体外诱导人羊膜上皮细胞分化为神经样细胞

目的探讨人羊膜上皮细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件。方法碱性成纤维细胞生长因子预诱导剂（bFGF）,化学诱导剂全反式维甲酸（ATRA）、丁酸羟基茴香醚（BHA）作为诱导剂,并以不含诱导剂的无血清的MEM培养基作为对照,密切观察分化过程中细胞形态的变化,诱导至6 h、12 h、24 h时,利用免疫细胞化学方法检测神经元特异性标志物的表达情况。结果诱导分化12 h后的ATRA组大部分细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,免疫细胞化学显示这些细胞表现为NSE染色阳性,而丁酸羟基茴香醚（BHA）组细胞形态没明显变化,两组都不表达神经胶质细胞标记物GFAP。结论 hAECs可以在体外诱导分化为神经元样细胞,全反式维甲（ATRA）诱导效果较丁酸羟基茴香醚（BHA）好。     

成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向神经细胞分化的可能性。方法利用Per-coil梯度分离及贴壁筛选法分离培养和扩增MSCs；利用bFGF、化学诱导剂DMSO和BHA联合诱导MSCs向神经元转化，观察分化过程中细胞形态的变化，利用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测神经元特异性标志物的表达情况。结果经Perecoll梯度分离及贴壁筛选法获得了纯度较高的人MSCs，诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态，并且分别从mRNA和蛋白水平上证明诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和NF，不表达神经胶质细胞标记物GFAP。结论人MSCs可以在体外诱导分化为神经元样细胞，这种潜能使其有可能成为神经系统疾病细胞移植治疗的种子细胞。     

川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞:最佳诱导剂量筛选

背景:目前用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导剂众多,但多数化学诱导剂具有毒性不适合用于人体.目的:观察中药川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找川芎嗪诱导分化的最佳浓度.方法:SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,1.25,1.50 g/L 3种剂量盐酸川芎嗪注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导.倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较3种剂量盐酸川芎嗪注射液诱导神经元样细胞抗原表达率.结果与结论:①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列.②第5代骨髓间充质干细胞(98.02±0.81)%CD44表达阳性,CD45表达阴性.③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,1.25 g/L浓度组细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高.提示川芎嗪可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,1.25 g/L为最适诱导剂量.     

人骨髓间质干细胞定向分化为神经元样细胞的实验

目的:体外定向诱导人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞并观察其传导功能。方法:实验于2003-06/2004-02在中南大学湘雅医院完成。采用淋巴细胞分离液(1.007g/L)梯度离心分离人骨髓间质干细胞,体外进行培养扩增,丁化羟基苯甲醚和二甲基亚砜诱导人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法鉴定神经元特异性标志物,神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白,突触素蛋白,胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白。结果:加入诱导剂3h后,大多数细胞转变为类似于神经元的形态,有长的突起,相互之间连接呈网状,并表达神经元特异性烯醇化酶,阳性率为(75.0±6.5)%、神经丝蛋白阳性率为(68.0±4.2)%及胶质纤维酸性蛋白阳性率为(25.0±6.4)%,但胶质纤维酸性蛋白表达明显较前两者弱(P<0.05)。神经元细胞胞体表达突触素蛋白,突起未见表达。结论:人骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞;神经元样细胞其突起不具备传导功能。     

GAP-43在骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中表达的实验研究

目的 观察生长相关蛋白-43(GAP-43)在体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经样细胞分化中的表达情况以探讨其在骨髓间充质干细胞定向分化过程中的作用.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,选取第3代细胞,经流式细胞仪检测细胞表面标志物进行鉴定,并分别应用化学诱导剂β巯基乙醇(BME)和脑源性神经生长因子(BDNF)诱导BMSCs分化,观察诱导后细胞的形态学变化,并应用免疫细胞化学方法对诱导后的细胞进行鉴定、分析生长相关蛋白43、神经巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF) 的表达情况.应用统计学方法比较两组细胞经诱导后2、4、6、8 h GAP-43免疫细胞化学染色阳性率.结果 第三代BMSCs经流式细胞仪检测CD90( )、CD71( )、CD29( ),CD45(-),经两种方法诱导BMSCs均可分化为神经样细胞,分化后细胞均表达GAP-43、nestin、NSE、NF.诱导后2,4,6,8 h GAP-43表达阳性率BME组为77.1%,83.4%,87.0%,82.5%,BDNF组:69.3%,78.1%,82.2%,86.8%.GAP-43随诱导分化时间增加而持续表达,两组间表达阳性率无统计学差异.结论 GAP-43在化学诱导剂及生长因子诱导BMSCs分化为神经样细胞过程中持续表达,对于骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化具有重要意义.     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞

背景:文献报道体外诱导骨髓间充质细胞定向分化为神经元样细胞多应用神经生长因子类多肽制剂,选择纯化学诱导剂尚不多见.目的:建立人骨髓间充质干细胞分离培养体系,体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.方法:密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合分离纯化人骨髓间充质干细胞并鉴定,采用B一巯基乙醇和二甲基亚砜诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态,通过尼氏染色、NSE和NF-200免疫细胞化学染色对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析.结果与结论:分离得到的骨髓间充质干细胞为成纤维样细胞,可见多个核仁,β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导后,间充质干细胞分化为神经元样细胞,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支,诱导后的神经元样细胞胞质中存在着深蓝色颗粒状的尼氏小体,NSE、NF-200免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,阳性率分别为(85.6±6.7)%和(73.2±5.6)%.结果证实采用密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合能够成功分离和培养人骨髓间充质干细胞,人骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和二甲基亚砜的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞.     

大鼠羊膜上皮细胞体外诱导可分化为类神经干细胞

背景：以往研究发现修复神经损伤的细胞来源主要有许旺细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞、激活的巨噬细胞等,但这些细胞存在着来源困难、有成瘤性、异体排斥等缺点.而羊膜上皮细胞不存在以上缺陷,且具有多向分化潜能,经诱导后可向心肌样细胞、神经干细胞、肝细胞、成骨和软骨细胞等分化.目的：体外培养大鼠羊膜上皮细胞,并诱导其向类神经干细胞方向分化.方法：取妊娠晚期大鼠,采用胰酶消化法获得羊膜上皮细胞,用无血清的神经干细胞条件培养基对细胞进行诱导分化,并用免疫细胞化学法和RT-PCR对诱导前后的细胞相关标志物进行鉴定.结果与结论：形态学观察结果显示,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,这些突起可交织成网状,细胞贴壁牢靠.免疫细胞化学检测结果显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白荧光强度较强,而特异性胚胎抗原4、波形蛋白荧光强度较弱.RT-PCR检测显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞的巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白 mRNA 的表达增强,而平滑肌22α、Sox-2及Nanog mRNA的表达减弱.说明体外诱导的大鼠羊膜上皮细胞可成功分化为类神经干细胞.     

神经节苷脂体外诱导骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨神经节苷脂体外诱导骨髓基质干细胞（BMSC）向神经元样细胞分化的可能性。方法分离培养人BMSC，采用含神经节苷脂的无血清培养基诱导BMSC的分化，免疫细胞化学方法鉴定诱导分化后细胞表面神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经丝蛋白（NF）的表达。结果神经节苷脂诱导培养6h后，细胞表现为典型神经细胞样形态，神经元特异性标志物NSE和NF呈阳性表达。结论神经节苷脂可在体外诱导人BMSC分化为神经元样细胞。     

人羊膜上皮细胞分泌神经营养因子诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化:可能性验证

背景:课题组前期实验已证实人羊膜上皮细胞条件培养液可以诱导人脐血间充质干细胞分化为多巴胺能神经元样细胞,在此过程中人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子及其受体可能起到了重要作用.目的:探讨人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子对人脐血间充质干细胞神经分化的作用.方法:将P1代人脐血间充质干细胞按2×10~8 L~(-1)密度接种,分为3组:对照组加入HG-DMEM培养基;诱导组加入人羊膜上皮细胞条件培养液;阻断剂组预先加入阻断剂K252a工作液,36 ℃孵育40 min后更换为羊膜上皮细胞条件培养液.免疫荧光化学检测诱导后人脐血间充质干细胞神经元特异性烯醇化酶及多巴胺转运体的表达,实时定量PCR法检测诱导后人脐血间充质干细胞中神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体及酪氨酸羟化酶的表达.结果与结论:人羊膜上清中有神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达,且P1代人脐血间充质干细胞表达神经营养因子高黏附性受体Trka及Trkb.诱导48 h后与对照组比较,诱导组及阻断剂组神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体阳性细胞数均明显增加(P < 0.05),且诱导组阳性细胞数最多(P < 0.05).诱导组、阻断剂组神经元特异性烯醇化酶、多巴胺转运体及酪氨酸羟化酶mRNA含量均显著高于对照组(P < 0.01),且诱导组各基因mRNA含量明显高于阻断剂组(P < 0.01).结果证实人羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子对人脐血间充质干细胞的神经分化有重要作用,其促神经分化作用是通过酪氨酸激酶受体介导的.     

