消化道肿瘤组织中P-gp、凋亡抑制蛋白表达与体外化疗药敏性的关系及其意义

背景与目的:p-糖蛋白(P-gp)介导的经典耐药途径和细胞凋亡抑制是肿瘤多药耐药(MDR)研究最多的两种机制,肿瘤细胞多种MDR相关基因/蛋白共同表达、相互作用而出现多态性耐药.本研究通过分析肿瘤P-gP和凋亡抑制蛋白p53、Survivin、bcl-2表达与化疗药敏性的关系,探讨消化道肿瘤组织MDR相关因子表达能否反映肿瘤的化疗耐药性.方法:84例胃癌、大肠癌标本进行MTT法体外化疗药物敏感性实验,免疫组化染色检测组织中P-gp、p53、Survivin、bcl-2的表达,分析4种多药耐药相关因子表达与9种药物对肿瘤细胞抑制率的关系.结果:肿瘤组织中P-gp、p53、Survivin、bcl-2表达率分别为96.4%、64.3%、89.3%、60.7%;P-gp与bcl-2表达、Survivin与bcl-2表达具有正相关性(r=0.5072,r=0.3027,P<0.05).在肿瘤组织耐药因子表达程度与药物对肿瘤细胞抑制率的关系中,P-gp强表达组PIN、OXA、DDP对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(P<0.05);p53强表达与PTX、DDP对肿瘤细胞的抑制率明显降低有关(P<0.05);Survivin强表达时,VCR、DDP对肿瘤细胞的抑制率明显降低(P<0.05).但OXA对肿瘤细胞的抑制率明显增加(P<0.01);bcl-2强表达时,5-FU、VCR、EADM、OXA对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(P<0.05).结论:消化道肿瘤P-gp、p53、Survivin、bcl-2表达程度仅与其对部分化疗药物的耐药性有关.评价消化道肿瘤组织某种耐药因子表达与化疗药物耐药性的关系必须考虑多种因素调节的影响.     

TRAIL联合阿霉素和IFN-γ对人骨肉瘤细胞凋亡的影响

 目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合阿霉素和IFN-γ应用对人骨肉瘤细胞生长抑制和诱导凋亡的作用。 方法 用MTT测定TRAIL、阿霉素、IFN-γ单独或联合应用对人骨肉瘤细胞MG-63的体外增殖抑制作用,并检测各组细胞凋亡 率。 结果 TRAIL、阿霉素、IFN-γ三者联合作用于MG-63细胞后,能显著增强对MG-63的杀伤、抑制增殖及诱导凋亡作用,明显高于单独应用TRAIL组或阿霉素组(P<0.05)。 结论 TRAIL、阿霉素、IFN-γ三者联用能显著提高骨肉瘤细胞MG-63生长抑制和诱导凋亡作用。     

热化疗对ARH-77细胞株增殖抑制、凋亡及Bcl-2表达影响的研究

[目的]观察热疗联合阿霉素对人多发性骨髓瘤细胞株ARH-77的体外增殖抑制、凋亡及Bcl-2表达的影响.[方法]采用MTT法确定阿霉素的工作浓度,以该浓度进行化疗或与热疗的联合,选择温度40℃、41℃及42℃,作用于ARH-77细胞.采用绘制肿瘤细胞生长曲线、MTT法检测对肿瘤细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡及Bcl-2表达.[结果]阿霉素IC50为8.16 μg/ml,以此为实验的工作浓度.单纯热疗组60min对ARH-77细胞有抑制作用(P＜0.01),并随温度增高而增强.单纯阿霉素化疗组对ARH-77细胞也有抑制作用.各热化疗组对ARH-77均有明显的抑制作用(P＜0.01).热疗组、化疗组及热化疗组的细胞凋亡率均较对照组显著升高,各组之间差异有统计学意义(P＜0.01);Bcl-2蛋白表达下降,各组之间也有显著性差异(P＜0.01).[结论]热疗联合阿霉素能增强对ARH-77细胞的体外抑制作用,提高肿瘤细胞的凋亡率,下调Bcl-2蛋白的表达,为热化疗的临床应用提供实验室依据.     

