凝血酶对骨髓基质干细胞功能的影响

目的 探讨凝血酶对骨髓基质干细胞功能的影响.方法 小鼠骨髓基质干细胞取自于4周龄C57BL/6J小鼠双侧胫骨和股骨的新鲜骨髓,细胞增殖的检测采用5-溴-2-脱氧尿嘧啶嵌入测定试剂盒,细胞迁移的测定通过细胞计数法,细胞凋亡是根据4,6-二氨基-2-苯基吲哚所染细胞核形态的改变来辨认.结果 凝血酶可以促进骨髓基质干细胞剂量依赖性的增殖、抑制细胞的凋亡,但不影响细胞的迁移.结论 结果表明凝血酶对骨髓基质干细胞增殖和凋亡均有影响,这种影响可能有助于保障组织修复过程中所需的细胞的数量,这种功能可能是凝血酶在组织损伤修复过程中起保护作用.     

骨髓基质干细胞及其应用研究进展

骨髓基质干细胞(BMSCs)作为一种干细胞，由于具有很强的自我更新能力和多分化潜能，近年来引起了广泛的注意，体内外试验中已发现BMSCs可以分化为骨组织和软骨组织、神经组织等组织的细胞，并且具有修复以上各组织缺损的能力；同时发现BMSCs是一种理想的基因载体，从而达到基因治疗的目的。本文旨在对BMSCs的分离、培养、生物学特性、基因治疗及其组织修复中的应用研究进展作一综述。     

骨髓间质干细胞移植对椎间盘基质生化成分的影响

目的：研究骨髓间质干细胞移植对椎间盘基质生化成分的影响。方法：32只新西兰大白兔,L2～L3、L3～L4、L4～L5、L5～L6被随机分为正常对照组、生理盐水对照组、细胞移植组Ⅰ、细胞移植组Ⅱ（BMP2转基因组）。在1、3、6月时间点,用Ⅰ、Ⅱ型胶原单克隆免疫组化染色分析胶原表型的改变,用实时荧光PCR分析Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达,采用方差分析线型模型进行统计学分析。结果：术后1、3、6个月时间点,细胞移植组髓核有较多的细胞,蛋白多糖染色显示,细胞移植组髓核兰染增加,免疫组化显示Ⅰ型胶原实验各组未见明显差异,Ⅱ型胶原细胞移植组有较强的红染颗粒沉积。实时荧光PCR分析显示,在细胞移植组,蛋白多糖和Ⅱ胶原的表达增加,而Ⅰ型胶原表达则无改变。对于蛋白多糖和Ⅱ胶原的表达,与细胞移植组Ⅰ比较,细胞移植组Ⅱ表达增加。结论：骨髓间质干细胞移植能够提高髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量,复合BMP2转基因有“分子增强效应”,提示基于骨髓间质干细胞移植策略是治疗椎间盘退变潜在的有效方法。     

骨髓基质干细胞的研究进展

随着细胞治疗的发展,骨髓基质干细胞的基础和临床应用研究日益受到重视。本文对骨髓基质干细胞生物学特性、临床前期研究成果和面临的问题进行了综述。     

地塞米松对骨髓基质干细胞体外增殖的影响

目的 观察地塞米松对小鼠骨髓基质干细胞体外增殖的作用。方法 取雄性6周龄ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行体外培养，在细胞培养不同时间点加入10^-8mol／L地塞米松（实验组）或保持基础培养条件（对照组），用CellTiter方法分别检测两组的细胞增殖情况，并予比较。结果 在细胞培养不同阶段开始应用地塞米松的实验组中，细胞增殖能力较对照组降低，随着培养时间延长实验组细胞数量明显少于对照组。实验组中细胞形态较对照组更趋成熟。结论 地塞米松在促进骨髓干细胞定向分化早期抑制骨髓基质干细胞体外增殖。     

生长板软骨细胞对骨髓基质干细胞体外分化的影响

目的 观察大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在与大鼠生长板软骨细胞体外共培养条件下，BMSCs碱性磷酸酶(ALP)活性变化及成骨分化的标志骨钙素与Ⅰ型胶原mRNA水平表达的影响，从而认识生长板软骨细胞旁分泌作用对BMSCs分化的影响，以期帮助认识生长板损伤后骨桥形成的发生机制。方法 大鼠BMSCs在与生长板软骨细胞进行间接共培养，并设阴性对照。测定ALP活性．用RT-PCR方法，检测Ⅰ型胶原与骨钙素mRNA的表达。结果 BMSCs随共培养时间的延长，ALP活性明显升高，Ⅰ胶原mRNA表达丰度明显高于对照组，骨钙素mRNA在对照组中几乎未见PCR扩增产物，共培养组在终末期则有一定的表达。结论 BMSCs在与大鼠生长板软骨细胞体外共培养后，出现成骨分化倾向：随时间延长效应愈加显著，提示生长板软骨细胞的旁分泌作用可以促进BMSCs向成骨分化。     

