Br.ovis死菌佐剂苗的制备及保护力试验

本文报告了用新疆0.19Br.ovis株制备的死菌佐剂苗,并对其免疫学改造进行了检查。用30只中国美利奴8月龄公羔,分两个不同剂量免疫组和对照组,每组10只,第一组皮下注射1000亿菌,第二组皮下注射4000亿菌。85天时分别加强免疫,用原制剂1000亿菌/ml皮下注射。第三组不免疫,以资对照。 各组于325天时分别进行结膜+包皮30亿菌和睾丸内接种15亿菌63/290Br.ovis直接注射攻毒。在攻毒后75天参试羊全部屠杀并剖检,同时采血样进行GDT、SAT、CFT试验和细菌培养及病理学检查。试验结果表明,用新疆019Br.ovis制备的死菌佐剂苗免疫绵羊,保护力达75％。此苗安全有效,使用方便,可用于Br.ovis病的防治。     

绵羊副睾种布鲁氏菌的分离方法研究

本文报告了绵羊副睾种布鲁氏菌的分离培养,作者推荐选择性培养基Ⅱ,即在改良赫金格尔琼脂(含有10％溶血的马或牛血清)和10％的马血清胰琼脂中,分别加入最终浓度为多粘菌素6u/ml,万古霉素5μg/ml,呋喃旦喧钠10μg/ml,二性霉素1.0μm/ml。此培养基可作为Br.ovis及其它多种布鲁氏菌的分离培养基。     

布鲁杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的 建立一种环介导等温扩增(LAMP)快速检测动物布鲁杆菌的方法.方法 使用Primer 4.0,针对布鲁杆菌外膜蛋白(OMP31)基因保守区设计4条特异引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,实现DNA的梯状等温扩增,并在此方法最适扩增条件优化的基础上,对其特异性、灵敏度进行实验,同时与普通PCR灵敏度进行比较,以及进行LAMP可视化实验.结果 本研究建立的检测方法对牛种布鲁杆菌(Brucella abortus,B.abortus)544A和104M、羊种布鲁杆菌(Brucella melitensis,B.melitensis)Rev-1和16M、猪种布鲁杆菌(Brucella suis,B.suis)S2和1330S、犬种布鲁杆菌(Brucellac anis,B.canis)RM6/66、绵羊附睾种布鲁杆菌(Brucela ovis,B.ovis)63/290、沙林鼠种布鲁杆菌(Brucella neotomae,B.neotomae)5K33检测阳性,而耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica,Y.enterocolitica)O∶9、大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)O157∶H7和沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimunum)47729检测阴性.LAMP法检出最低DNA浓度为8.5×10-8 mg/L,较普通PCR检测灵敏度高.检测结果既可以通过电泳判定也可以通过可视化判定.结论 本研究所建立的布鲁杆菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁杆菌的快速检测.     

不可分型流感嗜血杆菌OMP6优势T-B联合抗原表位及其免疫原性研究

目的了解无荚膜不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)临床菌株P6外膜蛋白(OMP6)编码基因(omp6)分布及其序列保守性,筛选并鉴定OMP6序列中优势T和B细胞(T-B)联合抗原表位及其免疫原性。方法采用PCR扩增NTHi临床菌株全长omp6基因,T-A克隆后测序。采用生物信息学软件分析OMP6序列保守性与膜定位并预测其T-B联合抗原表位。采用噬菌体展示联合免疫印迹法和ELISA分别检测重组噬菌体PIII蛋白(rPIII)展示的OMP6中T-B联合抗原表位肽免疫原性和免疫反应性。结果 35株NTHi临床菌株均能检出omp6基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.3%~100%和99.3%~100%。OMP6为外膜表面蛋白,具有OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126三个预测T-B联合抗原表位。Western Blot和ELISA结果显示,OMP6-2-25能与NTHi抗血清产生较强的杂交条带,96.9%(59/62)、69.4%(43/62)和74.2%(46/62)NTHi感染患儿血清标本OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126抗原表位肽抗体阳性。结论 OMP6是分布广泛且序列保守的NTHi跨膜蛋白,OMP6-2-25为OMP6优势T-B联合抗原表位,可作为NTHi多抗原肽疫苗的候选表位。     

