBx cells of stable transfection were significantly higher than those in control, whereas the Bcl-2 mRNA levels in HL-7702/HBx cells of transient and stable transfection were significantly lower than those in control. CONCLUSION: HBV X gene may promote the apoptosis of hepatocytes by regulating the expressions of Fas/FasL, Bax/Bcl-2, and c-myc gene in a dose-dependent manner.