菲立磁标记大鼠骨髓基质干细胞对其生物活性的影响

目的 观察菲立磁(Feridex)标记对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的增殖及向肝细胞分化能力的影响,探讨Feridex标记大鼠BMSCs的最佳标记方案.方法 SD大鼠BMSCs按Fefi-dex浓度11.2、14.0、16.8、19.6mg/L分组并进行标记,设空白对照组(无Feridex标记的BMSCs).采用普鲁士兰染色和透射电镜鉴定Feridex标记后各组BMSCs的标记效率.噻唑蓝(MTY)比色法检测Feridex标记后各组BMSCs的增殖水平.逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测Feridex标记后各组BMSCs经肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EGF)共同诱导后ALB和AFP基因的表达水平.结果 11.2、14.0、16.8、19.6 mg/L组的标记率分别为71%、83%、91%、96%.16.8 ms/L和19.6 mg/L组的标记率显著高于11.2 ms/L和14 mg/L组(P<0.05).11.2、14.0、16.8 mg/L组的细胞增殖水平及诱导后ALB、AFP基因表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),而19.6 mg/L组的细胞增殖水平及诱导后ALB、AFP基因表达水平显著低于空白对照组(P<0.05).结论 Fefidex浓度16.8mg/L可能是Feridex标记BMSCs最适标记浓度,该浓度既能使Fefidex对BMSCs的标记达到较理想效果,同时不影响BMSCs的增殖及向肝细胞分化的能力.     

成年恒河猴骨髓基质干细胞的体外培养

目的温对猴骨髓基质干细胞(BMSCs)进行体外培养及扩增，观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点。方法 抽取4只成年猴髂骨骨髓，用全骨髓培养法进行体外培养获得BMSCs，胰酶消化传代，用条件培养基培养传代细胞。逐日倒置显微镜观察细胞生长情况，对传代细胞进行HE染色及碱性磷酸酶(ALP)染色。结果 成年雄性恒河猴BMSCs体外培养生长良好，原代细胞10-13d汇成单层，传代后4～7d长满瓶底。HE染色光镜下观察见BMSCs为单核细胞，细胞呈梭形、多角形，传代细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。结论 猴BMSc的体外培养增殖能力强，可诱导为成骨细胞，可作为灵长类动物骨组织工程的种子细胞。     

脂肪来源与骨髓来源的基质干细胞的比较

目的 比较脂肪基质干细胞（ASC）与骨髓基质干细胞（MSC），为ASC的细胞移植治疗提供实验依据。方法 分离培养脂肪组织来源的ASC、分离培养骨髓组织来源的MSC，培养至14d时，对贴壁细胞再次计数，当细胞融合达到80％时，胰蛋白酶消化传代培养，取第3～4代细胞进行分析。观察培养前后两种细胞的形态并计数，流式细胞仪分析两种细胞的表面抗原表达，混合淋巴细胞反应及淋巴细胞转化实验比较两种细胞的免疫原性。结果 ASC与MSC细胞表面抗原表达基本相似，但也存在差别，ASC为CD49d^＋CD106^-，而MSC为CD49d^-CD106^＋。ASC与MSC都能抑制淋巴细胞增殖，且这种抑制作用与其数量呈正相关。但相同数量的ASC和MSC对淋巴细胞的抑制作用无明显差别。结论 ASC和MSC在细胞表面抗原、免疫原性等方面相似，这为进一步利用ASC移植治疗疾病的研究提供了依据。     