空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位分析及功能鉴定

目的 从生物信息学角度了解空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的跨膜结构、B细胞抗原表位及其抗原性、基因序列保守性等特征,并鉴定空肠弯曲菌主要外膜蛋白优势B细胞抗原表位,为后续抗体检测和疫苗研究提供实验依据。方法 使用NCBI/Blast,TMHMM Server V2.0,DNA Star等生物信息学分析软件对空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18进行蛋白跨膜结构预测、线性B细胞抗原表位及其抗原性分析、并对不同空肠弯曲菌OMP18蛋白的氨基酸序列同源性进行比较。采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗,基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行筛选鉴定。结果 生物信息学预测结果表明外膜蛋白OMP18定位于空肠弯曲菌外膜且不存在跨膜结构。蛋白序列保守存在于各空肠弯曲菌株中,序列同源性达95%以上。同时,我们发现该外膜蛋白中存在3个明显的B细胞线性表位,且具有很强的抗原性。ELISA检测鉴定结果表明3个B细胞抗原表位都能有效识别空肠弯曲菌全菌抗体。结论 空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18保守存在于细菌表面,存在3个重要的B细胞线性抗原表位,可用于后续的抗体检测和疫苗开发研究。     

新疆绵羊种在鲁氏菌病的研究

本文报告了1981年以来中国新疆地区绵羊种布鲁氏菌病的研究资料。检测18个地区县种羊场的1878只中国美利奴种公羊,绵羊种布鲁氏菌病血检阳性率21.2％,临床检查附睾炎12.5％。不孕母羊的感染率高于周岁公羊及其它绵羊群,约有20％的母羊不孕是由于Br.ovis感染所致。母羊及其羔羊血检双阳性率为3.7％,母羊阳性其羔羊阴性者是12.27％。种公羊病变部位多以单侧附睾炎和睾丸附睾尾粘连间隙消失为主,病变随绵羊的年龄而增多,尤其是4岁以上的种公羊。精液检查pH在6.6以上者多带菌,且炎症细胞和畸型精子较多。在绵羊种布鲁氏菌病高发疫区从94名变态反应阳性者中发现绵羊种布鲁氏菌病血检阳性9人,其中3人有附睾尾部豆状小结节。他们是兽医或常年与传染源密切接触者。R型和S型布鲁氏菌病的调查结果表明二者呈明显负相关。病原菌常规生化鉴定看到大多培养物无需CO_2可生长,不同地区的分离物在凝集原性,硫磺、碱性复红,尿素酶活性上有明显差异,提示存在不同生物型的可能性。病原回归试验看到了和自然发病一样的病理学变化和Br.ovis对绵羊生殖系的高亲和性。血清学诊断方法研究表明新疆地方菌株有着良好的抗原性,在9种试验中GDT,CFT和SAT诊断方法可靠,有良好的特异性和可重复性,易于在基层推广应用。用地方菌株制备的     

不同种布鲁氏菌膜蛋白抗原与布鲁氏菌感染豚鼠血清的ELISA试验

<正> 有关布鲁氏菌膜蛋白(OMP)的研究,近几年引起国内外学者的关注,国内武素怀(1991)曾报道有关外膜蛋白的电泳图谱特点,但采用布鲁氏菌OMP为抗原检测相应抗体的报道并不多见。针对上述情况,我们用S型及R型布鲁氏菌OMP为抗原,检测不同种布鲁氏菌感染动物的抗体反应,同时观察其用于鉴别Y·e O:9感染的可能性。     

荧光定量PCR方法应用于布鲁杆菌检测研究概述

布鲁杆菌病(简称布病)是布鲁杆菌属细菌侵入机体后引起人或动物多个器官系统发生病理损伤的人兽共患传染病.根据宿主倾向性和危害性,布鲁杆菌主要分为马耳他布鲁杆菌(B.melitensis)、流产布鲁杆菌(B.abortus)、猪布鲁杆菌(B.suis)、绵羊附睾布鲁杆菌(B.ovis)、犬布鲁杆菌(B.canis)和沙林鼠布鲁杆菌(B.neotomae)6个菌种.     

布鲁氏菌病快速检测试纸条的探索

目的 建立一种操作简单、结果肉眼可视,并具有良好敏感性和特异性的适合现场快速检测布鲁氏菌病的胶体金层析方法。方法 将重组的布鲁氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28作为胶体金标记物,抗OMP22单克隆抗体作为质控线,OMP22和OMP28蛋白作为检测线组装试纸条。结果 该试纸条检测牛布鲁氏菌标准阳性血清最大稀释度可达1:128;并且与牛结核、蓝舌病、牛病毒性腹泻、口蹄疫、牛白血病及小反刍兽疫血清无交叉反应;检测牛、羊源血清样品结果与商品化的ELISA检测试剂盒(IDEXX)符合率为95%,与虎红平板凝集试验(RBPT)检测的符合率为97.4%。结论 胶体金层析试纸条在检测布鲁氏菌病方面具有快速、敏感性高及特异性强的特点,适用于布鲁氏菌病动态流行病学调查和临床快速筛查。     