华蟾素和顺铂对骨肉瘤MG-63细胞联合杀伤作用的研究

目的：探讨比较华蟾素（ cinobufagin ）协同顺铂（ cisplatin ）对人骨肉瘤细胞株 MG-63的杀伤作用。方法体外培养骨肉瘤细胞株 MG-63细胞,取对数生长期细胞进行实验;采用 MTT 比色法测定MG-63细胞的生长抑制作用并计算细胞抑制率;流式细胞仪检测骨肉瘤细胞的凋亡率和细胞周期,观察细胞凋亡率的变化情况和药物对细胞周期的抑制作用;原位末端标记法（ TUNEL ）观察骨肉瘤细胞的凋亡情况并检测细胞凋亡率;相差显微镜观察骨肉瘤细胞生长状况及形态学上的改变。结果华蟾素和顺铂均对骨肉瘤细胞有生长抑制作用,华蟾素组、顺铂组及华蟾素＋顺铂组在药物浓度不同时对骨肉瘤细胞的生长抑制作用各不相同,在药物浓度低于80μg/ml时,各实验组药物对细胞的生长抑制作用随药物浓度的增加而上升;当药物浓度达到80μg/ml时,华蟾素组和顺铂组药物对骨肉瘤细胞的生长抑制作用不再增加,但华蟾素＋顺铂组药物对细胞的生长抑制作用在药物浓度达到160μg/ml时,抑制作用仍强于其浓度为80μg/ml时。各实验组在药物浓度相同时华蟾素＋顺铂对骨肉瘤细胞的生长抑制作用明显强于单独应用华蟾素或者顺铂。结论华蟾素＋顺铂对骨肉瘤 MG-63细胞的联合杀伤作用明显强于单独应用顺铂或者华蟾素;在抑制骨肉瘤 MG-63细胞生长方面,华蟾素协同顺铂对细胞的杀伤作用效果显著,并且具有时间和浓度依赖性。     

低分子量肝素对骨肉瘤细胞增殖和survivin表达的影响

[目的]研究低分子量肝素对骨肉瘤细胞增殖和survivin表达的影响。[方法]体外培养骨肉瘤细胞系MG-63,应用MTT法检测不同浓度低分子量肝素不同时间段对骨肉瘤细胞系MG-63生长的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,免疫组化和RT-PCR法分析低分子量肝素对骨肉瘤细胞survivin基因表达的影响。[结果]低分子量肝素可抑制骨肉瘤细胞系MG-63生长,且随着低分子量肝素剂量的增加,MG-63细胞凋亡率明显增加。免疫组化和RT-PCR显示,骨肉瘤细胞系MG-63中survivin的表达较用药前明显下降。[结论]低分子量肝素对骨肉瘤细胞系MG-63有明显的抑制作用,其作用可能通过抑制抗凋亡基因survivin的表达,促进肿瘤细胞的凋亡而实现。     

人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX的建立及多药耐药机制研究

目的 建立人骨肉瘤细胞多药耐药亚系,探讨骨肉瘤细胞多药耐药的发生机制.方法 采用紫杉醇大剂量间断冲击培养法,诱导建立紫杉醇耐药骨肉瘤细胞系(MG-63/PTX),并运用MTT法检测6种药物敏感性变化及细胞生长规律变化,流式细胞仪分析亲本细胞系和耐药细胞系的细胞膜表面P-gp蛋白表达率、罗丹明123排出情况,RT-PCR检测细胞内耐药基因的变化,免疫细胞化学法检测细胞内P-gp蛋白的表达,Westernblotting法检测细胞内P-gp蛋白的表达.结果 历时12个月建成人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX,能在含PTX1μg/mL的培养基中稳定生长并传代,其对PTX的耐药指数为69.8,并与卡铂、顺铂、表柔比星、甲氨蝶呤、阿霉素等多种化疗药物存在不同程度的交叉耐药性;罗丹明123排出实验显示MG-63/PTX内罗丹明含量明显低于亲本细胞;RT-PCR结果显示在MG-63/PTX细胞系中存在MDR1、MRP1、LRP、ABCG2基因的表达,而在MG-63细胞系中无MDR1基因的表达.免疫细胞化学、流式细胞仪及Western blotting实验均显示在MG-63/PTX中存在P-gp的表达.结论 MDR1/ P-gp在多药耐药的特性上起着至关重要的作用,而且骨肉瘤多药耐药细胞亚系为进一步研究骨肉瘤耐药特征及逆转方法打下基础.     

IER3在耐阿霉素的骨肉瘤细胞中的表达及意义

目的:构建骨肉瘤的耐药细胞模型,探讨IER3基因在骨肉瘤耐药中的表达情况及意义。方法:采用递增药物浓度冲击诱导法构建耐阿霉素人骨肉瘤细胞模型(MG-63/ADM),应用RT-PCR和Western blot检测IER3在敏感细胞和耐药细胞中的基因和蛋白水平表达情况。结果:经过6个月的诱导,建立了对于不同阿霉素浓度耐药的细胞模型分别标记为MG-63/ADM0.1、MG-63/ADM0.4、MG-63/ADM1.0、MG-63/ADM4.0,细胞形态在光镜下明显改变,MG-63/ADM细胞中IER3的表达量明显高于MG-63。结论:药物冲击诱导可以使骨肉瘤细胞产生对于化疗药物的耐药性,为研究骨肉瘤耐药性及其逆转提供实验基础,IER3可能参与了骨肉瘤对于阿霉素的耐药机制。     