供者骨髓基质干细胞输注延长大鼠移植心存活时间的探讨

目的 探讨供者骨髓基质干细胞(MSC)输注在大鼠同种心脏移植术后的免疫调节及延长移植心存活时间的作用.方法 供者为近交系Wistar大鼠,受者为Fisher 344大鼠.处死供者后抽取其股骨和胫骨中骨髓,分离和培养MSC.通过混合淋巴细胞试验观察不同密度的MSC对异源性T淋巴细胞增殖反应的抑制作用.建立大鼠异位心脏移植模型,根据处理方式的不同,将受者分为MSC输注组和对照组,每组8只.Msc输注组:将含有2×106个MSC的林格氏液分别于术前1周、术中及术后连续3 d经尾静脉注入受者体内;对照组:用与MSC输注组相同的方法在相同时间点注入不含MSC的林格氏液.术后第5天,采用实时逆转录聚合酶链反应检测移植心组织中细胞因子的表达情况.结果 供者MSC可明显抑制异源性T淋巴细胞的增殖反应,且MsC密度越高抑制作用越强.MSC输注组Th1类细胞因子白细胞介素(IL)-1β和γ干扰素的表达要显著低于对照组;MSC输注组Th2类细胞冈子IL-4和IL-10呈高表达,而对照组基本不表达.MSC输注组移植心平均存活时间为(12.4±5.3)d,与对照组的(6.4±2.0)d比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 输注供者MSC可通过改变Th1/Th2类细胞因子的平衡向Th2偏移诱导受者产生免疫调节作用,从而延长移植心存活时间.     

Effects of mechanical strain on oxygen free radical system in bone marrow mesenchymal stem cells from children

Background

Physiological loading is widely believed to be beneficial in maintaining skeletal integrity by stimulating new bone formation through increases in osteoblastic activity and concomitant decreases in osteoclastic activity. However, excessive or nonphysiological loading is associated with bone injuries, including stress fractures and osteoporotic fractures, thereby leading to a decreased functional capacity of bone. It is known that the excessive generation of reactive oxygen species (ROS) is a significant factor underlying tissue injury observed in many disease states. The aim of this study was to study the effects of mechanical strain on oxygen free radical system [ROS, superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA)] in bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) from children.

Methods

To determine whether extreme levels of mechanical strain enhance ROS synthesis, we loaded cyclic tensile stretch of varying magnitude on MSCs. After MSCs were stimulated by mechanical strain, ROS labelled with 2,7-dichlorodihydrofluorescein (DCFH) fluorescent probe in cells were detected by flow cytometry (FCM) whilst SOD activity and MDA level were detected by xanthine oxidase method and thiobarbituric acid method, respectively.

Results

Extreme levels (>12%) of mechanical strain applied to children's MSCs enhanced ROS synthesis, decreased the activity of SOD and increased the level of MDA, in a time- and magnitude-dependent fashion.

Conclusions

These data suggest that excessive magnitude of cyclic tensile strain (>12%) could induce oxygen free radical disequilibrium, resulting in cytotoxicity. The findings may have clinical implications for orthopaedic practice.     

Effects of mechanical strain on proliferation and differentiation of bone marrow stromal cell line ST2

Differentiation of mesenchymal stromal cells into osteoblasts is regulated by many factors including growth factors, cytokines, and hormones. Mechanical stress has been considered to be an important factor in bone modeling and remodeling. However, biological responses of stromal cells to mechanical stimuli are still unknown. To show the correlation between magnitude of mechanical strain and differentiation of stromal cells into osteoblasts, we investigated the proliferation and the expression of osteoblast-related genes in stromal cell line ST2 that is in the process of osteoblastic differentiation by treatment with ascorbic acid and -glycerophosphate, under 0.8%–15% elongation using the Flexercell Strain system. The expression of osteoblast-related genes was analyzed by real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR). Cell proliferation significantly increased at 5%, 10%, and 15% elongation compared to that of unloaded controls. Alkaline phosphatase (ALPase) activity significantly increased at 0.8% and 5% elongation but decreased at 10% and 15% elongation. At 1h and 6h, mRNA level of Cbfa1/Runx2 increased at lower magnitudes of strain (0.8% and 5% elongation) but decreased at higher magnitude of strain (15% elongation). At 24 and 48h, Cbfa1/Runx2 and osteocalcin mRNAs decreased at 5%, 10%, and 15% elongation, whereas cell proliferation and expression of type I collagen mRNA increased at the same elongation. These results indicate that mechanical strain stimulates osteoblastic differentiation of stromal cells at low magnitudes of strain.     

Effects of bone marrow stromal cells and umbilical cord blood-derived stromal cells on daunorubicin-resistant residual Jurkat cells

Objective

To observe the effects of the hematopoietic inductive microenvironment (HIM) simulated by stromal cells of different origins on daunorubicin-resistant residual Jurkat cells (Jurkat/DNR cells).