布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法的建立及免疫原性评估

目的 建立布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法,评价OMP10在小鼠体内的免疫效果。方法 本研究表达和纯化了布鲁氏菌外膜蛋白OMP10,通过Western Blot进行验证,建立了OMP10间接ELISA检测方法,然后将OMP10与弗氏佐剂和LDH佐剂配伍成2种亚单位疫苗,免疫小鼠后检测抗体水平、脾脏淋巴细胞的增殖水平、CD4⁺和CD8⁺T细胞比值以及细胞因子分泌,最后通过攻毒试验评估OMP10的免疫保护效果。结果 OMP10作为诊断抗原的特异性和符合率均高于70%;免疫小鼠后2种亚单位疫苗均能产生高滴度的IgG抗体,CD4⁺/CD8⁺T的比值均高于PBS对照组,IFN-γ高于PBS对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),但IL-4未发生明显变化,表明OMP10能够诱导很好的体液免疫及Th1型免疫应答。免疫保护结果显示,2种亚单位疫苗免疫组小鼠脾脏指数和脾脏载菌量低于布鲁氏菌M5感染组,差异具有统计学意义(P<0.01),表明OMP10蛋白配伍的亚单位疫苗对布鲁氏菌M5感...     

羊布鲁杆菌脂蛋白OMP19单克隆抗体制备与鉴定

目的 制备与鉴定羊布鲁杆菌脂蛋白OMP19单克隆抗体,用于布菌感染免疫机制研究。方法 将OMP19基因连接入pET-30a(+)表达载体中,构建pET-30a(+)/OMP19质粒,转化入大肠埃希氏菌BL21(E3),以不同浓度异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用镍金属螯合亲和层析(NI-NTA)纯化;以布菌阳性血清检测重组蛋白免疫反应性,并利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,以天然OMP19蛋白及布菌外膜蛋白提取物(NMP)对制备的单克隆抗体进行Western Blot及酶免疫染色试验(IEST)鉴定。结果 表达了OMP19蛋白,分子量约19 kDa,通过纯化纯度可达95%,Western Blot分析显示蛋白具有良好的抗原性,并制备了OMP19抗原23株鼠源性单克隆抗体,鉴定结果 显示22(95.65%)株能与天然OMP19蛋白反应,18(78.26%)株能与NMP反应,其中IgG1(k)亚型占91.30%;4株能与羊种布鲁氏菌菌涂片反应。结论 成功制备具有良好抗原性的重组OMP19蛋白,筛选出识别天然蛋白的单克隆抗体,已初步应用于布菌的检测,为OMP19抗原B细胞表位的筛选奠定基础。     

金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药机制的初步研究

目的了解金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药机制。方法按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)标准,应用琼脂平板稀释法及MRSA特异性基因mecA的扩增鉴定MRSA,诱导产生万古霉素耐药株,然后以超声破碎法提取外膜蛋白(OMP),经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析OMP的成分,分光光度法扫描仪测定相关膜蛋白的相对含量。结果耐万古霉素金葡菌菌株中,分子量为45KD和14KD的膜蛋白的相对含量较金葡菌ATCC25923株和对万古霉素敏感的MRSA少。结论提示45KD和14KD膜蛋白减少或缺失与金葡菌对万古霉素耐药可能有密切关系。     

莱姆病的防治现状

莱姆病是包柔氏螺旋体(Borrelia burgdorferi,BB)引起的多系统疾病.经蜱传播.以游走性红斑(ECM)、心脏及神经系统并发症为特征.本文将该病的防治现状作一简述. 病原及流行病学 1929年以来,美苏等国学者曾多次描述过慢性ECM和多发性神经炎,但均不清楚这些皮肤病灶就是莱姆病的特殊表现.直到1981年Burdorfer才发现本病是由结构与梅毒螺旋体相似的BB引起.目前发现引起本病的BB有二种,即欧洲株和北美株.BB标准株在透射电镜和免疫电镜下可见清晰的胞浆柱、外膜、表膜和鞭毛.外膜包绕胞浆柱,鞭毛位于外膜和胞浆柱之间.不同地区,不同来源的BB株在形态、长度、鞭毛数目及表膜抗原决定簇不尽相同.我国分离株(HL-86003)形态及免疫反应与BB株标准相似,但毒力稍强.     

布鲁氏菌bp26和OMP10基因的原核表达和鉴定

目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的表达、克隆与测序,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP10和bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-4T-1/bp26,在大肠杆菌中将该蛋白表达。用western-blot分析重组表达的GST-OMP10和GST-bp26的免疫学特性。结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-4T-1/bp26原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了OMP10和bp26基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。结论布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的成功表达,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。     

人用布鲁氏菌组分苗的实验研究——ⅡE和DMP组分安全性及其亚单位的免疫原性的观察

本文报告了在小鼠和豚鼠中用B.melitensis 16M的E、OMP及其组分的安全性、免疫反应性和保护力的研究。其结果表明,E、OMP及其亚组分免疫小鼠后对ip和s.c攻击强毒布氏菌均具有保护力;E、OMP免疫豚鼠后血清学反应低,致敏原性弱,细胞免疫反应良好。E、OMP免疫小鼠后的病理组织学反应低于104M组。     