反义Snail转录因子诱导MG-63细胞凋亡增加顺铂化疗敏感性的研究

[目的]探讨反义Snail转录因子对人骨肉瘤细胞株MG-63顺铂化疗敏感性的影响。[方法]用脂质体转染法将高转移性骨肉瘤细胞株MG-63分别转染反义Snail质粒（pGenesil-snailAS）和空载体质粒（pGenesil）。MG-63组（对照组）、MG-63/pGenesil组和MG-63/pGenesil-snailAS组细胞分别与浓度为0、0.5、1、5、10、15、20μg/ml顺铂作用72h。MTT法测定各组细胞的存活率并计算IC50,FCM检测细胞凋亡,Westernblot检测各组细胞Snail蛋白表达。[结果]细胞稳定转染pGenesil-snailAS后,细胞内Snail蛋白表达明显被抑制。MG-63、MG-63/pGenesil和MG-63/pGenesil-snailAS组细胞的顺铂IC50分别为14.0±1.8、12.6±1.6和2.8±0.5μg/ml,MG-63/pGenesil-snailAS组细胞对顺铂作用的敏感性增加了5倍。顺铂对MG-63/pGenesil-snailAS组细胞所诱导的凋亡比MG-63组和MG-63/pGenesil组显著。[结论]反义Snail转录因子能诱导人骨肉瘤细胞株MG-63凋亡并抑制其生长,增加其对顺铂化疗敏感性。     

极低频电磁场对骨肉瘤HOS细胞的体外生物效应

目的:观察极低频电磁场(extremely low frequency electromagnetic field,ELF-EMF)对骨肉瘤HOS细胞的增殖、凋亡、克隆形成及侵袭能力的作用,筛选出对骨肉瘤HOS细胞抑制作用最佳的极低频电磁场参数。方法:体外培养骨肉瘤HOS细胞,分别固定电磁场频率为1Hz、5Hz、10Hz、15Hz、20Hz、30Hz、40Hz、50Hz,选择不同电磁场强度0.1mT、1mT、5mT、10mT、15mT,分组进行辐照,并设立对照组。采用CCK-8法检测细胞增殖情况并计算抑制率。经统计学分析后,筛选出2组对HOS细胞抑制作用较强的ELF-EMF参数,再通过检测其细胞凋亡、克隆形成及侵袭能力进行验证。结果:各组OD值经统计学分析,显示(1Hz,0.1mT)实验组细胞增殖抑制率最高,(40Hz,10mT)实验组次之（P<0.05）。流式细胞术结果表明,这2组的HOS细胞凋亡比率均高于对照组（P<0.05）。细胞克隆实验中,对照组克隆率最大,(1Hz,0.1mT)实验组次之,而(40Hz,10mT)实验组克隆率最小（P<0.05）。侵袭实验中,(40Hz,10mT)实验组穿过小室基底膜的细胞数量明显低于其他两组（P<0.05）。结论:(40Hz,10mT)组ELF-EMF参数对骨肉瘤HOS细胞有更明显抑制增殖作用,促使细胞凋亡,降低细胞的克隆能力,并减低其侵袭能力。     

吉西他滨抑制骨肉瘤细胞系MG-63增殖和诱导凋亡的实验研究

目的研究吉西他滨对骨肉瘤细胞系MG-63的增殖抑制和凋亡诱导作用。方法利用光镜检测吉西他滨作用后MG-63的形态学变化;MTT法检测吉西他滨对MG-63的增殖抑制;流式细胞仪AnnexinV-FITC法检测细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder。结果吉西他滨可明显地抑制MG-63细胞生长,各实验组24、48、72小时抑制率随时间的增加而增加,差异有统计学意义（P〈0.05）,0.1 mg/L及以上浓度的吉西他滨对MG-63骨肉瘤细胞的抑制率可达50%,0.1-100 mg/L的吉西他滨对MG-63的抑制率相似。吉西他滨可诱导MG-63细胞凋亡,在不同浓度吉西他滨（0.1,1.0,10.0,100 mg/L）作用48小时后,MG-63的凋亡率差异无统计学意义（P〉0.05）。并且经琼脂糖凝胶电泳可以显示DNA ladder。结论吉西他滨对骨肉瘤细胞系MG-63具有增殖抑制作用,并且各实验组24、48、72小时抑制率随时间的增加而增加;吉西他滨对骨肉瘤细胞系MG-63具有诱导凋亡作用;0.1-100 mg/L吉西他滨对MG-63的增殖抑制和诱导凋亡作用相似。