Methods

Jurkat/DNR cells were cultured and identified. Human umbilical cord blood-derived stromal cells (UCBDSCs) and normal human bone marrow stromal cells (BMSCs) were isolated and cocultured with Jurkat/DNR cells. Jurkat/DNR cells were collected after 14 days of coculture and analyzed with regard to cell proliferation and differentiation abilities, apoptosis, drug sensitivity, and MRD1 multidrug resistance gene mRNA expression.

Results

UCBDSC-simulated HIM suppressed proliferation and promoted apoptosis, differentiation, and drug sensitivity of Jurkat/DNR cells more significantly than BMSC-simulated HIM.

Conclusions

Both BMSCs and UCBDSCs reconstruct the leukemic HIM and reverse drug resistance in Jurkat/DNR cells. UCBDSCs reconstruct the leukemic HIM and reverse drug resistance more significantly than BMSCs.     

WNT激活剂对人骨髓基质干细胞成脂-成骨分化的影响

目的 观察WNT信号通路激活剂SB-216763对于人骨髓基质于细胞(hBMSCs)成脂-成骨分化的影响.方法 从3例临床股骨头标本中分离培养hBMSCs与5μmol/L SB-216763共同培养,观察hBMSCs表达β-连锁蛋白(β-catenin)的变化,检测hBMSCs增殖能力、成脂分化能力和成骨细胞诱导分化时碱性磷酸酶(ALP)活性的变化.结果 SB-216763可以显著促进hBMSCs表达β-catenin (30.2±2.7比13.3±2.1,P＜0.01)、促进hBMSCs增殖(P＜0.01)、抑制hBMSCs向脂肪细胞分化[油红O(Oil Red-O)阳性细胞数:27.4±3.2比8.4±2.1,P＜0.01]、降低hBMSCs的ALP活性(P＜0.01).结论 激活WNT信号通路可以促进hBMSCs的增殖,抑制hBMSCs向脂肪细胞分化并且抑制hBMSCs的成骨活性.     

地塞米松在人骨髓基质细胞诱导成骨细胞中的作用

目的 通过对人骨髓基质细胞体外培养及检测，研究地塞米松在骨髓基质细胞体外增生并向成骨细胞定向分化过程中的应用。方 法骨折内固定术扩髓前收集髓腔内骨髓进行原代和传代培养，传代后改用条件培养基（含地塞米松）和基础培养基（不含地塞米松）分别进行培养，应用组织化学及von Kossa方法检测细胞碱性磷酸酶和细胞外基质矿化程度；半定量RT-PCR方法检测Cbfal mRNA和Osterix mRNA在细胞培养过程中不同时间点的表达。并观测地塞米松对上述成骨细胞相关基因表达的影响。结果 条件培养基组细胞Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达峰值高于基础培养基组细胞，并且峰值出现的时间提前。结论 地塞米松通过促进Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达而促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。     

共培养条件下骨髓基质细胞与嗅鞘细胞的相互作用

[目的]研究骨髓基质细胞与嗅鞘细胞共培养条件下,两种细胞之间的相互作用,为进一步行细胞联合体内移植提供理论基础。[方法]取大鼠骨髓基质细胞和嗅鞘细胞进行分离培养纯化及鉴定,将纯化后的骨髓基质细胞和嗅鞘细胞共培养,对共培养细胞进行形态学观察,检测间充质干细胞标记物Vimentin、NGF受体标记物P75、神经干细胞标记物Nestin。[结果]共培养部分细胞形态上具有神经细胞特征;经免疫荧光观察一部分细胞呈p75阳性,另一部分细胞呈Vimentin阳性,它们呈条索状包绕p75阳性细胞,细胞簇中央的细胞呈Nestin阳性。[结论]骨髓基质细胞和嗅鞘细胞能在体外共同存活、生长,且通过细胞的相互作用,能激活BMSCs向神经元样细胞分化的潜力,提示借助于细胞间的相互作用,采取恰当的细胞联合移植干预有可能弥补单一细胞类型自身的不足,这为BMSCs和OECs体内联合移植的可行性提供了理论依据。     