布鲁杆菌外膜蛋白OMP31和bp26基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并测序中国布鲁杆菌外膜蛋白基因OMP31和bp26,重组表达OMP31和bp26蛋白, 并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁杆菌基因组中获得OMP31和bp26基因,连接入PMD18-T克隆质粒并测序。测序后分别克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,在大肠埃希菌中表达融合蛋白。用Western-blot技术分析重组表达的GST-OMP31和GST-bp26的免疫学特性。结果 OMP31和bp26基因的测序结果与 GeneBank中已报道的布鲁杆菌株完全一致,并在大肠埃希菌中成功表达了GST-OMP31和GST-bp26融合蛋白。布鲁杆菌免疫兔血清能特异性识别所表达的蛋白而不与载体蛋白发生反应。结论成功表达了布鲁杆菌外膜蛋白OMP31和bp26,它可以被布鲁杆菌免疫血清特异性识别,表现出良好的抗原性,为之后的实验室诊断和亚单位疫苗的研究打下良好的物质基础。     

恒河猴人工感染Brucella后血清学应答及血液病原培养

选用健康公恒河猴6只每组2只，以Br.ovis进行1、0.1、0.01亿菌初感染后35天，分别再以10、5、1亿菌重复感染。各组分别在初感染15天，再感染0.5、1、2、3、6、8、10个月时测定血清中各种抗体。     

幽门螺杆菌47kDa微孔蛋白基因的克隆表达及特性鉴定

目的对人幽门螺杆菌(H.pylori)编码47kDa外膜微孔蛋白基因omp47克隆表达及特性鉴定,探索研制H.pylori疫苗的新途径。方法培养和收集H.pylori标准菌株NTTC11637及临床菌株,采用酚∶氯仿抽提、纯化基因组DNA。设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增omp47基因片断。将目的基因和与克隆载体PGEM-T连接后,转化至E.coli DH5α及BL21,碱裂解提取质粒经BamHI和XhoI双酶切鉴定并进行序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达后,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定、镍亲和层析纯化检测抗原活性。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片断为1284bp,编码427个氨基酸。与GenBank公布的H.pylori标准株26695、43504及J99序列比对,核苷酸同源性高达94%~96%,编码氨基酸同源性96%~99%。经SDS-PAGE检测,电泳图谱上显示一条相对分子量为47kda的新生蛋白带。Western blot检测表明重组蛋白有较好的抗原性。结论成功克隆了外膜微孔蛋白OMP47的编码基因,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

猪种布鲁氏菌病防治研究进展

布鲁氏菌病(简称布病)是一种人畜共患的传染病,全世界有160个国家和地区存在人畜布病,分布在亚洲、非洲、欧洲、大洋洲和拉丁美洲。布鲁氏菌属包括6个生物种19个生物型。羊种布氏菌(B.militensis)3个生物型,牛种布氏菌(B.abortus)8个生物型,猪种布氏菌(B.suis)5个生物型,犬种布氏菌(B.canis)、绵羊附睾种布氏菌(B.ovis)和沙林鼠种布氏菌(B.neotomae)各1个生物型。我国除沙林鼠种布氏菌外,有5种12个生物型布氏菌存在和流行,以羊种布氏菌流行最严重,疫区面广,其次为牛种布氏菌和猪种布氏菌。80年代由于羊种菌引起布病逐步控制,牛种菌引起布病有相对增多趋势。     

重组布氏杆菌BP26蛋白和OMP31蛋白作为间接ELISA诊断抗原的研究

目的 传统布氏杆菌病血清学方法因其抗原构成复杂，存在较严重的交叉免疫反应性，导致结果判定困难。BP26及OMP31分别为布氏杆菌细胞周质蛋白及外膜蛋白，在感染牛、绵羊、山羊、犬和人类均为优势免疫原，且在抗原性上具有较好的布氏杆菌种属特异性。方法 以大肠杆菌表达、纯化的BP26和OMP31重组蛋白为包被抗原，初步建立了检测血清特异抗体的间接ELISA方法，并以现地牛布氏杆菌普查检测血清100份为样本，与传统的试管凝集试验进行了比较研究。结果 试管凝集试验血清样本阳性率为15％（15／100）；BP26包被抗原ELISA检测判为阳性的12个样本中有11为试管凝集反应阳性，相对阳性率为73．3％，二者阳性符合率为92％（11／12）；而采用OMP31为包被抗原，阳性检出率为0（图5）。结论 被检测区域阳性牛主要感染布氏杆菌为牛种布氏杆菌（B．abortus天然缺失0MP31基因）；BP26作为间接ELISA包被抗原用于牛布氏杆菌血清学检测具有良好的特异性及较好的敏感性。