复合诱导液诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化

目的:目前对脂肪基质细胞向神经元样细胞分化基本采用人工合成的化学诱导剂的方法进行诱导,其中部分组合试剂费用昂贵,不适合进行大规模基础和临床实验。因此以复合诱导液作替代,观察其能否在体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞方向分化。方法:实验于2004-10/2005-06在华北煤炭医学院中学实验室完成。①实验材料:腹部皮下的脂肪组织来源于30例自愿捐献者,年龄20～35岁,通过外科手术获得。复合诱导液的组成:alpha-MEM BHA(200μmol/L) KCl(5mmol/L) 丙戊酸钠(2μmol/L) IBMX(0.5mmol/L) 氢化可的松(1μmol/L) 胰岛素(5mg/L) 乙醇(0.5%) 青霉素(100U/mL) 链霉素(100mg/L)。②实验方法:离体的脂肪组织消化、离心、过滤,进行人脂肪基质细胞的原代培养。按8×103/cm2接种,消化传代。取第3代人脂肪基质细胞,接种到孔中预先放置无菌盖玻片的24孔培养板,细胞生长达50%～60%融合时,去除培养液,换为复合诱导液进行诱导;空白对照组培养液为DMEM/F12培养基。③实验评估:自加入诱导剂后在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态变化,应用免疫细胞化学方法检测神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白、神经细胞的特异性标志神经元特异性烯醇化酶及微管联合蛋白2、神经胶质细胞的特异性标志胶质纤维酸性蛋白的表达。结果:①体外培养过程人脂肪基质细胞的形态学观察:刚分离接种的细胞呈圆形,悬浮状态。接种24h内细胞大多已贴壁,呈梭形、圆形或多角形,有粗大突起,核居中,1～2个核仁。48h后贴壁细胞开始分裂增殖,多呈梭形。1周后细胞融合成单层,排列出现方向性,但有少量圆形及卵圆形细胞混杂生长。②复合诱导液诱导脂肪基质细胞向神经元样细胞分化的形态学观察:人脂肪基质细胞胞体回缩,呈圆形或锥形,胞体周围具有较强的光晕,胞体有突起伸展,具有典型的神经细胞样形态。空白对照组形态无变化。③免疫细胞化学检测神经元样细胞的特异性标志的表达:诱导5h后,人脂肪基质细胞神经巢蛋白阳性表达率为(21.8±2.6)%,神经元特异性烯醇化酶为(36.8±3.3)%,微管联合蛋白2为(92.0±10.5)%,胶质纤维酸性蛋白为(96.0±5.6)%。空白对照组细胞以上各指标表达均呈阴性。结论:复合诱导液可替代费用昂贵的人工合成的化学诱导剂,在体外成功诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.目的:研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性.方法:取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果与结论:人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性.结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

人羊膜上皮细胞静脉移植治疗大鼠心肌梗死

背景：人羊膜上皮细胞在体外适当诱导条件下可分化为心肌样细胞,可望成为细胞心肌成形术的种子细胞,但在心肌梗死原位是否能分化成心肌细胞值得探讨。目的：探讨人羊膜上皮细胞移植在心肌梗死原位的分化及对心肌梗死后心室重构和心功能的影响。方法：用胰酶消化分离人羊膜上皮细胞,行流式细胞仪检测和免疫组化染色以鉴定其表型特征。结扎SD大鼠左冠状动脉前降支以建立心肌梗死模型,实验分为人羊膜上皮细胞移植组、模型组及假手术组,人羊膜上皮细胞移植组于造模后1周经舌下静脉移植Brdu标记的人羊膜上皮细胞。移植后1,4,6周采用超声心动图检查心功能变化,应用苏木精-伊红和Masson染色观察心肌重构的变化,以免疫荧光双染色法检测人羊膜上皮细胞在心肌梗死区的植活与分化。结果与结论：①所分离的人羊膜上皮细胞表达CD29、CD166、CD73和CK19,不表达CD44、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR。②人羊膜上皮细胞移植后6周,心肌梗死区仍可见Brdu标记的阳性细胞,表达心肌特异蛋白连接蛋白43、α-辅肌动蛋白和结蛋白。③移植组大鼠左心室纤维化程度明显低于模型组。④移植组大鼠射血分数、左室短轴缩短率显著高于模型组（P〈0.01）;舒张期左室前壁厚度和收缩期左室前壁厚度也显著大于模型组（P〈0.05）。提示人羊膜上皮细胞在心肌梗死原位可分化为心肌细胞,可减缓心室重构并改善心脏功能。     

Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model

Human amniotic epithelial cells (hAECs), having the characteristics of both embryonic and pluripotent stem cells, have the potential to differentiate into various cells. A good deal of research has explored the clinical therapeutic potential of hAECs; rat amniotic epithelial cells have been reported to ameliorate functional deficits after stroke in rats, likely due to neuronal differentiation and cytokine secretion by these cells. We isolated hAECs and transfected them with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) or enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene using lentiviral vectors. These cells were then transplanted into the brains of rats subjected to a transient middle cerebral artery occlusion. The hAECs survived and migrated to the ischemic area of rats, and some of the transplanted hAECs expressed the neuronal marker MAP2 and the neuronal progenitor marker Nestin, together with the astrocyte marker glial fibrillary acidic protein, and hAEC-EGFP can significantly ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct volume of ischemic rats. By transfecting the cells with lentiviral vectors, GDNF can be stably overexpressed in hAECs, and hAEC-GDNF can more rapidly rescue the deficits of rats after middle cerebral artery occlusion compared with hAEC-EGFP-treated rats. Moreover, the nontransduced cells also had effects comparable to the GDNF-transduced cells on caspase-3 and lesion volume. Because hAECs are in unlimited supply, and their use is not encumbered by ethical arguments, hAECs have a great advantage for stem cell therapy. This model holds tremendous potential for development into wide use in cell-mediated gene therapy in the future.     

羊膜上皮细胞移植治疗脑缺血缺氧新生大鼠

背景:研究表明移植羊膜上皮细胞可改善神经功能,但其作用机制尚不清楚。目的:观察缺氧缺血对新生大鼠脑神经干细胞和神经颗粒素表达的影响,及羊膜上皮细胞移植后对其治疗作用。方法:建立缺氧缺血性脑损伤模型,46只SD大鼠随机抽签法分为3组,移植组和模型组缺血缺氧后经侧脑室分别注入1×1012L-1人羊膜上皮细胞悬液和PBS治疗;假手术组注射等量的生理盐水。结果与结论:移植组大鼠神经功能较模型组明显改善,移植后第3周脑切片检出NSE阳性细胞存在,神经颗粒素在第3周的表达模型组低于假手术组,移植组较模型组增加;而nestin结果显示模型组较假手术组增加,移植组较模型组增加。提示羊膜上皮细胞移植入脑缺血缺氧大鼠脑内后,可减轻缺氧缺血后神经元的损伤,改善神经功能,其机制可能是注射入侧脑室的细胞促进自体神经干细胞的增殖分化和突触再生而实现的。     

羊膜上皮细胞移植治疗脑缺血缺氧新生大鼠

背景：研究表明移植羊膜上皮细胞可改善神经功能,但其作用机制尚不清楚。目的：观察缺氧缺血对新生大鼠脑神经干细胞和神经颗粒素表达的影响,及羊膜上皮细胞移植后对其治疗作用。方法：建立缺氧缺血性脑损伤模型,46只SD大鼠随机抽签法分为3组,移植组和模型组缺血缺氧后经侧脑室分别注入1×1012L-1人羊膜上皮细胞悬液和PBS治疗;假手术组注射等量的生理盐水。结果与结论：移植组大鼠神经功能较模型组明显改善,移植后第3周脑切片检出NSE阳性细胞存在,神经颗粒素在第3周的表达模型组低于假手术组,移植组较模型组增加;而nestin结果显示模型组较假手术组增加,移植组较模型组增加。提示羊膜上皮细胞移植入脑缺血缺氧大鼠脑内后,可减轻缺氧缺血后神经元的损伤,改善神经功能,其机制可能是注射入侧脑室的细胞促进自体神经干细胞的增殖分化和突触再生而实现的。     

不同途径移植羊膜上皮细胞在肝脏的定居

背景：细胞移植对肝脏疾病具有一定的疗效,与肝脏移植相比有其自身的优点,但有诸多问题尚待解决。目的：探讨不同途径移植的人羊膜上皮细胞在肝脏内定居情况。方法：从剖腹产后的人胎盘羊膜中分离人羊膜上皮细胞,PKH26荧光标记后计数1×107细胞通过大鼠腹腔、门静脉、尾静脉及肝脏内直接注入方式移植入大鼠体内。结果与结论：门静脉、尾静脉及肝脏直接注入途径移植的细胞均在肝脏内定居,但移植细胞数过量时造成局部肝组织的缺血坏死等不良反应。腹腔途径移植入体内的细胞未转移肝脏内。通过门静脉移植入体内的人羊膜上皮细胞在大鼠肝脏内维持存活至少16d。移植细胞过量时,导致肝脏血管堵塞及坏死。证明人羊膜上皮细胞至少在大鼠肝脏中存活2周,提示低免疫原性的羊膜来源细胞可成为肝脏病治疗的候选细胞之一。