Osteogenic stem cells and the stromal system of bone and marrow

According to current hypothesis, cells of the osteogenic lineage, which includes both osteoblasts and chondroblasts, are derived from a stromal stem cell in the postnatal organism. That there exist osteogenic precursors in association with the soft, fibrous tissue of the marrow stroma is well established. An osteogenic tissue comprised of cartilage and bone is formed when marrow or marrow cell suspensions are cultured in vivo within diffusion chambers. Bone with a functional marrow organ is formed when marrow or marrow cell suspensions are transplanted heterotopically, e.g., under the renal capsule. Cultures of marrow stromal fibroblasts are readily established in vitro from single-cell bone marrow suspensions. Such cultures do not demonstrate overt differentiation in an osteogenic direction in vitro. When transplanted in vivo, however, they differentiate to form cartilage and bone in diffusion chambers and bone with a functional marrow organ when transplanted heterotopically. Single-cell bone marrow suspensions can be cultured in vitro under conditions that facilitate the formation of stromal fibroblast colonies. Circumstantial evidence supports the conclusion that each colony is derived from a single initiating cell termed a colony-forming unit-fibroblastic (CFU-F). A proportion of CFU-F demonstrates extensive proliferative potential both in vitro and in vivo. In vitro the extensive proliferative potential of a subset of CFU-F has been shown to be associated with a capacity for extensive self-renewal. On transplantation in vivo, the progeny of a proportion of CFU-F has been shown to be capable of proliferating and differentiating into all the stromal cell lines necessary for the formation of bone and reconstitution of the hematopoietic inductive microenvironment. These findings provide strong circumstantial evidence to support the hypothesis that there are stem cells present within the marrow stroma that are capable of giving rise to cells of a number of different lineages, including those of the osteogenic lineage (chondroblasts and osteoblasts).     

维拉帕米在应力对体外骨髓间充质干细胞早期反应基因蛋白表达中作用的研究

[目的]研究维拉帕米(Verapamil)在周期性牵张应力对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)早期反应基因蛋白表达中的作用,从而进一步推断出Ca2+ 通道在细胞响应力学的信号传导途径中的作用.[方法]分离并培养骨髓间充质干细胞,利用体外细胞牵张应力装置对第3～6代细胞加载力学信号,在应力干预细胞前加及不加钙离子拮抗剂(维拉帕米),受力结束后,流式细胞术检测细胞内钙离子荧光强度,用RT-PCR以及免疫组化的方法检测各组细胞内c-fos、c-jun和c-myc基因蛋白表达的情况.[结果]加载力学信号后,细胞内钙离子浓度发生改变,c-fos、c-jun和c-myc基因蛋白的表达明显增强(P<0.01),经维拉帕米预处理后,以上生物学效应受到抑制(P<0.01).[结论]在牵张应力作用下骨髓间充质干细胞Ca2+内流发生了变化,并且这种变化在骨髓间充质干细胞对周期性牵张应力的早期应答反应中起到了部分作用,可能依赖钙离子通道的活化来调控.     

骨髓基质细胞向神经细胞分化研究进展

自2000年美国《科学》杂志首次报道来源于骨髓的细胞进入脑并表达神经表型以来,在动物模型上进行的骨髓基质细胞移植模拟治疗中风、脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化及帕金森病等的研究均显示有一定的疗效.近年来体外诱导骨髓基质细胞向神经系细胞分化的研究颇多,其中涉及到多种生物技术.该文就化合物诱导及潜在问题、蛋白及基因转染问题、骨髓基质细胞与神经细胞共培养等研究作一综述.     

微管仿生人工骨对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

[目的]研究不同微管结构仿生人T骨对犬骨髓基质细胞（BMSCs）增殖和分化的影响。[方法]仿生人工骨分为正交结构（A组）和同心结构（B组），以磷酸钙骨水泥（CPC）／重组人骨形成蛋白2（rhBMP-2）（C组）、单纯CPC（D组）为对照组：梯度密度离心法获取犬骨髓单个核细胞，取第3代与人工骨复合培养。通过荧光显微镜、扫描电镜观察细胞在人工骨表面附壁和生长情况；以MTT实验检测各组细胞增殖能力；测定碱性磷酸酶（ALP）检测BMSCs的成骨活性：[结果]细胞在各组人工骨表面黏附、生长，以A、B组数量较多；MTT法检测显示A、B、C组吸光度（A）值大于D组（P〈0．05）、A、B、C组A值相似（P〉0．05）；ALP测定显示ALP活性A、B组〉C组〉D组（P〈0．05），A、B组间差异无统计学意义（P〉0．05）。[结论]微管结构仿生人工骨与犬BMSCs有良好的生物相容性，是BMP的良好缓释载体，可以促进犬骨髓基质细胞向成骨方向分化.